Medios de cultivo para microorganismos

1. Cultivo y conservación
de microorganismos

2.  Medios de Cultivo
 Técnicas de aislamiento
 Condiciones de Incubación
 Clasificación de los Microorganismos (de
acuerdo a las condiciones de oxígeno)
 Técnicas de Cultivo
 Métodos de Conservación
Cultivo y conservación de
microorganismos

3. CÉLULAS
PROCARIOTA EUCARIOTA

4. Medios de Cultivo
 Composición química de una célula procariótica
Molécula Peso seco
(%)b
Moléculas por
célula
Clases
diferentes
Total de macromoléculas
Proteínas
Polisacáridos
Lípidos
DNA
RNA
Total de monómeros
Aminoácidos y precursores
Azúcares y precursores
Nucleótidos y precursores
Iones inorgánicos
96.0
55.0
5.0
9.1
3.1
20.5
3.0
0.5
2
0.5
1
24,610,000
2,350,000
4,300
22,000,000
2.1
255,500
~2,500
1,850
2c
4d
1
~650
~350
~100
~50
~200
18
Total 100

5. Medios de Cultivo
 Composición de una célula
- Agua (70-85%)
- Sólidos (15-30%)
a) Proteínas
b) Ácidos Nucleicos (DNA, RNA)
c) Lípidos
d) Carbohidratos
e) Otros

6. Medios de Cultivo
Composición de los Microorganismos
 Elementos principales:
- Carbono
- Oxígeno
- Hidrógeno
- Nitrógeno
 Otros elementos:
-Fósforo, Calcio, Magnesio, Azufre, Fierro,
Zinc, Manganeso, Cobre, Molibdeno,
Cobalto y Tugsteno

7. Medios de Cultivo
 Los microorganismos requieren del
Metabolismo para degradar nutrientes y
obtener energía para sintetizar todos sus
componentes celulares.
 El Metabolismo se divide en:
- Catabolismo
- Anabolismo

8. Medios de Cultivo
 Nutriente:
Substancia obtenida del medio ambiente,
requerida por los organismos para la
generación de energía y la síntesis de
materiales celulares

9. Medios de Cultivo
 Los nutrientes se pueden dividir en:
a) Macronutrientes
b) Micronutrientes

10. Medios de Cultivo
Macronutrientes en la naturaleza y en los medios de cultivo
Elemento Forma en el ambiente Medios de cultivo
Carbono
Oxígeno
Nitrógeno
Fósforo
Azufre
Potasio
Magnesio
Sodio
Calcio
Hierro
CO2, Compuestos orgánicos
H2O, Compuestos orgánicos
NH3, NO3
-, N2, Compuestos
orgánicos nitrogenados
Compuestos orgánicos
PO4
3-
H2S, SO4
2-, Compuestos
orgánicos azufrados, sulfuros
metálicos (FeS, CuS, ZnS, NiS,
etc.)
K+ en solución o como sal
Mg2+ en solución o como sal
Na+ en solución o como sal
Ca+ en solución o como sal
Fe2+ o Fe3+ en solución o como
FeS, Fe(OH)3, u otras sales
Glucosa, malato, acetato, piruvato, extracto
de levadura, peptona, etc.
H2O, Compuestos orgánicos
Inorgánicos: NH4CL, (NH4) SO4, KNO3, N2
Orgánicos: aminoácidos, bases
nitrogenadas de nucleótidos, compuestos
con nitrógeno
KH2PO4, Na2HPO4
Na2SO4, Na2S2O7 Na2S, Compuestos
orgánicos azufrados
KCl, KH2PO4
MgCl2, MgSO4
NaCl
CaCl2
FeCl2, FeSO4, soluciones de Fe quelado con
EDTA o citrato

11. Medios de Cultivo
Micronutrientes necesarios para los microorganismos
Elemento Función Celular
Cromo
Cobalto
Cobre
Manganeso
Molibdeno
Níquel
Selenio
Tungsteno
Vanadio
Zinc
Hierro
En mamíferos en el metabolismo de la glucosa, no se conoce algún
microorganismo que lo requiera
Vitamina B12, Transcarboxilasa (bacterias del ácido láctico)
Como cofactor en algunas proteínas implicadas en la respiración
(citocromo c oxidasa), la fotosíntesis (plastocianina) y las
destoxificación de radicales libres (superóxido dismutasa)
Varias enzimas lo requieren como cofactor. Por ejemplo, la superóxido
dismutasa, la fotoliasa del fotosistema II.
Presente en enzimas que contienen flavina. También presente en la
nitrogenasa, nitrato reductasa, sulfito oxigenasa, DMSO y TMAO
reductasas, formato deshidrogenasas, etc.
La mayoría de las hidrogenasas, coenzima F430 de las metanógenas,
deshidrogenasa de monóxido de carbono, ureasa, etc.
Formato deshidrogenasa, selenocisteína
Formato deshidrogenasas, oxotransferasas de termofílicos
Vanadio nitrogenasa, bromoperoxidasa
Anhidrasa carbónica, alcohol deshidrogenasa, DNA y RNA polimerasas
y proteínas que se unen al DNA
Citocromos, catalasas, peroxidasas, proteínas con hierro y azufre
(ferredoxina), oxigenasas, nitrogenasas

12. Medios de Cultivo
 Definición de medio de cultivo:
Es un sustrato o solución de nutrientes en
donde se cultivan microorganismos en un
laboratorio.
Es la imitación de las condiciones favorables
para el desarrollo de los microorganismos.

13. Medios de Cultivo
 Requerimientos:
1. Fuente de Carbono
2. Fuente de energía
3. Fuente de Nitrógeno
4) Otras fuentes: Azufre, Fosforo.
5) Sales minerales (Cofactores)
6) Factores de crecimiento (vitaminas)
7) Agua

14. Medios de Cultivo
 Clasificación (composición química)
a) Sintético o definido
Se conoce su composición química cualitativamente
y cuantitativamente (compuestos orgánicos e
inorgánicos altamente purificados)
b) Semisintético, indefinido o
complejo
Se conoce parcialmente su composición química.
(hidrolisados de caseína, carne, soya, levadura u
otras sustancias como sangre, suero, etc.)

15. Medios de Cultivo
 Medios definidos
- Medio E
- Medio de Knop
- Medio de acetato de
Fowell
- Medio Czapek
- Medio arginina-
glicerol
 Medios complejos
- Medio BHI
- Gelosa Sangre
- Caldo nutritivo
- Medio PDA
- Medio Luria Bertani
- Medio Baird Parker

16. Medios de Cultivo
 Clasificación por su consistencia
a) Líquidos
b) Sólidos
c) Semisólidos

17. Medios de Cultivo
 Medios sólidos y semisólidos contienen
agentes solidificantes:
- Agar
- Gelatina
- Sílica Gel

18. Medios de Cultivo
 Agar:
- Proviene de algas rojas (Gelidium, Gracilaria, etc.)
- Polisacárido que:
Funde a altas temperaturas (87°C)
Solidifica entre 40-45°C,
No es degradado por la mayoría de las bacterias
Se utiliza del 1.5-2.0%
 Gelatina
- Se licúa a temperaturas relativamente bajas
- Los MO`s lo utilizan como fuente de carbono y nitrógeno
- Se utiliza a una concentración entre 5-10%
 Gel de sílice
- Se emplea cuando los microorganismos se inhiben con el agar

19. Medios de Cultivo
 Clasificación por su uso:
1) Mínimo
2) Simples
3) Ricos o Enriquecidos
4) Selectivos
5) Diferenciales
6) De enriquecimiento
7) De transporte

20. Medios de Cultivo
 Medio Mínimo
Medios que presentan la mínima cantidad de
nutrientes, capaz de permitir el desarrollo de los
microorganismos (Czapek, Medio E, Medio de Knop)
 Medio Simple
Medios comunes, que solo tienen un tipo de
infusión o extracto además de otros componentes
(Gelosa nutritiva, caldo nutritivo, PDA, etc.)

21. Medios de Cultivo
 Medio rico o
enriquecido
Son aquellos que tienen una
abundancia en la cantidad,
variedad y calidad de los
nutrimentos.
(Son medios complejos, son
adicionados de sangre
suero, plasma extractos).
Ejem. BHI, Gelosa Sangre,
Gelosa Chocolate, etc.)

22. Medios de Cultivo
 Medios selectivos
Son aquellos que tienen uno
o varios componentes en su
formulación que inhibe a
ciertos grupos de
microorganismos
permitiendo el crecimiento
de otros
(Medio carbón extracto de
levadura, Rosa de Bengala,
Agar Verde Brillante, etc.)
Legionella pneumophila

23. Medios de Cultivo
 Medios Diferenciales
Son aquellos que permiten
distinguir los
microorganismos que
crecen en ellos por
diferencia en una actividad
metabólica que en general
se pone de manifiesto por
una coloración,
precipitación o hemólisis
(Gelosa Sangre, Citrato de
Simmons, Agar Vogel
Joohnson, etc.)
Alfa Beta
Gama

24. Medios de Cultivo
 Ejemplos:
EMB (Eosina Azul de Metileno)
MaConkey
ASM (Agar Sal Manitol)
SS (Salmonella-Shigella)
S-110 (Staph- 110)
Medios selectivos y diferenciales

25. Medios de Cultivo
AGAR SAL MANITOL
NaCl 7.5%
Rojo de fenol (Indic. pH)
Salmonella-Shigella
Lactosa (Fuente de C)
Sales Biliares
Colorante
Plomo o Fierro

26. Medios de Cultivo
 El cromoagar es un
medio de cultivo
desarrollado por
BiomeriauxTM que
permite selccionar y
diferenciar diversas
especies microbianas en
función del color que
presentan las colonias.

27. Medios de Cultivo
 Medios de Enriquecimiento
Son aquellos que promueven el desarrollo preferencial de un
grupo o tipo de microorganismo escaso en la muestra o
inhibiendo el de organismos abundantes sin ningún interés
particular.
(Caldo Tetrationato de Müeller, Caldo Müeller-Hinton,
Caldo Urea, Etc.)
 Medios de Transporte
Se utilizan para el transporte de muestras biológicas, evitándo
la muerte de los microorganismos de interés.
Mantiene su viabilidad, pero no su multiplicación

28. Formulación de medios de cultivo
Condiciones generales de un medio de cultivo
 1. Presentar todos los elementos necesarios y en
sus proporciones/cantidades necesarias.
 2. pH adecuado.
 3. Condiciones osmóticas adecuadas.
 4. Debe de ser estéril y preservado de cualquier
contaminación.
 5. Medio fresco (ya que si se desecan y pierden
humedad, se concentran el resto de sus
componentes).

29. Formulación de medios de cultivo
 Componentes de los medios de cultivo:
 - Agua
 - Extracto de levadura: fuente rica en vitaminas B; también
contiene nitrógeno orgánico y compuestos de carbono
 - Peptonas: es el producto que resulta de la digestión de
materiales proteicos. Constituye una fuente principal de
nitrógeno orgánico; contiene también algunas vitaminas, y a
veces carbohidratos.

30. Formulación de medios de cultivo
 - Infusiones y extractos: contienen las sustancias solubles en agua de
tejidos animales (carbohidratos, compuestos orgánicos nitrogenados,
vitaminas solubles en agua y sales)
 Azúcares: actuarán como fuente de energía y/o Carbono (cuando su
proporción es de 1 g/l) o como substrato de prueba (1-2%)
 - Sales minerales: podemos distinguir dos tipos, atendiendo a
la función que desempeñan. Estos son:
Sales para el mantenimiento de la presión osmótica (NaCl), a
elevadas concentraciones (7.5%) es un agente selectivo.
Tampones: carbonatos y fosfatos (este ultimo más eficaz).

31. Formulación de medios de cultivo
 Indicadores de pH: son sustancias que cambian de color
cuando el medio alcanza algún valor determinado de pH.
Los más utilizados son:
- Azul de timol (Rojo 1,2 Azul 2,8 Amarillo)
- Púrpura bromocresol (Amarillo 5,2 Anaranjado 6,8 Púrpura)
- Azul de bromotimol (Amarillo 6,0 Verde 7,6 Azul)
- Rojo fenol (Amarillo 6,8 Rojo claro 8,4 Rojo cereza)
- Rojo neutro (Rojo intenso 6,8 Rojo 8,0 Amarillo)
- Azul de bromofenol, rojo de metilo, rojo de cresol,
fenolftaleina, etc..
 Indicadores REDOX: son sustancias que cambian de color
cuando se producen este tipo de reacciones. Distinguimos:
Azul de metileno (azul-incoloro)
Cloruro de trifenil (incoloro-rojo)

32. Formulación de medios de cultivo
 Agentes selectivos: son sustancias que inhiben el
crecimiento de determinados microorganismos en
detrimento de otros. Encontramos varios tipos:
 - Colorantes (antimetabolitos): cristal violeta, verde brillante, etc.
- Azida sódica: inhibe el metabolismo aerobio (inhibe la cadena
respiratoria); esto afecta principalmente a bacterias Gram
negativas.
- Sales biliares y detergentes: son agentes tensoactivos, depresores
de la tensión superficial. En este caso son las bacterias Gram
negativas las que resisten más su acción.
- Cloruro sódico: a elevadas concentraciones son perjudiciales para
aquellos microorganismos no halófilos.
- pH: cada tipo de microorganismo tiene su rango de pH óptimo y sus
valores críticos.
- Antimicrobianos: sustancias capaces de matar a microorganismos.

33. Formulación de medios de cultivo
 Suplementos (factores de crecimiento): consiste en uno o más
compuestos orgánicos que un microorganismo requiere como
precursor o como constituyente de su material orgánico
celular, pero que no puede sintetizar a partir de fuentes de
carbono más sencillas, y debe ser administrado como
nutriente. Hay tres clases: aminoácidos, pirimidinas y
vitaminas.
 - Agentes solidificantes: permiten solidificar un medio
previamente líquido. Pueden ser de:
- agar-agar (a partir de 1.5-2.0% es un medio de cultivo sólido;
para valores inferiores, medios semisólidos).
- gel de sílice
- gelatina

34. Formulación de medios de cultivo
 Agentes reductores: estos disminuyen el contenido de O2,
obteniéndose así un ambiente de anaerobiosis. Los más
usados son:
- Ácido ascórbico
- Tioglicolato sódico
- Ácido tiomálico
- Cisteina
- Agentes quelantes: son agentes que forman complejos solubles
con los metales, impidiendo así que estos formen un complejo
insoluble con los fosfatos. El más utilizado es el EDTA (ácido
etilendiamino tetraacético).

35. Formulación de medios de cultivo
 Agar TCBS (tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa).
- Extracto de levadura (5 g) fuente rica en vit. B, factores de
crecimiento, nitrógeno orgánico (aminoácidos) y compuestos de
carbono (hidratos de carbono)
- Peptona proteosa (10 g) fuente de nitrógeno orgánico
- Citrato sódico (10 g) sirve para des-estresar a los microorganismos,
porque éstos se colocan en un medio distinto al suyo
- Tiosulfato sódico (10 g) fuente de sulfato, en el que algunos
microorganismos reducen estos hasta sulfhídricos (medio diferencial)
- Bilis de buey (8 g) emulsionante (medio selectivo)
- Sacarosa (20 g) azúcar de prueba, proporción del 2% (medio
diferencial)
- Cloruro sódico (10 g) agente selectivo (medio selectivo)
- Citrato férrico (1 g) pone de manifiesto el sulfhídrico, y aparece
sulfuro de hierro (de color negro)
- Azul de bromotimol (0,04 g) indicador de pH
- Azul timol (0,04 g) indicador de pH
- Agar (15 g) solidifica el medio
- Agua destilada (1000 ml)
pH final: 8,6 agente selectivo (medio selectivo)

36. Formulación de medios de cultivo
 - Agar SS (Salmonella-Shigella).
- Peptona (10 g)
- Lactosa (10 g) sustrato de prueba (medio diferencial)
- Sales biliares (8,5 g) agente selectivo (medio selectivo)
- Citrato sódico (10 g) sustancia protector
- Tiosulfato sódico (8,5 g) diferencia colonias que utilizan
sulfato con los que utilizan sulfhídrico (medio diferencial)
- Citrato férrico (1 g) indicador redox
- Verde brillante (0,0003 g) agente selectivo (medio selectivo)
- Rojo neutro (0,025 g)
- Agar (12 g)
- Agua destilada (1000 ml)
pH final: 7,0

37. Preparación de medios de cultivo
LÍQUIDOS
PESAR
SOLUBILIZAR
ENVASE ESTERILIZACIÓN
ESTERILIZACIÓN ENVASE
PRUEBA DE
FUNCIONALIDAD
PRUEBA DE
FUNCIONALIDAD
ADICIÓN DE
SUSTANCIAS
TERMOLÁBILES
ADICIÓN DE
SUSTANCIAS
TERMOLÁBILES

38. Preparación de medios de cultivo
SÓLIDOS
PESAR
SOLUBILIZAR
ENVASE ESTERILIZACIÓN
ESTERILIZACIÓN ENVASE
PRUEBA DE
FUNCIONALIDAD
PRUEBA DE
FUNCIONALIDAD
ADICIÓN DE
SUSTANCIAS
TERMOLÁBILES
ADICIÓN DE
SUSTANCIAS
TERMOLÁBILES
ADICIONAR
AGENTE
SOLIDIFICANTE Y
CALENTAR PARA
DISOLVER
SOLIDIFICACIÓN SOLIDIFICACIÓN

39. CULTIVOS CELULARES
EUCARIOTAS

41. Medios para el cultivo celular
 Formulados a base de plasmas de la sangre y de una
gran variedad de nutrientes, sales, reguladores de pH,
aminoácidos, antibióticos, etc.
 Son muy complejos en su composición química.
 Principalmente son medios de mantenimiento,
enriquecidos y selectivos.
 Componente importante (división o crecimiento celular)
Suero Fetal “Bovino”.
 Contiene factores de crecimiento.
 Ejemplo tenemos: Medio Eagle,medio Dulbecco´s,
medio RPMI, etc.

42. Células Vero no infectadas
Células Vero infectadas
Con Herpes simplex virus