1. Métodos in vitro para evaluar la
biodisponibilidad, resistencia gastrointestinal e
interacción con la microbiota del colon de
compuestos bioactivos
Blanca Viadel Crespo
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Dpto Nuevos Productos

2. Métodos in vitro para estimar la biodisponibilidad y resistencia
gastrointestinal de compuestos bioactivos
Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos
bioactivos con la microbiota del colon
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3. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y
resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
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4. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Boca: masticación y mezclado con la saliva
que contiene enzimas que inician el proceso
químico de la digestión, formándose el bolo
alimenticio.
Digestión gástrica: transformación del bolo
alimenticio en una masa más fluida llamada
quimo. Dicha transformación se realiza a
través de la acción mecánica (contracciones
u ondas peristálticas) y la secreción gástrica
(jugo gástrico: constituido por proteasas,
lipasas y el ácido clorhídrico).
Digestión intestinal: incremento de pH
(mediante la liberación de bicarbonato de
sodio), continúa la digestión de los
componentes alimentarios por medio de la
bilis (segregada por el hígado) y el jugo
pancreático (proteasas, amilasas, lipasas)
formándose el quilo. La mayoría de
nutrientes se absorben en el intestino
delgado
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5. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Localización del proceso de digestión
Nutriente
Boca Estómago Intestino
Las enzimas tripsina y
La enzima
quimiotripsina los degrada a
pepsina los
Proteínas - Péptidos y posteriormente la
degrada a
enzima peptidasa los degrada en
Polipéptidos.
aminoácidos
La lipasa gástrica
degrada los La bilis las emulsiona y la lipasa
Grasas - triglicéridos en pancreática las degrada en ácidos
Ácidos Grasos y grasos, glicerol y monoglicéridos
glicerol.
La amilasa pancreática degrada al
La amilasa
Glúcidos Complejos almidón hasta maltosa
salival los
(almidón y - (disacárido), y luego la enzima
degrada a
glucógeno) Maltasa la degrada hasta
disacáridos.
monosacárido
Glúcidos Simples Las enzimas lactasa y sacarasa
- -
(lactosa y sacarosa) los degradan en monosacáridos
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6. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Para que un nutriente cumpla con su efecto funcional en el
organismo, se requiere que atraviese intacto el aparato digestivo
(resistencia gastrointestinal), se absorban en el intestino delgado,
alcancen niveles sanguíneos adecuados y mantengan
concentraciones estables en el sitio de acción (biodisponibilidad)
Resistencia gastrointestinal
Biodisponibilidad
El porcentaje de nutriente o compuesto bioactivo en un alimento,
comida o dieta que es utilizado para las funciones corporales normales
(Fairweather et al., 1992)
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7. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
La biodisponibilidad es el resultado de 3 etapas (Fairweather et al., 1995, 1996, 1997; Wienk et al., 1999)
Principales determinantes de la biodisponibilidad
Etapa 1 digestibilidad y solubilidad del Factores dietéticos:
nutriente o compuesto bioactivo -forma química en que éste se encuentre
en el tracto gastrointestinal -solubilidad
-interacciones con otros elementos presentes
Etapa 2 absorción y transporte a la Factores fisiológicos:
circulación -edad
-posibles anomalías genéticas
Etapa 3 incorporación a una entidad -estado fisiológico (embarazo, lactancia) y nutricional
funcional -estados patológicos
-flora intestinal
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8. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Técnicas propuestas para medir el
grado de biodisponibilidad de un nutriente
Métodos in vivo Métodos in vitro
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9. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Métodos in vivo de la biodisponibilidad
Balance químico Mide la ingesta y excreción del nutriente o compuesto bioactivo
por un período determinado de tiempo
Medición en plasma Consiste en la medición en plasma de un elemento tras la
ingestión del mismo en grandes concentraciones
Marcaje por isótopos El marcaje con isótopos, se presenta como una alternativa en la
estimación de la fracción absorbida y excretada de un animal
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10. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Métodos in vitro de la biodisponibilidad
Solubilidad Incluyen una digestión gástrica con HCl o HCl-pepsina, posterior digestión
intestinal mediante neutralización con una base (usualmente NaOH o
NaHC03), incubación con pancreatina-extracto biliar y posterior
centrifugación
Diálisis Consta de una digestión de la muestra con pepsina -HCl, y a continuación
se introduce una bolsa de diálisis que contiene NaHC03. Tras incubación,
se adiciona pancreatina-sales biliares, se incuba de nuevo y finalmente se
determinan los contenidos de los elementos minerales del dializado.
Dicha etapa simula el paso del intestino al torrente sanguíneo
Cultivos celulares La captación y transporte de nutrientes por la mucosa intestinal puede
estudiarse in vitro utilizando, entre otros modelos experimentales,
enterocitos
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11. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Métodos in vivo vs in vitro
Métodos in vivo Métodos in vitro
- Lo ideal serían los estudios realizados en seres - Los métodos in vitro son de gran utilidad como etapa
humanos: por ejemplo por el método de los balances, previa a la estimación de la biodisponibilidad de los
pero se trata de un método largo, laborioso y de baja nutrientes o compuestos bioactivos en seres humanos.
precisión. - Estos métodos pueden constituir una buena
- Este problema puede evitarse mediante el uso de alternativa para estudiar los efectos de los factores
radioisótopos. Los métodos in vivo que utilizan dietéticos sobre la biodisponibilidad de los nutrientes o
isótopos son costosos, requieren de instrumental compuestos bioactivos.
sofisticado y se aplican a grupos restringidos de - Son métodos menos laboriosos y tienen una gran
población (Yergey, 1996). significación biológica ya que ayudan a estimar el
- En los ensayos in vivo con animales, surgen dudas porcentaje de nutriente capaz de ser transformado, en
sobre si los resultados obtenidos pueden ser el intestino, en una forma absorbible por el organismo.
predictores fiables de la absorción de elementos en
seres humanos (Reddy & Cook, 1991).
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12. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Ventajas de los métodos de estimación de la biodisponibilidad in vitro
-la información obtenida a través de los sistemas in vitro tienen una gran significación
biológica y aunque no puedan predecir los cambios in vivo que se producen en el organismo,
ya que se tratan de métodos de simulación gastrointestinal, sí ayudan a comprender mejor los
resultados obtenidos in vivo y a diseñar futuras experiencias a realizar en organismos vivos
(Johnson, 1989).
-son métodos más rápidos, de menor coste y de fácil manipulación
-con posibilidad de toma de muestra en cualquier parte del tracto gastrointestinal
-con mejor reproducibilidad que los estudios in vivo
-no supone limitaciones éticas
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13. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
No existen técnicas o modelos perfectos para estudiar el grado de
biodisponibilidad de los nutrientes en el hombre, y es necesario
la acción conjunta de diversos sistemas in vitro e in vivo
para obtener una información completa de
la biodisponiblidad de
nutrientes
Los métodos in vitro presentan inconvenientes que se pretenden solucionar
mediante el desarrollo de reactores o digestores in vitro
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14. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
El modelo TIM-1 desarrollado por el centro Holandés de Investigación Estomago artificial desarrollado por el Instituto Británico de
Científica Aplicada TNO (Nutrition and Food Research) Investigación Alimentaria de Norwich (IFR)
Sistema de reactores que posibilita la reproducción de los movimientos Modelo dinámico totalmente computerizado capaz de reproducir las
peristálticos propios del sistema digestivo humano, compuesto por cuatro condiciones fisiológicas del estomago (químicas y mecánicas),
compartimentos que simulan el estómago y las distintas zonas del aportando además la novedad de una fase preliminar de masticación
intestino delgado (duodeno, yeyuno e íleon)
Digestor Dinámico in vitro desarrollado por ainia
Sistema dinámico totalmente computerizado capaz de la
realización de dos funciones: mecánica y físico-química
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15. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
El digestor dinámico in vitro diseñado y desarrollado por ainia reproduce las condiciones naturales del
tracto gastrointestinal humano (estómago e intestino delgado) y sus características principales
- El digestor reproduce el proceso de digestión gastrointestinal.
- En el estómago se lleva a cabo la digestión gástrica de los
alimentos, consistente en la transformación del bolo alimenticio
en una masa fluida llamada quimo (digerido gástrico).
- Posteriormente continúa la digestión intestinal, donde se
siguen descomponiendo los nutrientes y/o compuestos
bioactivos, dando lugar al quilo (digerido intestinal).
- Tras alcanzar un adecuado tamaño, dichos compuestos se
absorben a través del equipo de diálisis
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16. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Especificaciones del Digestor Dinámico in vitro
-reproduce los movimientos peristálticos mediante
impulsión de agua en cámaras flexibles (incrementa el
grado de mezcla y trituración del alimento)
-controla la temperatura del agua de bombeo, lo que
permite realizar la digestión a la temperatura deseada
-los bombeos se realizan a intervalos regulares en dos
cámaras conectadas
-regula las condiciones de acidez a través de un control del Ph en la cámara del estómago y/o del
intestino, mediante un electrodo que regula la adición de ácido o base.
-control total del proceso y de sus variables operativas y condicionantes (tiempo, concentraciones de
reactivos, condiciones básicas que se dan en el tacto gastrointestinal…) con posibilidad de recolección
y análisis de los datos obtenidos.
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17. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Diagrama de flujo del Digestor Dinámico in vitro
Cámara 1 Cámara 2
Cámara 1 Cámara 2
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18. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Aplicaciones del Digestor Dinámico in vitro
• estudiar la biodisponibilidad de los compuestos seleccionados para un alimento
Ejm. Evaluación de la cantidad de minerales que se absorben por el organismo tras el proceso de digestión
• estudiar las interacciones entre nutrientes de un alimento
Ejm. Identificación de los compuestos de los alimentos que son capaces de aumentar o disminuir la biodisponibilidad de sus nutrientes.
• determinar el efecto de los pretratamientos de alimentos sobre la biodisponibilidad
Ejm. Análisis de las diferentes variables de cocinado de un alimento y cómo estas variables influyen en la mayor o menor absorción de
minerales del alimento por parte del organismo
• estudiar nuevas formulaciones que posibiliten una mejor absorción de los nutrientes
Ejm. Análisis de las diferentes formas de incorporación del ingrediente funcional (omega 3, probióticos, fibra…) a un alimento y validar aquellas
que son más óptimas para su ingesta adecuada
• estudiar la resistencia al tracto gastrointestinal de compuestos alimentarios
Ejm. Determinar la viabilidad de los probióticos tras su paso a través del tracto gastrointestinal
• verificar la eficacia de la microencapsulación de compuestos alimentarios
Ejm. Validar la técnica de microencapsulación de compuestos bioactivos mediante la evaluación a la resistencia al tracto gastrointestinal de
dichos compuestos
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19. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Sistema integrado Digestor Dinámico in vitro/cultivos celulares
Monocapa celular Caco-2 Determinación en la monocapa celular y en
la parte basal de compuestos bioactivos
biodisponibles
Digestor Dinámico in vitro
Estudio absorción/transporte intestinal
Bioensayo celular en células Raw 264.7
Determinación la capacidad inmunoestimulante
mediante análisis de expresión de genes por RT-
PCR
Estudio funcionalidad órgano diana
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20. Métodos in vitro para estudiar la interacción de
compuestos bioactivos con la microbiota del
colon
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21. Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos bioactivos con la microbiota del colon
Durante el proceso de digestión gastrointestinal los nutrientes que ya han alcanzado un tamaño
adecuado y son de utilidad atraviesan la pared intestinal
Dicha absorción se realiza lentamente y al final solo queda en el digerido intestinal los materiales no
digeribles, junto con el agua y los minerales que se han segregado en las diferentes fases del
proceso digestivo
Esta mezcla pasa al intestino grueso, donde se inicia el proceso de fermentación por
acción de la microbiota intestinal
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22. Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos bioactivos con la microbiota del colon
La microbiota del intestino incluye especies nativas que colonizan permanentemente el tracto
gastrointestinal, y microorganismos vivos que transitan temporalmente por el tubo digestivo (Guarner y
col., 2003).
Luz intestinal
Microorganismos
Enterocitos
(células epiteliales
intestinales
Las bacterias nativas se adquieren al nacer y durante el primer año de vida, mientras que las
bacterias en tránsito se ingieren continuamente a través de los alimentos, bebidas, etc
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23. Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos bioactivos con la microbiota del colon
En el estómago y el duodeno, el número de
microorganismos se ve reducido debido a las secreciones
ácidas, biliares y pancreáticas
En el intestino disminuye la acidez lo que facilita la
colonización bacteriana, fundamentalmente en el
intestion grueso.
Entre los grupos bacterianos más abundantes en esta
zona destacan miembros del género (Gibson y
Roberfroid, 1995; Guarner, 2006) :
- Bacteroides
- Bifidobacterium
- Eubacterium
- Clostridium
- Lactobacillus
- Cocos Gram-positivos
En menor proporción:
Distribución bacteriana en el tracto gastrointestinal humano (figura modificada
de B. Sartor Gastroenterology, 2008) - Enterococos
- Representantes de la familia Enterobacteriaceae
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24. Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos bioactivos con la microbiota del colon
Principales funciones de la microbiota presente en el colon
Bacterias que segregan
bacteriocinas que impiden la
implantación de bacterias extrañas
al ecosistema
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25. Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos bioactivos con la microbiota del colon
Principales grupos bacterianos del colon en función de sus efectos beneficiosos y perjudiciales
sobre la salud (Salminen y col., 1998, modificada)
1011 CFU/g
Efectos perjudiciales Bacteroides Efectos beneficiosos
Eubacterias
Bifidobacterias
Peptoestreptococos y Ruminococos
- Putrefacción
Costridios - Disminución de la producción de gas
- Producción de toxinas
- Producción de carcinógenos - Producción de SCFA
Lactobacilos
- Efecto inmunoestimulante
- Actividad antitumoral
Enterobacterias
Sulfato reductoras y Fusobacterias
Veillonellas
Estafilococos
104 CFU/g
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26. Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos bioactivos con la microbiota del colon
El intestino grueso es el sitio principal para la biotransformación de moléculas endógenas y
exógenas.
Sin embargo la inaccesibilidad impide el estudio de la actividad metabólica y ecológica de la
microbiota. Además los estudios con humanos y con animales para estudiar esta región son
costosos y tienen inconvenientes éticos.
No existe un método ideal, sino una combinación de métodos que se deben utilizar para identificar
el papel de las bacterias intestinales en el metabolismo de compuestos.
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27. Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos bioactivos con la microbiota del colon
Métodos in vitro de digestión del colon publicados
1. Cultivos en baños estáticos
Es el más simple de los fermentadores in vitro, ya que son baños de
cultivos estáticos. Tienen la ventaja de la simplicidad y facilidad de
uso. Sin embargo una de las desventajas de esta metodología es su
adecuación sólo por períodos de incubación muy corto (Coates et
al., 1988).
2. Sistemas de cultivo semi-continuo y continuo
Permiten reproducir con mayor exactitud las condiciones
gastrointestinales, se trata de sistemas que añaden continuamente
medio de cultivo fresco y al mismo tiempo eliminan el cultivo
gastado (Coates et al., 1988; Gibson et al., 1988).
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28. Métodos in vitro para estudiar la interacción de compuestos bioactivos con la microbiota del colon
Métodos in Vitro de digestión del colon publicados
3. Simulador del ecosistema intestinal
microbiano humano (SHIME)
Un sistema más complejo fue desarrollado por Molly et al.
(1993) que consiste en un reactor de cinco etapas (estgómago,
intestino, colon ascendente, transversal y descendente). Este
reactor puede evaluar la dinámica de la ecología microbiana
del tracto gastrointestinal (Molly et al., 1994).
4. Sistema de control computerizado y con la
absorción de agua, los movimientos
peristálticos, y la absorción de productos de
la fermentación (TIM2)
Minekus et al. (1999) introdujo un nuevo tipo de sistema que
combina la eliminación de los metabolitos y el agua.
5. La inmovilización de la microbiota fecal
La inmovilización de las bacterias asegura la eliminación
de las células muertas favoreciendo con ello un óptimo
crecimiento de las células inmovilizadas Cinquin et al.
(2004; 2006).
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29. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
El Digestor in vitro de Fermentación Colónica desarrollado por ainia, reproduce el proceso de digestión
gastrointestinal (estómago , intestino delgado y colon)
Colon
ascendente
En el estómago se lleva a cabo la Colon
transversal
digestión gástrica de los alimentos, Colon
descendente
consistente en la transformación del bolo
alimenticio en el quimo (digerido gástrico)
Posteriormente continúa la digestión
intestinal, donde se siguen
descomponiendo los nutrientes y/o
compuestos bioactivos, dando lugar al
quilo (digerido intestinal)
Posteriormente, en el intestino grueso Intestino delgado
Estómago
(colon ascendente, transversal y
descendente) tiene lugar la fermentación
por acción de la microbiota intestinal
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30. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Especificaciones del Digestor in vitro de Fermentación Colónica (DIF)
-funcionamiento del sistema en continuo, simulando las
condiciones reales del tracto digestivo
-reproducción de tres tipos de medio de reacción,
simulando las condiciones del colon ascendente,
transversal y descendente
-control del pH en todos los reactores, mediante
electrodos que regulan la adición de ácido o base
Colon
-Control de temperatura mediante el bombeo de agua a Estómago Intestino
ascendente
Colon
transversal
Colon
descendente
37ºC
-Mantenimiento de todo el sistema de reacción en condiciones de anaerobiosis, para asegurar la
ausencia de oxígeno a lo largo de todo el proceso
-posibilidad de recolección y análisis de los datos obtenidos
- monitorización del crecimiento de la flora bacteriana característica presente en el colon
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31. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Diagrama de flujo del Digestor in vitro de Fermentación Colónica
300ml 450ml 1000ml 1600ml 1200ml
pH: 2-1.7 pH: 5-6 pH: 5.5-6 pH: 6-6.4 pH: 6.4-6.8
HCl NaOH
Extracto NaOH NaOH NaOH
biliar-
pancratina
300 ml medio
de cultivo
Permanencia 2h Permanencia 6h Permanencia 76 horas
Estómago Intestino Colon Colon Colon
ascendente transversal descendente
(CA) (CT) (CD)
Flujo discontínuo (-----------) Flujo contínuo ( )
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32. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Aplicaciones
- estudiar la resistencia al tracto gastrointestinal de compuestos alimentarios
- evaluar las propiedades fermentativas de ciertos compuestos tales como fibras, prebióticos
y prebióticos mediante el análisis de metabolitos como ácidos grasos de cadena corta o
aminoácidos
- estudiar la composición y actividad metabólica de la microbiota del colon
- estudiar la interacción de patógenos y probióticos con la microbiota del colon
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33. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Sistema integrado Digestor in vitro de fermentación colónica/cultivos celulares
Digestor Dinámico in vitro Células Caco-2
Evaluación de la capacidad de adhesión de
bacterias intestinales a la monocapa de las
células
Células HT-29
Estudio de la interacción de los agentes
patógenos y los probióticos con las células
intestinales
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34. Métodos in vitro para evaluar la biodisponibilidad y resistencia gastrointestinal de compuestos bioactivos
Gracias por su atención
Blanca Viadel
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