Aislamiento de Salmonella

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Aislamiento de Salmonella
Tomado de:
Gaviria, Blanca C., Manual de Prácticas de Microbiología de Alimentos, 1997, Bogotá, Colombia, Carrera de Bacteriología PUJ.

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  • hola buen dia, me gustaria saber si tiene alguna bibliografía de donde saco la manera de reportar por 25 g
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Aislamiento de Salmonella

  1. 1. PRÁCTICA 10: AISLAMIENTO DE SALMONELLAEpidemiológicamente unos pocos serotipos de Salmonella tienen huésped específico siendo lamayoría inespecíficos, en cuanto a especie animal que potencialmente pueden afectar. Las fuentesde contaminación son muy amplias y las especificaciones en Microbiología de Alimentos exigenausencia de cualquier serotipo de Salmonella en 25 o 50 g de muestra.El aislamiento de Salmonella a partir de alimentos se hace difícil por dos factores:La población de Salmonella frente a la flora competitiva es muy baja y porque muchos alimentoshan sido sometidos a procesos que destruyen parte de la flora microbiana, quedando los quesobreviven muy debilitados.La metodología para el aislamiento e identificación de Salmonella comprende 5 pasos:Preenriquecimiento en medio no selectivoEnriquecimiento selectivoSiembra en medios selectivosPruebas bioquímicasPruebas serológicasMaterialesþ Recipiente estériles, boca ancha, de 500 ml con 225 ml de Caldo BHI o Caldo Tripticase Soyaþ Incubadora a 35°C  1 °Cþ Baño de agua a 45°Cþ Pipetas estériles de 1 mlþ Asa bacteriológicaþ Tubos serológicos 10 x 75 mmþ Portaobjetosþ Tubos con 10 ml de Caldo Tetrationato o Caldo Rappaportþ Tubos con 10 ml de Caldo Selenite Cistinaþ Cajas con Agar Bilis Verde Brillanteþ Cajas con Agar Bismuto Sulfitoþ Cajas con Agar Hektoenþ Cajas con Agar XLDþ Tubos con Agar Hierro tres azúcaresþ Tubos con Agar Lisina hierroþ Tubos con Caldo o Agar Ureaþ Solución salina fisiológicaþ Agar Tripticase Soya inclinadoþ Antisuero polivalenteProcedimientoPre enriquecimiento no selectivo:  Pesar asépticamente 25 g ó ml de la muestra  Agregar la muestra a 225 ml de Caldo Cerebro Corazón en un recipiente de 500 mL  Incubar a 35 - 37°C durante 2 - 6 horas
  2. 2. Enriquecimiento:  A partir del medio de enriquecimiento  Pipetear 1 mL y sembrar en Caldo Selenite Cistina (incubar a 35°C por 24 h)  Pipetear 1 mL y sembrar en Caldo Tetrationato (blanco lechoso) o Caldo Rappaport (incubar a 43°C por 24 h)3. Siembra en Medios Selectivos: De cada uno de los medios de enriquecimiento selectivo sembrar con asa en:  Agar Bismuto Sulfito  Agar Bilis Verde Brillante  Agar Hektoen o Agar XLD  Incubar las cajas a 35°C por 24 horas. Si en Agar Bismuto Sulfito no aparecen colonias sospechosas, reincubar por 24 horas másInterpretación de las colonias:Agar Bismuto SulfitoColonias MicroorganismosCentro negro, precipitado negro y con Salmonella (Excepto S. paratyphi ycon brillo metálico S. pullorum)Pequeñas con color verde a pardo Coliformes, Proteus (Solo presentes ocasionalmente)Agar XLDColonias MicroorganismosAmarillas, opacas halo de precipitado E. coli, Enterobacter, AeromonasAmarillas, mucosas, halo de precipitado KlebsiellaAmarillas opacas, a veces con centro negro CitrobacterAmarillas con halo amarillo Serratia, HafniaAmarillas, transparentes con centro negro ProteusRojizas a veces con centro negro SalmonellaAnaranjadas opacas Salmonella typhiRojizas transparentes Shigella, Providencia
  3. 3. Agar HektoenColonias MicroorganismosVerde húmeda, plana transparente Shigella, ProvidenciaAzul verdosa con centro negro SalmonellaAzul verdosa sin centro negro ProteusAzulada plana borde irregular PseudomonasColor salmón, con halo de precipitación ColiformesAgar Bilis Verde BrillanteColonias MicroorganismosRojas con halo rojo Salmonella ProteusAmarillas con halo amarillo E. coli, Enterobacter, Citrobacter, KlebsiellaPruebas Bioquímicas: Seleccionar 2 o más colonias sospechosas de cada uno de los medios selectivos Inocular cada colonia en tubos con Agar hierro tres azúcares y Agar Lisina hierro y Agar Urea, en el fondo y en la superficie. Después de sembrar el primer tubo inocular el segundo sin flamear el asa Incubar los tubos de 35°C durante 24 horas. Los cultivos sospechosos de en Agar hierro tres azúcares muestran el fondo amarillo (formación de ácido) y la superficie inclinada rojo. Con o sin producción de H2S (ennegrecimiento del medio). En Agar Lisina hierro muestran una reacción alcalina (púrpura) del medio resultante de la descarboxilación de la lisina con o sin H2S. En Agar Urea no se produce cambio de color en el medio. Si es necesario realizar las pruebas bioquímicas que se indican en la tabla.Pruebas Serológicas: Prueba para antígeno somático, polivalente O  Diluir y chequear el antisuero con cultivos conocidos  Marcar 2 secciones de 1 x 2 cm en un portaobjetos  Colocar una asada de cultivo de 24 horas de Agar Nutritivo o Agar Hierro tres azúcares en la sección marcada  Agregar una gota de solución salina fisiológica a cada sección  Mezclar con asa limpia  Agregar una gota de antisuero polivalente o a una sección y mezclar
  4. 4.  Agitar el portaobjetos por 1 minuto  Observar sobre fondo oscuro Interpretar: Positivo: Cuando se presenta aglutinación en la mezcla cultivo salina suero y no aglutinación en la mezcla cultivo salina. Negativo: Cuando no hay aglutinación en la mezcla cultivo salina suero. Estos cultivos deben probarse con el antisuero polivalente H Inespecífico: Cuando las dos mezclas aglutinan. En este caso se requieren pruebas adicionalesInterpretación:Las cepas que muestran pruebas bioquímicas típicas y dan reacciones serológicas positivas se consideran como Salmonella especies. 1. Las cepas que muestran pruebas bioquímicas típicas pero no dan reacciones serológicas y las cepas que no muestran reacciones bioquímicas típicas pero dan reacciones serológicas positivas pueden ser Salmonella 2. Las cepas que no muestran reacciones bioquímicas típicas ni dan reacciones serológicas positivas no se consideran Salmonella. Las cepas aisladas en los casos 1 y 2 deben ser enviadas en Agar Cerebro Corazón inclinado en tubo de tapa rosca a un Centro de referencia, adjuntando la información pertinente.Expresión de resultados:Si no se aisló Salmonella en los medios de enriquecimiento y selectivos reportar: No se aisló Salmonella en 25 g o 50 g de la muestra examinada.Si se encuentra Salmonella a partir de uno o los 2 caldos de enriquecimiento selectivo reportar: Se aisló Salmonella en 25 g de la muestra examinada.
  5. 5. Reacción Porcentaje de Serotipos que producen la ReacciónAgar Hierro tres azúcares:glucosa, con formación de ácido + 100glucosa, con formación de gas + 91.9lactosa -* 99.2sacarosa - 99.5H2S + 91.6Urea - 100Lisina + 94.6 galactosidasa -* 98.5Indol - 98.9* Salmonella: subgénero III (Arizona) puede presentar reacciones positivas.
  6. 6. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA SALMONELLA MEDIOS DE CULTIVOPRUEBA Y/O REACTIVOS SIEMBRA INTERPRETACIONOxidasa A. Nutritivo Colocar 1 colonia sobre A los 20-60 segundos + Discos de Oxidasa la zona reactiva de la comparar con escala de tira colores Positivo: Azul o violetaIndol Agua de Triptona Siembra ligera Agregar 0.3-0.5 mL de Reac. +Reactivo de Kovacs Incubar 18-24 horas de Kovac Positivo: coloración rosadaRojo de Metilo Caldo MR VP + Siembra ligera Agregar 4-6 gotas de rojo de Sol Rojo de Metilo Incubar 48 horas metilo Positivo: color rojoVoges Proskauer Caldo MR VP + Separa 1 mL del cultivo Agregar 0.6 mL de  naftol y  naftol y KOH en caldo MRVP antes 0.2 mL de KOH. Agitar y de hacer la prueba dejar reposar hasta 2 horas Positivo: Coloración rojizaCitrato Agar Citrato de Simonns Sembrar en estrías Positivo: Crecimiento en la Incubar 24 horas superficie y cambio de color a azulMalonato Caldo malonato Incubar 24-48 horas Positivo: cambio de color a azulFenilalanina Fenilalanina Incubar 24-48 horas Agregar HCl 0.1N hasta amarillo. Agregar 3-4 gotas de Cloruro férrico al 10% Positivo: verde en 2-3 minutos Galactosidasa 0.25 mL de Solución Siembra densa + 1 gota Agregar 0.25 mL de salina fisiológica de tolueno Reactivo de ONPG Incubar 2-5 minutos a Positivo: coloración 37°C amarilla a los 20 minutos en baño Esperar hasta 3 horas reacción lentaFuente:Gaviria, Blanca C., Manual de Prácticas de Microbiología de Alimentos, 1997, Bogotá, Colombia,Carrera de Bacteriología PUJ.

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