1. Cinética Enzimática
DRA. VALESKA ORMAZABAL V.
DEPTO. CIENCIAS BÁSICAS
FACULTAD DE MEDICINA
CURSO MEDICINA MED.207
2012
2. COOPERATIVIDAD
Una proteína une más de una molécula de un mismo ligando
L L L L
L
P P P P L L P L
K1 K2 L K3 L K4 L
K1 < K2< K3< K4 Cooperatividad positiva
K1> K2> K3> K4 Cooperatividad negativa
K1 = K2 = K3 = K4 No cooperatividad
4. La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de una
molécula de substrato favorece la fijación del siguiente, y así
hasta ocuparse toda la molécula
s + s s + s s + s s
1 2
s 3
s s
En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3
Por lo que cooperatividad negativa, es cuando la fijación de
una molécula de substrato dificulta la fijación del siguiente.
5. El comportamiento cooperativo implica:
1. Que hay más de un sitio de fijación de substrato
por molécula de enzima (estr.cuaternaria)
2. Que hay interacciones entre los sitios de fijación
7. vo
Vmax Snh
vo = -----------------
Snh0,5 + Snh
S
1/vo
1/S
1/S 1/S
8. Tratamiento de Hill
Aplicada a las enzimas con cinética sigmoidal
v
Saturación de la
Y = ------------
enzima [Po2]nh
Vmax Y = ---------------
K` + [Po2]nh
Snh S0,5 Concentración substrato la saturación
es igual ½ Vmax
Y = -------------
nh igual a 1 es una saturación hiperbólica michaeliana
Snh + Snh 0,5 S0,5 = Km
S v S
Y = ----------- = ------------ = -----------
S0,5 + S Vmax Km + S
nh>1 Cooperatividad positiva
nh<1 Cooperatividad negativa
9. 2.2.1-Linearización de la ecuación de Hill
S nh
Y S 0nh S nh
,5 S nh
1 Y S nh S 0nh
,5 Reacción enzimática la
1 fracción de saturación
S 0nh S nh
,5
Y
log nh log S nh log S 0,5
1 Y v
Y vo Y
V max
1 Y V max vo
vo
log nh log S nh log S 0,5
V max vo
Representando la ecuación lineal
10. La ecuación de una recta pendiente es el índice de Hill
vo Log[S0,5]
log
V max vo
pendiente = nHill
0
Obtención valor experimental del índice de Hill nos
permite deducir la existencia de cooperatividad.
nH indica cuántas de las zonas de unión de sustrato
de una enzima afectan a la afinidad de la unión del
sustrato en el resto de las zonas de unión.
log [S]
S0,5 Concentración substrato para la cual la saturación es igual a ½ de la velocidad
máxima
11. vo nh<1
Vmax Snh
vo = -----------------
nh=1 nh>1 Snh0,5 + Snh
S
nh>1 nh=1 nh<1
1/vo
1/S
1/S 1/S
12. Significado Biológico de la
Cooperatividad
Enzimas con cooperatividad positiva, un cambio en la concentración de
sustrato de 9 veces hace que la enzima pase de una saturación del 10% al
90%.
Enzimas con cinética hiperbólica, índice de Hill 1 se necesita aumentar 81
veces la concentración de sustrato para alcanzar el 90% de saturación
Enzimas con cooperatividad negativa, para que la enzima pase de una
saturación del 10% al 90% se necesita aumentar 6561 veces la
concentración de sustrato.
13. Regulación Alostérica de la función enzimática
•La velocidad de una reacción enzimática depende de la
formación del complejo [ES].
¿ Es posible regular la actividad enzimática,
modificando la interacción enzima-sustrato?
14. Enzimas Alostéricas
•Evidencia Experimental:
Threonine
-
dehydratase
L-Thr ---------> 2-Oxo-butyric acid ---> ---> --->... ---> ---> L-Ile
- Sólo la primera enzima de la vía, la “treonina-dehidratasa”, muestra este tipo de
inhibición.
15.
16. - Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306
a) El ligando implicado en la regulación de la actividad enzimática (molécula reguladora o
efector), generalmente, es estructuralmente diferente del sustrato o el producto de la reacción
que cataliza la enzima retroinhibida.
b) La mayor parte de las enzimas
cuya actividad se controla/regula
por este tipo de regulación, no
muestran cinéticas hiperbólicas
clásicas cuando se representa v
[S], sino que muestran una
cinética de tipo sigmoidal.
c) Es relativamente fácil distinguir entre la unión del efector a la enzima y la unión del sustrato.
Varios tratamientos químicos y físicos nos permiten “desensibizar” la enzima, es decir, hacerle
perder su respuesta ante las moléculas reguladoras o efectores sin que ello lleve parejo la perdida
de la actividad catalítica. Así en el caso de la ACTasa un tratamiento térmico, suave, da lugar a una
enzima activa no inhibible por CTP. La enzima “desensibizada” muestra una cinética hiperbólica
semejante a la que presentan las enzimas michaelianas.
d) Generalmente las enzimas que se regulan por este mecanismo son “oligómeros”, es decir,
proteínas formadas por varias subunidades iguales o distintas, unidas entre si por fuerzas débiles.
17. - Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306
1. la molécula reguladora o efector se une a un sitio de la enzima
diferente del centro activo, de manera que la interacción entre la
molécula reguladora y el sustrato tiene lugar de manera indirecta o
“alostérica”, (del griego otra estructura).
* La unión de la molécula reguladora al “sitio de
regulación” induce un cambio conformacional
reversible en la enzima que causa una alteración de
la estructura del centro activo y los consiguientes
cambios en sus propiedades cinéticas.
20. Inhibidores y activadores
alostéricos
1.0
Y
(+ Activador)
0.8
V+
0.6
(sin efectores)
V0
0.4
(+ Inhibidor)
0.2
V-
s
0.0
0 2 4 6 8 10 12
21. Los efectores alostéricos operan sobre el grado de
cooperatividad del sistema:
- Los inhibidores alostéricos aumentan el grado de
cooperatividad
- Los activadores alostéricos disminuyen el grado de
cooperatividad; a concentraciones elevadas de activador,
la cinética pasa a ser michaeliana, y deja de ser sigmoide.
22. Modelos que permiten explicar el fenómeno de
Cooperatibidad
•Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux
•Modelo Secuencial de Koshland, Nemethy y Filmer