1. Cinética Enzimática
DRA. VALESKA ORMAZABAL V.
DEPTO. CIENCIAS BÁSICAS
FACULTAD DE MEDICINA
CURSO MEDICINA MED.207
2012

2. COOPERATIVIDAD
Una proteína une más de una molécula de un mismo ligando
L L L L
L
P P P P L L P L
K1 K2 L K3 L K4 L
K1 < K2< K3< K4 Cooperatividad positiva
K1> K2> K3> K4 Cooperatividad negativa
K1 = K2 = K3 = K4 No cooperatividad

3. Cooperatividad Positiva

4. La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de una
molécula de substrato favorece la fijación del siguiente, y así
hasta ocuparse toda la molécula
s + s s + s s + s s
1 2
s 3
s s
En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3
Por lo que cooperatividad negativa, es cuando la fijación de
una molécula de substrato dificulta la fijación del siguiente.

5. El comportamiento cooperativo implica:
1. Que hay más de un sitio de fijación de substrato
por molécula de enzima (estr.cuaternaria)
2. Que hay interacciones entre los sitios de fijación

6. Cooperatividad Negativa

7. vo
Vmax Snh
vo = -----------------
Snh0,5 + Snh
S
1/vo
1/S
1/S 1/S

8. Tratamiento de Hill
Aplicada a las enzimas con cinética sigmoidal
v
Saturación de la
Y = ------------
enzima [Po2]nh
Vmax Y = ---------------
K` + [Po2]nh
Snh S0,5 Concentración substrato la saturación
es igual ½ Vmax
Y = -------------
nh igual a 1 es una saturación hiperbólica michaeliana
Snh + Snh 0,5 S0,5 = Km
S v S
Y = ----------- = ------------ = -----------
S0,5 + S Vmax Km + S
nh>1 Cooperatividad positiva
nh<1 Cooperatividad negativa

9. 2.2.1-Linearización de la ecuación de Hill
S nh
Y S 0nh S nh
,5 S nh
1 Y S nh S 0nh
,5 Reacción enzimática la
1 fracción de saturación
S 0nh S nh
,5
Y
log nh log S nh log S 0,5
1 Y v
Y vo Y
V max
1 Y V max vo
vo
log nh log S nh log S 0,5
V max vo
Representando la ecuación lineal

10. La ecuación de una recta pendiente es el índice de Hill
vo Log[S0,5]
log
V max vo
pendiente = nHill
0
Obtención valor experimental del índice de Hill nos
permite deducir la existencia de cooperatividad.
nH indica cuántas de las zonas de unión de sustrato
de una enzima afectan a la afinidad de la unión del
sustrato en el resto de las zonas de unión.
log [S]
S0,5 Concentración substrato para la cual la saturación es igual a ½ de la velocidad
máxima

11. vo nh<1
Vmax Snh
vo = -----------------
nh=1 nh>1 Snh0,5 + Snh
S
nh>1 nh=1 nh<1
1/vo
1/S
1/S 1/S

12. Significado Biológico de la
Cooperatividad
Enzimas con cooperatividad positiva, un cambio en la concentración de
sustrato de 9 veces hace que la enzima pase de una saturación del 10% al
90%.
Enzimas con cinética hiperbólica, índice de Hill 1 se necesita aumentar 81
veces la concentración de sustrato para alcanzar el 90% de saturación
Enzimas con cooperatividad negativa, para que la enzima pase de una
saturación del 10% al 90% se necesita aumentar 6561 veces la
concentración de sustrato.

13. Regulación Alostérica de la función enzimática
•La velocidad de una reacción enzimática depende de la
formación del complejo [ES].
¿ Es posible regular la actividad enzimática,
modificando la interacción enzima-sustrato?

14. Enzimas Alostéricas
•Evidencia Experimental:
Threonine
-
dehydratase
L-Thr ---------> 2-Oxo-butyric acid ---> ---> --->... ---> ---> L-Ile
- Sólo la primera enzima de la vía, la “treonina-dehidratasa”, muestra este tipo de
inhibición.

16. - Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306
a) El ligando implicado en la regulación de la actividad enzimática (molécula reguladora o
efector), generalmente, es estructuralmente diferente del sustrato o el producto de la reacción
que cataliza la enzima retroinhibida.
b) La mayor parte de las enzimas
cuya actividad se controla/regula
por este tipo de regulación, no
muestran cinéticas hiperbólicas
clásicas cuando se representa v
 [S], sino que muestran una
cinética de tipo sigmoidal.
c) Es relativamente fácil distinguir entre la unión del efector a la enzima y la unión del sustrato.
Varios tratamientos químicos y físicos nos permiten “desensibizar” la enzima, es decir, hacerle
perder su respuesta ante las moléculas reguladoras o efectores sin que ello lleve parejo la perdida
de la actividad catalítica. Así en el caso de la ACTasa un tratamiento térmico, suave, da lugar a una
enzima activa no inhibible por CTP. La enzima “desensibizada” muestra una cinética hiperbólica
semejante a la que presentan las enzimas michaelianas.
d) Generalmente las enzimas que se regulan por este mecanismo son “oligómeros”, es decir,
proteínas formadas por varias subunidades iguales o distintas, unidas entre si por fuerzas débiles.

17. - Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306
1. la molécula reguladora o efector se une a un sitio de la enzima
diferente del centro activo, de manera que la interacción entre la
molécula reguladora y el sustrato tiene lugar de manera indirecta o
“alostérica”, (del griego otra estructura).
* La unión de la molécula reguladora al “sitio de
regulación” induce un cambio conformacional
reversible en la enzima que causa una alteración de
la estructura del centro activo y los consiguientes
cambios en sus propiedades cinéticas.

18. Aspartato transcarbanilsa

19. Regulación Alostérica de la función enzimática

20. Inhibidores y activadores
alostéricos
1.0
Y
(+ Activador)
0.8
V+
0.6
(sin efectores)
V0
0.4
(+ Inhibidor)
0.2
V-
s
0.0
0 2 4 6 8 10 12

21. Los efectores alostéricos operan sobre el grado de
cooperatividad del sistema:
- Los inhibidores alostéricos aumentan el grado de
cooperatividad
- Los activadores alostéricos disminuyen el grado de
cooperatividad; a concentraciones elevadas de activador,
la cinética pasa a ser michaeliana, y deja de ser sigmoide.

22. Modelos que permiten explicar el fenómeno de
Cooperatibidad
•Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux
•Modelo Secuencial de Koshland, Nemethy y Filmer

23. T= estado Inactivo
R= Estado activo

24. Modelo Concertado

25. Estado Inactivo= T
Estado Activo=R

26. Modelo Secuencial
Permite
explicar tanto
la
cooperatividad
positiva como
negativa

27. Enzimas alostericas de Enzimas alostericas de
clase K clase V

28. Aspartato transcarbamilasa