Este documento proporciona una introducción al citómetro de flujo, su historia, aplicaciones y funcionamiento. Explica que el citómetro de flujo mide partículas biológicas en suspensión celular y puede cuantificar componentes como el ADN a través de la fluorescencia. También describe los componentes ópticos y electrónicos clave de un citómetro de flujo y los diferentes tipos de fluorocromos utilizados para marcar células y moléculas.

1. BUAP
Facultad Ciencias Químicas
-Análisis EspectrofotométricosNeftalí Pérez Pérez
Catedrático: Dr. Ulises Peña Rosas
TLQ

2. Introducción

Iniciada en los 60’s como
importante avance (medir y
contar partículas y células)
Citómetro de flujo (CMF):
Mide partículas biológicas
en suspensión celular.
Sorters: Mismas
capacidades, solo que
pueden separar partículas
especificas.

3. Historia

Moldavan (1937)
•Primer contador
automático.
•Un microscopio con un
capilar (problemas) y
contador fotosensible.
Crosland & Taylor
(1953)
•Cámara de flujo con
inyección de muestra.
•Diámetro del capilar
mayor enfoque (hoy en
día).
1967-69 Van Dilla
•Mejora la cámara de
Crosland/Taylor, pero
aplica a procesos
biomédicos.
•Demostró la
cuantificación por
fluorescencia de ADN.

4. Aplicaciones

Características estructurales y funcionales de células.
Sus aplicaciones son fundamentalmente científicas y
de investigación clínica (biología y medicina).
Identifica antígenos celulares por inmunofluorescencia,
contenido del ADN, y fases del ciclo celular.

5. CMF en el mundo

Biomedicina
Hematología: Contaje celular, fórmula leucocitaria,
análisis de medula ósea y conteo reticulocitario.
Farmacología: Estudios de cinética celular.
Inmunología: Subpoblaciones T, tipaje celular,
estimulación linfocitaria.
Oncología: Diagnóstico/pronóstico, monitorear
tratamientos.
Bacteriología: Diagnóstico bacteriano y vírico,
sensibilidad a antibióticos.
Genética: Cariotipo, diagnóstico de portador,
diagnóstico prenatal.

6. Características generales de un
CMF 1

Sistema óptico
• Basados en una fuente de iluminación
laser, perpendiculares al paso de la
muestra (elimina ruido).
• La fluorescencia se recoge a 90º (espejo
90%)
Fuentes de luz
• Sintonizables o de emisión fija (Argón o
Kriptón).
• Lámparas de Hg o Xe (decrece con el
tiempo)
Detectores
• Fotomultiplicadores (PMT): Detectan la
señal a 90º con buen ratio señal/ruido.
• Diodos: Detecta Dispersión frontal de la
luz (señales fuertes).

7. Características generales
de un CMF 2

Cámaras de flujo
•Laser: Cerradas flujos
laminares lentos y
menor ruido (coágulos)
y abiertas o de chorro al
aire.
•De arco: Hay varios
tipos y cada uno tiene su
complejidad.
Sistemas de
inyección de
muestra
•Por Presión: Mantiene
una velocidad constante.
•Por inyección
isovolumetrica: Con
jeringa y mantiene
velocidades bajas.
Componente
electrónico
•Los pulsos de los
fotodetectores van de un
amplificador, a un
conversor digital.
•Existe la posibilidad de
un ‘’umbral de señal’’.

8. Configuración óptica de
un Citómetro de flujo


9. Configuración óptica de un Sorter


10. Proceso de muestra

Tinción
•Fluorocromos
que se unen
específicamente
a un
constituyente
celular.
Inyección
•En un flujo
laminar y pasan
una por una a
un punto
iluminado por
un laser.
Señal
•Dependiendo de
su contenido de
fluorocromo,
emitirán una
señal
fluorescente
(individuales).

11. Que puedo meter ahí?

Sangre periférica, médula
ósea y otros fluidos
biológicos.
Tumores sólidos o
muestras parafinadas,
requieren de disgregación
intensa (enzimas).
Soluciones con
concentración bacteriana
desconocida.

12. Fluorocromos

Método sensible
Uso I
Uso II
Estructura,
función y
vitalidad de las
células.
Unión covalente
del fluorocromo
a componentes
específicos
celulares.
Fluorocromos
que varían sus
características
en función del
microambiente
que les rodea.

13. Ejemplo


14. Propiedades ideales de un fluorocromo

¿Que te hace
fluorocromo?
Alto coeficiente de extinción a la λ de excitación
(probabilidad de absorber luz).
Alto rendimiento cuántico (emisión de luz)
Elevada fotosensibilidad
Corto estado de excitación (si estará unido a algo, debe ser
insensible a cambios de pH, polaridad y microambiente).

15. Marcadores fluorescentes de unión
covalente

Uso:
•Reaccionan y marcan proteínas, lípidos u otras moléculas biológicas.
•Altamente selectivos y reactivos.
Se emplean:
•Cromóforos con grupos isotiocianato, clorotrizinil y esteres de succinimida.
•Fluoresceína y ficoeritrina (Gran absorción y rendimiento, puede excitarse a
488nm pero emite mas allá de ese espectro/doble análisis).
Detección:
•Anticuerpos conjugados (cada uno con diferente marcador).
•Tinción de células cancerígenas.

16. Fluorocromos de unión no
covalente

Debido a su especial composición, se unen a
determinados componentes moleculares.
Marcadores ADN/ARN O Bases: Hoechst33342
(A-T), CromomicinaA3 ( G-C), mitramicina (GC) naranja de acridina (ADN y ARN dif. λ).
Marcadores de potencial de membrana:
Cianinas y rodamina123, marcan mitocondrias
debido a su alta interferencia en potencial de
membrana.

17. Sensibles a su micro-entorno

Estiman las prioridades
del ambiente (espectro de
absorción)
pH(6-carboxifluoresceina), potencial
redox(diclorofluoresceína)
Actividad
enzimática(substratos),
polaridad (anilinonaftalina-sulfato)

18. El inmunofenotipaje (perfil de alergias)

Proceso de
diferenciación
celular
Productos del
gen
Gen de
desarrollo
Superficie
celular
Gen de función
Intracelulares
(caracterizar
sub-poblaciones)

19. Respuesta inmune

Antígeno entra al
organismo
Linfocitos B
segregan Ig (una
parte)
Neutralizan a una
sustancia especifica
Fab (especificidad)
Fc
(región constante)
terminaciones
Gran especificidad
(pequeñas
diferencias
estructurales)
Anticuerpos
Fluorocromo (se une
con el anticuerpo),
puede marcar varios
y no daña la célula..

20. No sabía que era alérgico…


21. Procedimientos técnicos


22. Incremento de la señal/ruido

Aumento de la señal fluorescente (lecturas
precisas)
Antisueros: Mezcla de Ig después de coagular, fusionadas con marcador y
antígenos puros.
Tinción inmunofluorescente: técnicas directas (poco background y baja
fluorescencia) o directas (aumenta background, pero es mayor la fluorescencia
con unión).
Fluoresceína (FITC), para IgA.

23. Resultados


24. Almacenaje de muestras

Deben ser almacenadas, inmediatamente
después del análisis inmunofenotípico.
• Se deben de guardar en condiciones criogénicas.
En medios de cultivo con 0.1% de NaH3
(amoniaco) en hielo a 4ºC.
• Se puede (no se precisa viabilidad celular), fijar con
paraformaldheido y guardar a 4ºC en cámara oscura.

25. 

26. Bibliografía

 http://web.udl.es/dept/medicina/sedaicmf/sedai/
imf.htm Responsable del artículo: SEDAI de
Citometría. Rovira Roure 80.02198 Lleida
+34973702208
 Técnicas de fluorescencia en microscopía y
citométrica Escrito por Andrés Sampedro,J. R. de
Los Toyos,Ángel Martínez Nistal
 Bioquímica clínica y patología molecular. I,
Volumen 1 X. Fuentes Arderiu