El documento describe el principio de la fluorescencia, donde las moléculas absorben energía de fotones de una fuente externa y luego emiten fotones al liberar energía. Explica la inmunofluorescencia, que utiliza anticuerpos marcados con fluorocromos para detectar antígenos. Detalla el protocolo de inmunofluorescencia, incluida la preparación de muestras, fijación, permeabilización, bloqueo e inmunotinción. Finalmente, discute aplicaciones como diagnóstico y clasificación celular, así

1. Marco
Teórico
Principio de fluorescencia
La fluorescencia tiene lugar cuando las moléculas
fluorescentes absorben fotones procedentes de una fuente
externa (una lámpara incandescente o un láser, por
ejemplo), estas moléculas se excitan por la absorción de
energía radiante, durante el estado de excitación las
moléculas pierden una determinada energía en forma de
calor, y luego pierden la energía restante mediante la
emisión de fotones.

2. Principio de
fluorescencia
De la radiación emitida se puede
medir la intensidad y se puede
determinar el tiempo de vida. El
tiempo de vida se refiere al tiempo
promedio que dura la molécula en
su estado de excitación antes de
emitir un fotón.
En la figura pueden observarse las
señales E(t) y F(t), modulante de las
intensidades de excitación y
fluorescencia respectivamente.

3. Principio de
fluorescenci
a
• La intensidad de la señal emitida por fluorescencia viene dada por:
• 𝐹 𝑡 = 𝐵 cos(2𝜋𝑓𝑡 − 𝜃) (1)
• Donde:
• 𝐵: amplitud de la señal de emisión de fluorescencia.
• 𝜃: es el desfasaje entre las señales de excitación y emisión y
viene dado por:
• 𝜃 = tan−1
(2𝜋𝑓𝜏) (2)
• Donde:
• 𝑓: es la frecuencia de la señal que modula la intensidad de la
radiación de excitación.
• 𝜏: es el tiempo de vida de la fluorescencia.
• Determinado el desfasaje 𝜃, se determina 𝜏 mediante la ecuación (2).

4. Inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia es
una potente técnica que
utiliza anticuerpos marcados
con fluorescencia para
detectar antígenos
específicos. Se utiliza
ampliamente tanto en la
investigación científica como
en los laboratorios clínicos.

5. Fluorocrom
os
Los fluorocromos son sustancias
químicas fotorreactivas que pueden
absorber energía mediante la
interacción de un electrón orbital en
la estructura atómica de la molécula
con un fotón de luz.

6. Tipos de
inmunofluorescen
cia
Inmunofluorescencia directa o primaria
La inmunofluorescencia primaria, o directa, utiliza un
único anticuerpo unido químicamente a un
fluorocromo. El anticuerpo reconoce la molécula
objetivo y se une a ella, y el fluorocromo que lleva
puede detectarse mediante microscopía.

7. Tipos de
inmunofluorescen
cia
Inmunofluorescencia indirecta o secundaria
La inmunofluorescencia secundaria, o indirecta, utiliza dos
anticuerpos; el primer anticuerpo no marcado (primario) se une
específicamente a la molécula objetivo, y el anticuerpo
secundario, que lleva el fluoróforo, reconoce al anticuerpo
primario y se une a él. Varios anticuerpos secundarios pueden
unirse a un solo anticuerpo primario.

8. Protocolo de
inmunofluorescencia
El protocolo de inmunofluorescencia varía en dependencia de
muchos factores, sin embargo y en líneas generales, engloba
una secuencia lineal de pasos que consisten en:
• Preparación de las láminas y de las células
• Fijación de las muestras
• Permeabilización
• Bloqueo
• Inmunotinción o inmunomarcaje
• Montaje y observación

9. Preparación
• De las muestras
• La preparación de las muestras dependerá de su
naturaleza y del tipo de experiencia a realizar.
• De las láminas
• Las láminas empleadas para la observación
microscópica, donde posteriormente serán fijadas las
células para los tratamientos correspondientes aguas
abajo, también deben ser preparadas cuidadosamente

10. Fijación de
las
muestras
Este proceso consiste en
inmovilizar las proteínas que se
encuentran en el interior celular
con la finalidad de mantener
intacta su ubicación espacial. Las
moléculas que se emplean deben
ser capaces de atravesar todos
los tipos de membranas celulares
y de formar entramados con las
proteínas covalentes

11. Permeabilización
Dependiendo del tipo de ensayo
que se realice será necesario
permeabilizar o no las células en
estudio. Si lo que se busca es
conocer la ubicación, presencia o
ausencia, de determinada
proteína en la superficie celular,
la permeabilización no será
necesaria.
Bloqueo
Un paso fundamental en todas
las técnicas inmunológicas es el
bloqueo. En esta etapa del
procedimiento, el bloqueo
consiste en cubrir, en las láminas
sensibilizadas, todos los sitios
con moléculas de poli-lisinas a los
que no se adhirieron células. Es
decir, previene cualquier unión
inespecífica.

12. Inmunotinción o
inmunomarcaje
El procedimiento de inmunotinción o
inmunomarcaje dependerá principalmente si
se trata de una inmunofluorescencia directa
o indirecta.
Si se trata de una inmunofluorescencia
primaria o directa, las muestras se incubarán
con los anticuerpos deseados, que deberán
están acoplados a los tintes fluorescentes.
Cuando el caso es el de una
inmunofluorescencia secundaria o indirecta
deben realizarse dos incubaciones
consecutivas.

13. Montaje y observación
Durante el tiempo de incubación final
con los fluoróforos es necesario que
las muestras permanezcan en la
oscuridad. Para la observación al
microscopio es común emplear
algunas sustancias para la
preservación de la fluorescencia de
los fluoróforos acoplados a los
anticuerpos.

14. Microscopia de
inmunofluorescenci
a
Las funciones básicas de un
microscopio de fluorescencia son
suministrar energía de excitación al
fluorocromo o fluorocromos del
espécimen a investigar, separar la
luz de fluorescencia emitida, mucho
más débil, de la luz de excitación, y
enviarla al detector, donde se genera
una imagen de alto contraste como
se observa en la figura.

15. Aplicaciones
Secciones de tejido
La histología y la
citología pueden
aplicarse a una gran
variedad de tejidos y
tipos de células,
procedentes de
organismos o de
cultivos celulares.
Diagnóstico
Las principales
aplicaciones de la
inmunofluorescencia
para el diagnóstico
clínico se encuentran
en los campos de la
oncología y la
inmunología.
Clasificación celular
La clasificación de
células basada en
un patrón de
inmunofluorescencia
específico es una de
las principales
aplicaciones de la
citometría de flujo.

16. Inconvenientes y
limitaciones
Al igual que la mayoría
de las técnicas
fluorescencia, un
problema muy
significativo con la
inmunofluorescencia es
el fotoblanqueo.