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- 1. Sección de Carga Viral 22.06.15 – 03.07.15 Vanessa Sayuri Hayashi
- 2. Proceso • Preparación de muestras • Rotular tubos, separar plasma y buffy coat • Escribir información en el libro • Uso del equipo Abbott m2000sp • Preparar reactivos, pipetear muestras • Agregar información en el programa • Uso del equipo Abbott m2000rt • Revisar que no haya contaminantes • Análisis y revisión de resultados • Verificar que resultados concuerden con el historial del paciente (ej. medicamentos recetados) • Firmar y unir resultados de carga con los de CD4
- 3. Real time, Tiempo real Las maquinas m2000sp y m2000rt operan en tiempo real Tiempo real ◦ Cambios se detectan durante el proceso, en vez de solo el producto final ◦ El sistema operativo detecta en intervalos de milisegundos (información fluida)
- 4. Real time, Tiempo real Principios de Taqman
- 5. Real time, Tiempo real Las maquinas m2000sp y m2000rt operan en tiempo real Tiempo real: concentraciones altas son detectadas más rapido Línea de Detección
- 6. m2000sp Reactivos Solución de lisis Wash 1 Wash 2 Micropartículas Diluente
- 7. Amplificación de ADN bacterial Bacterias del estomago de A. Aegypti Estudios para saber el mecanismo que brinda resistencia al dengue virus
- 8. Amplificación de ADN bacterial Muestras 1-3 y control positivo amplificó bien salvo a un poco de mancha (un poco de ADN degradado). El control negativo y la mezcla de reactivos no amplificó, lo cual era esperado porque no contenían ácidos nucleicos. MWM 1 2 3 CN R MWMCP
- 9. Desconocido
- 10. Métodos QIAamp Viral RNA mini spin para la extracción de ARN RT-PCR/RFLP Digestión utilizando HaeIII Digestión utilizando MspI Electroforesis en gel (3 veces)
- 11. Digestiones con Enzimas HaeIII y MspI son endonucleasas que cortan ADN en lugares donde encuentran una secuencia especifica Depende del serotipo, la secuencia se encuentra en lugares diferentes Resulta en fragmentos de ADN de diversas longitudes
- 12. Resultados MWM 1 2 3 CN R MWM MWM: Escalera de peso, 1-3: Amplicones de muestras, CN: Control negativo (ddH2O), R: Mescla de reactivos. Solo 1 y 2 mostraron presencia de ADN amplificado. No hubo contaminación entre muestras.
- 13. Resultados MWM 1 2 MWM Electroforesis después de digestión por enzima HaeIII. Muestra 1: No se digirió (950bp) Muestra 2: Bandas en 750bp, 550bp, 180bp DENV-4 (580bp, 170bp) Aparece banda en 800bp pero no está listada
- 14. Resultados MWM 1 Electroforesis después de digestión por enzima MspI. Muestra 1 se digirió y tubo bandas en 750bp y 220bp. DENV-1 (620bp, 220bp)
- 15. Discusión Mutantes posiblemente de serotipo 2 Esta imagen es un ejemplo. No tengo la foto original, pero se veía parecida a ésta.
- 16. Sección de Citometría 06.07.15 – 17.07.15 Vanessa Sayuri Hayashi
- 17. Proceso Servir 450uL de solución de lisis (incubar por 15 min) Solución de lisis: lisa los globulos rojos pero no los linfocitos Servir 50uL de muestra de sangre entera (incubar por 15 min) La muestra no puede estar coagulada, y debe utilizar EDTA Verificar que las perlas del tubo se hayan disuelto Perlas del tubo: contienen perlas fluorecentes Servir 20uL de Tritest a los tubos Trucount Tritest: contiene anticuerpos etiquetados con fluorochromos
- 18. Control de calidad FACSCalibur necesita calibrarse cada vez que se prende Tubo A: microesferas sin marcar Tubo B: microesferas FITC, PE, PerCP
- 19. Citometría de flujo Meta: Contar número de linfocitos CD3, CD4 y CD8 Se etiquetan con Tritest ◦ Linfocitos CD3 con PerCP, CD4 con FITC, y CD8 con PE FACSCalibur ◦ Pasa la muestra, una celula a la vez, por laser ◦ Detecta tamaño, forma, complexidad e intensidad de florecencia ◦ Produce un plot de acuerdo con esta información, y categorisa los linfocitos
- 20. FACSCalibur
- 21. Detección Forward scatter: tamaño Side scatter: complexidad Fluorescencia: tipo de celula
- 22. Calculos FACSCalibur cuenta número de eventos de limfocitos T y de perlas Del número de eventos, se calcula el número de eventos de CD4, CD8 y CD3 La proporción entre número de perlas y de sus eventos se compara con el número de limfocitos y de sus eventos
- 23. Cálculos Dado ◦ Eventos de limfocitos T = 2,000 ◦ Percentaje de eventos de CD4 = 60% ◦ Número de perlas = 48,600 ◦ Número de eventos de perlas = 1,300 ◦ Volumen de sangre = 50uL Cálculo ◦ Número de eventos CD4 = 2,000*0.6 [1,200] ◦ 48,600 : 1,300 = x : 1,200 x = 44,862 [897cel/uL]
Notas del editor
- Voy a presentar lo que he aprendido en las dos semanas de pasantía en la sección de carga viral.
- Me presentaron el proceso general de carga viral, detallado aquí. Primero se escribe la información de cada paciente en el libro según las solicitudes, y en los tubos se separan el plasma y buffy coat. En carga se utiliza 1mL de plasma. Se pueden utilizar menos cantidades, pero se requeriría rehacer la calibración y tendría menos sensibilidad para detección. Se utiliza el Abbott m2000sp para extraer el ARN viral y m2000rt para amplificar el ADN y cuantificar la carga viral. En el análisis y revisión de resultados, es importante verificar que los resultados de la prueba concuerden con el historial del paciente: por ejemplo, es probable que la carga viral haya incrementado desde la última prueba si el paciente no tomó medicamentos. Finalmente se firman los documentos y los resultados de carga viral se unen con los de CD4 para liberarlos a los pacientes. En la base de datos se pueden visualizar ambos resultados a la vez.
- Las maquinas utilizadas operan en tiempo real. Esto significa que los cambios se detectan durante el proceso, en vez de solo el producto final. El sistema operativo detecta en intervalos de milisegundos, lo cual genera graficas con información fluida.
- El sistema que utiliza m2000rt es tiempo real con Taqman. Taqman es un oligonucleotido etiquetado con una particula fluorescente y un “quencher” que a proximidad de la particula no deja que el color fluorescente brille. Este oligonucleotido encuentra una secuencia complementaria y se adjiere a ella. La polimerasa pasa y remplasa el oligonucleotido por nucleotidos normales, lo cual causa que la parte fluorescente se separe del quencher. Esto lo deja brillar y ese brillo es detectado por la maquina.
- Depende de cuando la intensidad del brillo pasa el la línea de detección, la maquina calcula la cantidad de ácido nucleico original. Las graficas generadas se ven parecidas a éstas. Como se puede observar, las curvas rojas que indican altas concentraciones son detectadas más rápido, comparado con las curvas azules y moradas.
- El m2000sp utiliza materiales parecidos a los que se usan en extracción de ARN manual, pero también usa macropartículas con las que jala los ácidos nucleicos para aislarlos.
- Durante la pasantía, tuve oportunidad de utilizar bacterias del estomago de Aedes Aegypti para amplificar su ADN. Originalmente estas bacterias se utilizaron para saber el mecanismo que le brinda resistencia al dengue virus, ya que el mosquito vector no desarrolla problemas al ingerirlo.
- El proceso es similar a las amplificaciones de ADN viral, así que no hablaré de ello porque sería repetitivo. El resultado de la electroforesis de los amplicones se muestra aquí. Muestras 1-3 y control positivo amplificó bien salvo a un poco de mancha que indica un poco de ADN degradado. El control negativo y la mezcla de reactivos no amplificó, lo cual era esperado porque no contenían ácidos nucleicos. Las bandas que se ven abajo son los primers, ya que no se purificaron las muestras previamente.
- La amplificación de ADN bacterial era una practica para mejorar mis técnicas de laboratorio antes de empezar el proyecto individual. En este proyecto, me presentaron un articulo sobre los serotipos de Dengue virus que tendría que replicar.
- Desde el articulo extraje estos pasos. Entonces compararía el resultado de la electroforesis en gel con los de la foto en el articulo.
- En este experimento se utilizaron dos tipos de endonucleasas: HaeIII y MspI. Éstas endonucleasas tienen función de cortar el ADN en lugares donde encuentran una secuencia especifica. HaeIII corta donde hay una secuencia de GGCC y MspI donde hay CCGG. Depende del serotipo, la secuencia se encuentra en lugares diferentes. Esto resulta en fragmentos de ADN de diversas longitudes, y por lo tanto una forma de bandas de electroforesis diferente.
- Este fue el resultado de electroforesis después de amplificar pero antes de la digestión con enzimas. Esto presenta que las muestras 1 y 2 tenían virus presente mientras que la muestra 3 probablemente fue tomada cuando ya la viremia había reducido. Esto pasa porque la viremia baja después de 4 a 6 días cuando empiezan a aumentar los anticuerpos IgG y IgM.
- Después de digerir las muestras 1 y 2 con la enzima HaeIII, estos fueron los resultados. La muestra 1 no se digirió y el ADN se quedó en longitud de 950 bases. La muestra 2 se digirió y mostró bandas de 750, 550 y 180 bases. Estas fueron más cercanas a las del serotipo 4, porque el articulo señalaba que tenía bandas de 580 y 170 bases. Además, aunque no fue explícitamente indicada, la foto del articulo mostró una banda delgada de 800 bases.
- Luego se digirío la muestra 1 con MspI y como se esperaba, las bandas fueron de longitudes cercanas a las del serotipo 1.
- Otra muestra fue analizada en virología y obtuvieron resultados como el que se ve aquí. Como no correspondía a ningún serotipo según el articulo, se concluyó que es posible que sea un mutante y que sea del serotipo 2 porque él tiene mutaciones frecuentemente. Esto indica que aunque mis muestras pudieron analizarse con el método del articulo, el método no se podría utilizar si las muestras contienen serotipos mutantes. Pero como los serotipos 1, 3 y 4 no tienen mutaciones frecuentemente, el método es simple y seguro para distinguir entre estos serotipos.
- Voy a presentar lo que he aprendido en las dos semanas de pasantía en la sección de citometría.
- El proceso es como sigue: primero se le agrega 20uL de reactivo Tritest a los tubos Trucount. El tritest contiene anticuerpos etiquetados con fluorochromos, los cuales después se adjieren a los limfocitos. Luego se verifican que las perlas del tubo se hayan disuelto. Estas perlas contienen perlas fluorescentes que estan previamente cuantificadas. Después se sirve 50uL de muestra de sangre entera, y se incuba por 15 minutos en oscuridad. Las muestras recibidas deben contener EDTA como anticoagulante, y uno debe cerciorarse que no esten coaguladas. Entonces se sirve 450uL de solucion de lisis, que tiene funcion de lisar los globulos rojos pero dejar intactos los limfocitos, y se dejan incubar por 15 minutos. Finalmente se monta en el equipo FACSCalibur.
- Además del control de muestra que utiliza tres tubos con sangre de una persona sana, se hace una calibración para control de calidad. Esto se realiza comparando un tubo con microesferas sin marcar, y otro que contiene microesferas FITC, PE y PerCP, las cuales son los marcadores fluorescentes que etiquetan los linfocitos.
- La meta de citometría de flujo es contar el número de linfocitos CD3, CD4 y CD8. Para esto, primero se etiquetan con los anticuerpos que contiene Tritest. Estos anticuerpos están etiquetados con fluoroforos PerCP, FITC y PE. Se podrían haber utilizado diferentes fluoroforos con la condición de que emitan diferentes ondas de color, pero Tritest utiliza estas. PerCP se adjiere a los receptores CD3, FITC a los CD4 y PE a los CD8.
- Gracias por su atención.