1. Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
Autor:
Byron Rafael Larios Alemán

2. Objetivos
Describir el proceso de la reacción en cadena de la
polimerasa o PCR.
Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una
PCR.
Explicar las aplicaciones de este proceso en el campo clínico

3. Definición
La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es una técnica
que permite replicar entre
cientos de miles y millones de
veces, en el transcurrir de pocas
horas e in vitro, pequeñas
cantidades de ADN.

4. Desarrollo
La reacción en cadena de la polimerasa fue desarrollada en
1983 por el Doctor Kary Mullis. El Dr. Mullis recibió en
1993 el Premio Nobel de Química por este descubrimiento.
Al recibir el premio dijo esto: “Antes del la PCR, el DNA era
largo y fibroso, en absoluto molecular… Yo había resuelto uno de
los principales problemas de la química del DNA en un solo paso:
abundancia y distinción”
Cabe destacar que, antes de la PCR existían métodos para
aislar fragmentos de DNA basados en la clonación, pero estos
métodos resultaban mucho más costosos en tiempo y en
dinero.

5. ¿Qué componentes son necesarios
para la PCR?

6. Proceso de la PCR
El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir
de la siguiente forma: partiendo de un ADN molde, una
enzima, la ADN Polimerasa incorpora nucleótidos
complementarios a partir de la zona de doble cadena
originada por la unión de los cebadores al molde. El proceso
se da en tres fases: Desnaturalización, hibridación y
elongación.

7. Desnaturalización
Ocurre cuando las dos cadenas de ADN se separen. Se lleva a
cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC. La re
naturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

8. Hibridación
Los cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias que
flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza
gracias a la bajada de la temperatura (35-65º C) Esto permite
que los cebadores se unan por complementariedad al ADN
molde.

9. Especificidad de la reacción de la PCR
La especificidad de la PCR depende, fundamentalmente, de
la temperatura empleada en la fase de hibridación y de la
cantidad de iones divalentes que se incorporan a la reacción
(además de depender de la secuencia de los cebadores).
 Por una parte, cuanto mayor sea la temperatura utilizada en
la fase de hibridación, más específica es la reacción. Por otra
parte, en un determinado rango, incrementos en la
concentración de MgCl2 hacen disminuir la especificidad de
la reacción.

10. Elongación o Extensión
Se produce la síntesis de una cadena sencilla en la dirección 5´->
3´ mediante la enzima ADN polimerasa, la cual incorpora los
desoxinucleotidos fosfato presentes en el medio siguiendo la
cadena molde. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase
depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq
polimerasa la temperatura de elongación suele ser de 72ºC.

11. ¿Qué se ha obtenido tras un ciclo de
PCR?
Únicamente una copia de un pequeño
fragmento del ADN molde.
El tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se
encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo.

12. ¿Cómo se limita el tamaño de los fragmentos
generados?
Sabemos que en el primer ciclo, los fragmentos generados no
tienen el mismo tamaño: la copia de cada una de las cadenas
se inicia, a partir del extremo 3’, en el punto en el que el
cebador hibrida con el ADN molde y termina en el momento
en el que la enzima polimerasa no es capaz de añadir más
nucleótidos. Entonces, ¿Cómo se limita? La PCR se completa
repitiendo entre 25 y 35 veces las tres fases descritas
previamente, es decir, realizando entre 25 y 35 ciclos.
El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en
cadena" da lugar a la amplificación geométrica del
segmento de ADN delimitado por los primers.

13. ¿Cuántos fragmentos se generan durante la
reacción de PCR?
Al final del proceso se obtiene aproximadamente una cantidad de
fragmento igual al producto de la cantidad inicial de ADN
molde por 2n, siendo n el número de ciclos. Como dato para
apreciar la cantidad de copias que se generan, en el ciclo 20 se
ha multiplicado por más de un millón la cantidad inicial de
ADN molde.

14. ¿Cómo se prepara?

15. 1. Primero se prepara la mezcla de reacción (en cantidad suficiente
para todas las muestras) que contenga todos los componentes de
la PCR, a excepción del ADN molde.
2. Una vez preparados los tubos de reacción se introducen en el
termociclador.

16. Aplicaciones médicas
En Oncología, la detección de translocaciones, mutaciones,
deleciones, etc., aporta un método más objetivo y sensible al
establecer un diagnóstico, dado que el estudio «clásico» de
las neoplasias se fundamenta en la identificación
histopatológicade células malignas las cuales, sin embargo,
sereconocen sólo si al menos 1%-10% de las células son
neoplásicas.

17. También, es la identificación de ciertos genes asociados a
diferentes enfermedades familiares como la fibrosis quística, la
distrofia muscular de Duchenne y otras muchas.
En la serología o el estudio histopatológico de las muestras, la
amplificación de ácidos nucleicos por medio de la PCR aporta
grandes ventajas, como son una gran sensibilidad diagnóstica, así
como una elevada especificidad. Uno de los ejemplos
paradigmáticos de la utilidad clínica de la PCR es el diagnóstico
de la encefalitis por el virus herpes simplex.
La PCR ha ayudado a establecer el pronóstico de distintas
infecciones por medio de la determinación cuali/cuantitativa del
virus de la hepatitis C o por medio de la determinación de la
viremia plasmática en la infección por el VIH, en la que está
reconocida la importancia de la determinación de la carga vírica
en sangre en el pronóstico de la infección y también en la
evaluación del tratamiento.

18. Otros usos
Biotecnología y Ciencias agropecuarias
Secuenciación de ADN
Estudios de evolución molecular

19. Conclusión
Describimos que la PCR, es el proceso el cual permite
replicar muchas veces el ADN in vitro.
Las fases de la PCR son: Desnaturalización, Hibridación y
elongación.
Explicamos que la PCR es muy útil tanto para enfermedades
genéticas, prenatales y oncológicas. Además se aplica en las
ciencias agropecuarias y por supuesto, en la Biología
molecular.

20. Bibliografía
Santambrosio, Eduardo “PCR (Polymerase chain reaction)
Reacción en cadena de la polimerasa” Universidad
Tecnológica Nacional,
Pérez de Castro, Ana María “Reacción en cadena de la
polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR)” Universidad
Politécnica de Valencia.
Diazaraque, R; Pacheco, R; Roiz, J.C “Reacción en cadena
de la polimerasa. Fundamentos y aplicación en Medicina
Interna” Comentarios Clínicos, Hospital Universitario de La
Paz, Madrid.

21. Muchas Gracias…