Este estudio evaluó el efecto de un nuevo tratamiento basado en el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) en un modelo canino de cáncer transmisible. Diez perros con sarcoma venéreo transmisible recibieron inyecciones semanales de NDV directamente en el tumor, lo que resultó en una reducción del tamaño del tumor del 37% al 99% sin efectos secundarios. Las células tumorales cultivadas in vitro y expuestas a NDV mostraron un aumento de la apoptosis y necrosis, con una carga viral de NDV de 5x107

1. EVALUATION OF THE EFFECT IN VIVO AND VITRO OF A NEW THERAPY BASED ON
NEWCASTLE DISEASE VIRUS (NDV) IN A TRANSPLANTABLE CANINE CANCER MODEL
IVAN BEST1
, CARLOS TAMO2
, EDMUNDO GALARZA2
, MARY MEDINA2
.
1
Head of Immunology Group. FARVET S.A.C.
2
Faculty of Veterinary Medicine, San Luis Gonzaga National University
Canine transmissible venereal sarcoma (CTVS) is a benign round cells neoplasm that affects
the external genitalia; it is usually transmitted during coitus by cell implantation.1
Vincristine is an
effective therapy for the treatment of canine transmissible venereal sarcoma (CTVS); however, it
sometimes has deleterious side effects, it is not specific and the time for a complete clinical
remission may vary depending on the tumor stage and host status.2,3
Newcastle disease virus
(NDV) is an avian paramyxovirus type-1 and only affects birds.4
This often fatal disease is
characterized by inflammation of respiratory tract and of either the brain or the gastrointestinal
tract.5,6
The perception that Newcastle disease virus (NDV) can replicate up to 10,000 times
better in human cancer cells than in most normal human cells has prompted much interest in
this virus as a potential anticancer agent.7,8,9,10
The aim of this study was to investigate an
alternative or adjuvant therapy using Newcastle disease virus (NDV) for the treatment of CTVS
that does not produce side effects and enhances the immune response against the tumor.
Each of ten dogs (2 males/8 females, median age=6 years, median body-weight=13.8 kg) from
an suburban area of Chincha (Ica, Peru), diagnosed with CTVS by microscopy, were weekly
injected with 2.5x108
copies/mL of a velogenic strain of NDV from turkey, directly into the tumor
(the dogs was previously tranquilized with xylazine). The tumor size was calculated through the
formula [length x width x height x π/4(cm3
)] and evaluated for 5 weeks. CTVS cells, obtained
from tumor biopsies, were cultured during 11 days and then infected in vitro with NDV at
multiplicity of infection (MOI)=1. At 4 days post-infection (dpi); the NDV viral load, as well as the
apoptosis and late apoptosis/necrosis, were evaluated by real time PCR and flow cytometry,
respectively.
At the start of the treatment, the tumor size ranged from 10.83 to 567.5 cm3
; five weeks after, a
decrease in the tumor size between 37%-99% was observed among the patients without
occurrence of adverse symptoms. 9/10 patients had a tumor reduction greater than 50%. At 4dpi
in vitro, a significant increase of apoptosis (median=13.5%) and late apoptosis/necrosis
(median=21.6%) was observed in infected CTVS cells compared to uninfected CTVS cells
(median=6.0% and median=4.8%; respectively, P<0.05). A median NDV viral load of 5x107
copies/mL was observed in infected CTVS cells.
Our results suggest that NDV is able to replicate into CTVS cells, directly inhibiting tumor cell
growth by inducing apoptosis/necrosis in vivo and in vitro.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
Evaluar la actividad oncolítica in vivo e in vitro del virus de la enfermedad de Newcastle en el
tratamiento del tumor venéreo transmisible.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:

2. Determinar los posibles efectos secundarios tras la administración del virus de la enfermedad
de Newcastle.
Determinar los efectos del Virus de la enfermedad de Newcastle en el paciente canino durante
el tiempo que dure el tratamiento oncolítico.
Evaluar el tiempo de los primeros indicios de regresión tumoral tras la medición continua del
tumor venéreo transmisible.
Evaluar in vitro el efecto oncolítico del Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) en el Tumor
Venéreo Transmisible Canino.
MATERIALES Y METODOS
La investigación se llevó a cabo en 10 pacientes caninos:
METODOLOGIA EXPERIMENTAL
TOMA DE BIOPSIA Y ADMINISTRACION DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE
Para la toma de biopsia se procedió a tranquilizar a los pacientes caninos hembras y en los
machos se les anestesió, para la recolección de tejido tumoral se extrajo seccionando un pequeño
trozo de aproximadamente 0.5cm a 1cm con la ayuda de tijera mayo o bisturí según se requiera y
cogiendo el tejido con una pinza estándar para luego depositarlo en un tubo que contiene medio
DMEM, e inmediatamente conservado en una caja isotérmica de tecnopor.
A continuación para la administración de NDV, se procedió a limpiar el Tumor Venéreo Transmisible con
torundas, se sacó de la caja isotérmica los viales que contienen el Virus de la enfermedad de Newcastle, se
extrajo la dosis necesaria para el paciente que depende del tamaño tumoral y se inyectó con una jeringa
descartable de 1mL y aguja 23G x 1 ½ ‘’ directamente en el tumor en distintas localizaciones del tumor hasta
que se agote la dosis.
Luego se evaluó la respuesta o alguna posible reacción frente a la administración del virus de la
enfermedad de Newcastle y se esperó hasta que los pacientes se encuentren estables luego de la
sedación.

3. AISLAMIENTO DE CÉLULAS DE TUMOR VENÉREO TRASMISIBLE CANINO (CTVT)
Para el aislamiento de células tumorales, aproximadamente 0.5 mg de tejido tumoral se extrajo
asépticamente y se colocó en 10 ml de medio DMEM. Para la obtención de una suspensión celular, el tejido
se disgregó mecánicamente en medio DMEM utilizando el homogenizador Medimachine (Becton Dickinson)
y filtrado una vez (tamaño de poro: 50 µm). Luego, 8 ml de la suspensión celular obtenida se colocó en 4 ml
de una solución de Percoll 42% y centrifugada a 820 g, 18°C por 25 minutos. Después de la centrifugación,
las células tumorales presentes en la interfase se separaron y se lavó 2 veces con medio DMEM.
Para el recuento del número de células viables, 10 μL de la suspensión celular se diluyó en 90 μL
del colorante azul de Trypan 0.04% (dilución 1/10). Las células fueron contadas en una cámara de
Neubauer y la concentración celular (células/ml) se ajustó a 1x106 células/ml.
INFECCIÓN DE CÉLULAS DE TUMOR VENÉREO TRASMISIBLE CANINO (CTVT) CON EL VIRUS DE
NEWCASTLE
La infección de células de tumor venéreo trasmisible canino (CTVT) con una cepa velogénica de un virus de
Newcastle (NDV) de pavo se estandarizó en cultivos primarios de 11 días a una multiplicidad de infección
(MOI) de 1. La apoptosis y/o necrosis inducida por el virus de Newcastle (NDV) se evaluó utilizando los
marcadores SYTOX AADvanced y PO-PRO1 mediante la técnica de Citometría de Flujo.
EVALUACIÓN DE LOS PACIENTES CANINOS.
Se evaluó 2 veces a la semana a los pacientes caninos donde se recolectó información: temperatura,
frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, recolección de datos, tamaño tumoral y fotos.
Se recolectó las medidas tumorales semana por semana antes de la administración del virus de la
enfermedad de Newcastle. Para comparar la regresión tumoral se usó la siguiente formula:
R= (Largo x Ancho x Altura) x π / 4
RESULTADOS
Durante el desarrollo de la investigación no se observaron ninguna reacción adversa en ninguno
de los 10 pacientes caninos, también se observó que el mayor porcentaje de regresión tumoral se
logró en la primera y segunda semana del tratamiento.
Las dimensiones tumorales de los pacientes caninos al inicio del tratamiento se encontraban entre
10.83 a 567.5 cm3
al término de la investigación se logró alcanzar de 37%-99% de regresión
tumoral (0.17 a 45.92 cm3
), el estado de ánimo de los pacientes caninos mejoro notablemente, no
se observó fiebre ni pérdida de peso, y se logró observo que el sangrado característico del Tumor
Venéreo Transmisible cesó en los 10 pacientes caninos.
En el estudio in vitro las células tumoral del TVT infectadas con el Virus de la enfermedad de
Newcastle sufrieron apoptosis y necrosis y en la placa se encontró una carga viral de NDV de
5x107
copias / mL.
Lo anterior mencionado se resume en las siguientes tablas y gráficos:

4. CONCLUSIONES
Nuestros resultados sugieren que el Virus de la enfermedad de Newcastle se replica eficazmente
en el Tumor Venéreo Transmisible inhibiendo el crecimiento tumoral mediante apoptosis y necrosis
de las células tumorales.

5. Nuevos y tentativos proyectos de investigación se ejecutarán para otros tipos de tumores y
neoplasias caninas, lo cual lograría un gran aporte científico y médico para el tratamiento de
algunas neoplasias que tienen un mal pronóstico médico.
ANEXO
BIBLIOGRAFIA
1. - Tella, M.A., Ajala, O.O and Taiwo, V.O (2004).Complete regression of transmissible venereal
tumor (TVT) in Nigerian mongrel dogs with vincristine sulfate chemotherapy. Afr.J.Bio.Med.Res.7
(3):133-138.
2. - Calvet CA, Leifer CE, McEwen EG (1982). Vincristine for the treatment of Transmissible
Venereal Tumor in the dog. J Amer. Vet. Med. Assoc. 181(2):163-164.
3. - Withrow SJ and McEwen EG (1996). Small animal clinical oncology 2 ed. Philadelphia: WB
Saunders Co. USA.
4. – D.J. Alexander and R.C. Jones (2008). ‘‘Paramyxoviridae’’, in Poultry Disease, M. Pattison, P.
MacMullin, J.M. Bradburry, and D. Alexander, Ed., pp. 294-316, Harcourt Publishers Limited, New
York, NY, USA.
5. - Alexander DJ, Allan WH: Newcastle disease virus pathotypes. Avian Pathol 3 (4): 269-78,
1974.
6. - Hanson RP: The reemergence of Newcastle disease. Adv Vet Sci Comp Med 18 (0): 213-29,
1974.
7. - Pecora AL, Rizvi N, Cohen GI, et al.: Phase I trial of intravenous administration of PV701, an
oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J Clin Oncol 20 (9): 2251-66, 2002.
8. - Schirrmacher V, Haas C, Bonifer R, et al.: Human tumor cell modification by virus infection: an
efficient and safe way to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory properties
when using Newcastle disease virus. Gene Ther 6 (1): 63-73, 1999.
9. - Nelson NJ: Scientific interest in Newcastle disease virus is reviving. J Natl Cancer Inst 91 (20):
1708-10, 1999.
DIA 1
SEMANA
5

6. 10. - Phuangsab A, Lorence RM, Reichard KW, et al.: Newcastle disease virus therapy of human
tumor xenografts: antitumor effects of local or systemic administration. Cancer Lett 172 (1): 27-36,
2001.

7. 10. - Phuangsab A, Lorence RM, Reichard KW, et al.: Newcastle disease virus therapy of human
tumor xenografts: antitumor effects of local or systemic administration. Cancer Lett 172 (1): 27-36,
2001.