Este documento presenta una introducción a los fundamentos de la biología molecular y la terapia génica. Explica que la información genética en el ADN controla todas las funciones celulares y que la expresión de genes puede variar dependiendo de la función celular. Además, resume los métodos de transporte de terapia génica como virus, nanopartículas y edición de genomas, y discute aplicaciones potenciales en oncología de cabeza y cuello, cirugía reconstructiva y otorrinolaringología.

1. FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR Y TERAPIA GENÉTICA
DR. LUIS MARTIN AGUILAR CHIRINO
OTORRINOLARINGOLOGÍA Y CIRUGÍA DE CABEZA Y CUELLO
HOSPITAL CIVIL DE CULIACÁN
CULIACÁN, SINALOA; JUNIO 2022.

2.  Fundamentos de biología molecular: Función celular y regulación a nivel
genómico.
 Expresión de genes: La información para conducir todos los aspectos de la
función celular se encuentran en las moléculas del ADN.
Introducción

3.  ADN: Cinta de 1.8m
 Empaquetada alrededor de histonas -> compresión microscópica
 La expresión genética varía dependiendo la función celular.
Introducción

4. Transcripción

5. Desórden de función
celular
Muerte celular
Proliferación celular
anormal
Cáncer
Regulación negativa
Genes supresores
tumorales
Inhibición de
proliferación celular
anormal
Mutación o pérdida Cáncer
División Celular
 Ciclo celular -> Fases de
crecimiento y reproducción =
replicación del ADN

6. División Celular
 Ciclo celular -> Típicamente dura
entre 10-25 horas.
 G1 = 4 a 24 horas
 M = 1 hora (células hija)
 S = Síntesis (replicación de ADN)
 G2 = Crecimiento y duplicación
celular
 G0 = descanso

7. Terapia de genes
 “La expresión intrínseca de ciertos genes en los tejidos del
cuerpo pueden modificarse para tratar una enfermedad.”
 Reemplazo de gen defectuoso, mejora de la expresión del
gen o supresión de la expresión de genes.

8. Terapia de genes
•Enfermedades hereditarias raras
•Deficiencia de enzimas
•Ej. Gen ADA en médula ósea para tratar niños con
inmunodeficiencia combinada severa (SCID)
Reemplazo de genes
•Tratamiento de enfermedades adquiridas
•Cáncer/artritis/aterosclerosis
•Linfocitos infiltrantes de tumor (TILs) – se introdujo
TNF -> se reinplantaron en paciente
Mejora de la
expresión •Protooncogen – RET
•Inactivación al expresar forma mutante de gen RET
•RNAi (interferencia) – “silenciador de genes”
•Logrando disminuir >90% el mRNA
•Evitando activación del sistema inmune
•Efectos fuera del objetivo -> genes con 7 bases
pares en secuencia homóloga
Supresión de
expresión

9. Terapia de genes
 Edición del Genoma: Permite añadir, remover y corregir
genes; ex vivo o envíandolas a células objetivo in vivo.
Doudna & Charpentier
Mecanismo de defensa antiviral de
origen bacteriano
Aglomeración palindrómica corta
regularmente interespaciado de
repetición (CRISPR)
CRISPR-asociadas a 9 (Cas9)
cortan las secuencias de ADN viral
Nucleasa modificada (Tijera
molecular)
Punto de quiebre en sitio
específico de ADN
Reparación mediante unión no
homóloga (NHEJ)
Reparación mediante homología
directa (HDR)
Uso de molde homólogo para la
reparación
Nucleasas con efecto parecido a
activador de transcripción
(TALENs)
Reconocen secuencias específicas
de ADN
Menos propenso a error que NHEJ

10. Terapia de genes de células somáticas vs germinales
Células somáticas
Médula ósea, hígado,
células tumorales,
músculo, piel, endotelio,
tiroides
Sin alteración del material
genético hereditario
Células germinales)
Espermatozoides y
Oovocitos
Puede prevenir
enfermedades hereditarias

11. Terapia de genes de células somáticas vs germinales
 Objetivos de terapia genética somática

12. Métodos de transporte de terapia de genes
Inyección directa
de ADN/ARN
Transferencia de
genees
Modulada
por virus
Nanopartículas
-Material
genético
-Saltar
barreras
fisiológicas e
inmunológica

13. Inyección directa de material genético
Microinyección
de plásmidos
Directo a
núcleo
Electroporación
-Células cultivadas
se exponen a ADN
con un impulso
eléctrico
Crea poros y el
plásmido de ADN
entra a la célula
 Transfección -> Plásmidos -> prolongan
el efecto silencioso de los siRNAs a 3-7
días.
Lipofección
Encapsular
los
vectores
con lípidos
catiónicos

14. Inyección directa de RNA
siRNA
locorregional
Vía subcutánea entrando a
la microcirculación
Riesgo de fagocitosis por
macrófagos.
Vía oral
-No efectiva debido
al compromiso al
pasar por epitelio
intestinal
 TALENs y CRISPR-Cas9 + gRNA objetivo -> como mRNA o complejos de proteínas
Vía
intravenosa
siRNA con objetivo en
el gen VEGF =
reducción de tamaño
tumoral y niveles de
VEFG
Envío
hidrodinámico
-Método más común
-Grandes cantidades de
RNA en bolo IV
-Presión hidrostática
disrupte el endotelio
vascular y llega a los
tejidos.

15. Transporte mediados por virus
Retrovirus Adenovirus
Asociación-
adenovirus

16. Transporte mediados por retrovirus
 Prototipo original – derivado del virus de la leucemia murina de
Moloney.
1er – Partículas virales defectuosas
con genes terapéuticos
2do – Vectores retrovirales
de integrar permanentemente el
gen en los cromosomas celulares
3er – Modificaciones en vectores
retrovirales y en línea celular con
características seguras y

17. Transporte mediados por retrovirus
 Limitación – Integración sólo en células en división activa.
 Complicaciones – Ensayo para tratar SCID ligado a X, enfermedad granulomatosa
crónica y síndrome de Wiskott-Aldrich -> leucermia a los 2.5-5 años posterior a la
terapia.
 Receptores de antígeno quiméricos (CARs) -> objetivo CD19 con remisión en
leucemia linfoblástica aguda refractaria y linfoma de células B grandes.

18. Transporte mediados por adenovirus
 Vehículos poderosos y efectivos para transferencia de genes.
 No integran genes en los cromosomas
 Ventaja – infectan mayor diversidad de células (sin necesidad de división celular)
 1ra gen – Deleción de E1a y E3 = sin replicación; los demás genes expresados desencadenan inmunidad.
 2da gen – deleción de E1a, E2a, E3 y E4 = reducción de respuestas inmune.
 Última gen – “sin agallas” – Sin genes virales.

19. Transporte mediados por asociación a adenovirus
 Los vectores AAV no son integrables = reducen riesgos de
mutagénesis y respuesta inmune innata.
 La expresión de genes es reducida relativamente en
comparación con retrovirus.
 Los vectores AAV serotipo 2 -> Sólo pueden infectar ciertas
células
 Los nuevos vectores AAV serotipo 1 -> Potencial infectante 1000x

20. Transporte mediados por asociación a adenovirus

21. Sistemas de transporte basado en nanopartículas
 Nanotecnología: “Entendimiento y control de la materia en dimensiones de 1-100nm, donde fenómenos únicos
permiten aplicaciones novedosas.”
 Nanomedicina: Uso de moléculas <200nm (nanopartículas) para la construcción de propiedades específicas y
liberación de características que mejoran el transporte, absorción o encapsulamiento de medidas terapéuticas.

22. Sistemas de transporte basado en nanopartículas
 Nanopartículas lipídicas = <100nm, son las más comúnmente utilizadas.
 Liposomas sensibles a pH = creados para liberar el contenido en
microambiente ácido -> tumores
 PEG – estabiliza el complejo siRNA-liposoma
 Nanopartículas + PEG -> uso para neuroblastomas
 Nanopartículas sólidas lipídicas -> transporte de medicamentos hidrofílicos
e hidrofóbicos
Nanopartícula
Lípido/polímeros
Cubiertas de
polietileno glicol
(PEG)
Sólidas lipídicas

23. Estrategias para administración de terapia de genes
Ex-vivo In-vivo

24. Estrategias para administración de terapia de genes
 Ex-vivo: Ventaja – realizarse en laboratorio sin
exposición a paciente con vector viral
 Desventaja – Método de reimplantación.
 In-vivo: Ventaja – infectar células hepáticas, endotelio,
pulmones, tumores
 Desventaja – exposición viral del paciente.

25. Terapia de Genes
 Posibilidad de modificar: inmunidad,
crecimiento, desarrollo, regeneración y
malignidad a nivel molecular.
Terapia
de genes
Novedoso
Expresión de
sitio específico
Mayor eficacia
y eficiencia
Medicina
preventiva y
reducción de
costos
Rutas de
administración
mejorardas

26. Aplicación en Otorrinolaringología
Terapia
de genes
Enfermedades
hereditarias
Oncología de
cabeza y cuello
(SCC)
Modificación
genética de TIL
Estimulación in
vivo de respuesta
inmune
antitumor
Terapia de genes
suicida

27. Estimulación de respuesta inmune antitumor
 Introducción de genes para citoquinas en
células tumorales.
 Tumores tienen deficiencia de expresión de
antígenos MHC-1
 Transferencia del gen HLA-B7 = actividad
citolítica (fase clínica 1 contra SCC)
 Transferencia de IL-2 -> regresión tumoral
mediante estimulación de respuesta inmune
citotóxica

28. Terapia de genes suicida
 Abordaje experimental – Inyección de
herpesvirus con timidina quinasa a célula
tumoral -> susceptibilidad a quimioterapia con
ganciclovir.
 Suspendido en 1996 por falta de recursos.

29. Estrategias potenciadoras de genes
Modificación de oncogenes
y genes supresores de
tumores
Mutación en TP53 y
CDKN2A = formación de
tumores en cabeza y cuello
Correción de gen TP53 con
adenovirus
Advexin (vector INGN-201)
Uso de vectores con
adenovirus sigue siendo
controversial
Inhibición de angiogenesis
Regresión del aporte
vascular tumoral
Regresión de melanoma en
ratones
Enfoque en endostatina
Inhibición del 45.9% de
crecimiento enratones con
SCC laríngeo humano
Limitación de vida corta y
dosis repetidas
Inhibe neovascularización y
crecimiento tumoral

30. Estrategias supresoras de genes
Silenciador de genes
RNAi + técnicas de silenciador
de genes
Receptor de factor de
crecimiento epidérmico (EGFR)
Cetuximab + radioterapía
Mejoría de supervivencia en
paciente con cáncer de cabeza y
cuello
Genes inmortalizadores de
células cancerígenas
Complejo de telomerasa
humana (90% de tumores)
siRNA con adenovirus dirigido a
telomerasa humana
transcriptasa reversa (hTERT)
Inhibición marcada de
crecimiento celular con
disminución de actividad de
telomerasa

31. Terapia de replicación de adenovirus condicionada
 Infección selectiva y replicación en células tumorales objetivo con
defectos genéticos heredados (ej. TP53)
 Células tumorales con ausencia de TP53 permiten la replicación viral
que elimina a la célula tumoral hospedera y propagarse a otras
células subsecuentemente.
 Primer ensayo – Onyx-015

32. Terapia de Genes – Uso en cirugía plástica y
reconstructiva
 Estímulo de bFGF - > mejor vascularización
 Estímulo IGF-1 -> mantiene masa muscular y
reinnvervación
 Vectores adenovirales -> factor neurotrófico en
cerebro = previenen muerte de motoneuronas.
 VEGF -> mediante plásmidos con lipofectina =
mejora de la superviviencia de colgajos libres
Terapia
de genes
Mejora de la
expresión de factores
de crecimiento
Mejora de la
reparación /
regeneración celular
Mejora de la
angiogénesis y
neovascularización
Factores de
crecimiento: TGF-a,
IGF1, IGF2, PDGF,
factor de crecimiento
de nervios
Rutas de
administración
mejorardas

33. Terapia de Genes – Aplicacióin en laringología y
neurootología
 Estímulo hIGF-1 -> en músculos laríngeos de rata = incremento
del diámetro muscular y placas motoras.
 Introducción de gen GfB2 (conexina 26) -> mejoría de la
audición en ratones con hipoacusia genética hereditaria
Terapia
de genes
Apoyo en
reparación de
parálisis cordal
Tratamiento
para sordera en
fase
experimental
Fases
experimentales
en terapia de
oído interno