Nuevas tecnologías de identificación bacteriana. Jose Manuel Caro Gómez

1. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
EN MICROBIOLOGÍA
César Mauricio Ayala
Tatiana Marcela Cáceres
Jose Manuel Caro
Laura María Chaparro

2. Métodos basados en criterios morfológicos
- Microscopía ( Tinción de Gram)
Forma Cápsula Endóspora Tamaño Bordes
cocos,
bacilos,
cocobacilos
filamentosos
, bacilos
curvos, etc
presente o
ausente
ovales,
esféricas,
terminales,
subterminales
cortos
largos
abultados,
paralelos,
cóncavos,
irregulares

3. Extremos Disposición Formas Tinción
redondeados,
puntiagudos
parejas,
cadenas,
tétradas,
racimos,
etc.
variación en forma
y tamaño ramificados,
fusiformes,
etc
uniforme
irregular,
bipolar,
etc.

4. - Macroscopía

5. Métodos basados en tinción diferencial
Tinción de
Gram

6. Ziehl
Neelsen

7. Tinción de
esporas

8. Tinción de estructuras específicas
La tinción negativa revela la presencia de cápsulas
alrededor de la bacteria.
Se mezclan las bacterias con tinta china o nigrosina
y se extiende en una capa fina sobre un
portaobjeto, en el microscopio se podrá observar
que aparecen cuerpos más claros debido a que la
tinta no penetra ni la célula ni la cápsula.

9. Tinción de flagelos
Tinción de Leifson. Tiene 3 colorantes:
→ Fucsina básica en Alcohol etílico al
95%, en 1.27%.
→ Ácido tánico en agua destilada, en 3%.
→ Cloruro de sodio en agua destilada,
1.5%.
Se deja por 10 minutos.

10. Métodos basados en pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias,
estas pruebas se fundamentan en demostrar:
Degradación de compuestos.
Producción de compuestos
coloreados.
Fermentación de azúcares.
Presencia de enzimas.

11. Existen flujogramas para la identificación bacteriana, mediante pruebas bioquímicas
de microorganismos. Por ejemplo, la presencia de un cocobacilo gram negativo,
facultativo, fermentador de glucosa y oxidasa negativo, nos indica la presencia de
una enterobacteria, para determinar su género podemos seguir el siguiente esquema.

12. El tiempo necesario para la identificación de bacterias puede reducirse
considerablemente con el uso de sistemas miniaturizados basados en pruebas
bioquímicas, estos sistemas han sido diseñados para realizar varias pruebas
bioquímicas simultáneamente y permitir la identificación en un menor tiempo.
Sistemas miniaturizados

13. BBL Crystal

14. Lectura de las pruebas
Manual Computarizada

15. SISTEMAS MINIATURIZADOS API
Consisten en un dispositivo de plástico con
varios microtubos que contienen diferentes
medios de cultivo deshidratados o
diferentes sustratos de enzimas de acuerdo
al tipo de prueba requerida.
Algunas pruebas bioquímicas que pueden
realizarse con estos sistemas son:
fermentación de carbohidratos,
determinación de la producción de H2S,
determinación de la hidrólisis de la
gelatina, entre otras.

16. API® 20E
Permite la identificación de enterobacterias y de
otros bacilos gram negativos. Es una galería
conformada por 20 microtubos.

17. API® 20 NE
Permite identificar bacilos gram negativos no pertenecientes al grupo de las
enterobacterias como por ejemplo Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium,
Moraxella, Vibrio, Aeromonas, entre otros. Galería conformada por 20 microtubos.

18. API® 20 A
Permiten identificar bacterias anaerobias. Galería conformada por 20 microtubos.
Una vez inoculada la galería con la suspensión del microorganismo a identificar, el
sistema requiere ser incubado en una jarra Gaspak® u otro sistema que provea
condiciones de anaerobiosis.

19. API® STAPH
Este sistema permite la identificación de microorganismos pertenecientes al género
Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria. Es una galería conformada por 20
microtubos.

20. OTROS SISTEMAS API®
Existen otros sistemas miniaturizados API®;
entre ellos podemos señalar el API® 20
STREP, el API® CAMPY, el API®
CORYNE, el API® CANDIDA.
En la figura podemos observar el API® 50 –
CHL utilizado para la identificación de
Lactobacilos. Es una galería conformada por
50 microtubos.

21. Procedimiento
1.Tomar 3-4 colonias aisladas y disolver en 5mL de
solución salina o agua estéril.
2.Llenar con la solución bacteriana los tubos de todos
los pocillos.
3.Llenar hasta la cúpula los pocillos CIT, VP, GEL...
4.Tapar con parafina líquida las cúpulas de los pozos
ADH, LDC, ODC, URE, H2S... para obtener una
ambiente de anaerobiosis.
5.Poner la tira de pruebas en una cámara húmeda de
incubación a 37°C de 18-24 horas.

22. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Se basa en la observación de las coloraciones desarrolladas. Se compara el color
obtenido en cada microtubo con el que muestra la carta de colores y se establece un
resultado positivo (+) o negativo (-).

23. Se obtiene un código de 7 dígitos denominado “perfil numérico” que resulta de la
suma de los valores correspondientes a las pruebas positivas asignados
previamente en la planilla. En algunos sistemas miniaturizados se recomienda la
realización de pruebas bioquímicas adicionales, que permiten obtener dos dígitos
más. El código obtenido se corresponderá a un determinado género o especie de
acuerdo a la información contenida en las bases de datos suministradas por el
fabricante y que pueden encontrarse disponibles en forma impresa y/o
electrónica.

24. Con fines de control microbiológico, la USP(estándares de referencia) indica
cuales son las pruebas bioquímicas mínimas que se requieren para la identificación
de los microorganismos objetables, pero no descarta que se utilicen sistemas
miniaturizados donde se realizan un número mayor de pruebas bioquímicas.
Cada casa fabricante tiene su propia presentación, cálculos, manuales, etc.
Una limitación de este tipo de método de identificación es la aparición de cepas
mutantes y la adquisición de plásmidos que pueden dar origen a cepas con
características diferentes.
Este método también ha sido desarrollado para la identificación de levaduras y de
otros hongos.
Información importante

25. Métodos basados en tipificación de fagos
La interacción entre un virus bacteriano
(fago) y su célula bacteriana sensible es
sumamente específica, ya que el proceso
de adsorción se encuentra mediado por
receptores específicos tanto en el virus
como en la célula bacteriana.
El uso de fagos específicos permite
identificar y subclasificar bacterias
dentro de una misma especie.

26. En un agar se inocula un cultivo puro de una determinada bacteria y se añade
una alícuota de un fago específico. Éste puede ocasionar la lisis de las bacterias,
hecho que se evidencia en el cultivo como zonas claras definidas, denominadas
placas, que indican que hubo infección y lisis celular.

27. Métodos basados en pruebas inmunológicas
1.Pruebas serológicas
2.Detección de Antígenos

28. Las pruebas serológicas constituyen un método
indirecto de diagnóstico al detectar en el suero del
paciente los anticuerpos formados frente al
microorganismo causante de la infección.
Se utilizan como diagnóstico confirmatorio después de
la identificación por diferentes métodos, como los
bioquímicos.
Pruebas serológicas

29. Cada uno de los métodos tiene su
fundamento particular, pero en
general, todos se basan en la
reacción de un antígeno presente
en el agente microbiano con su
anticuerpo correspondiente.
Pueden ser de gran utilidad en la
identificación microbiana en
muestras puras o en muestras
biológicas.

30. ➔ Aglutinación directa
Se basan en la unión de antígenos particulados a los
anticuerpos. Son pruebas sensibles pero poco
específicas.
Se prepara una suspensión del microorganismo
(antígeno), y se le agrega al suero del paciente, si
hay anticuerpos, se producirá la aglutinación. Puede
realizarse sobre un portaobjetos, en tubos de ensayo
o en placas de microtitulación.
Se hacen diluciones del suero para ver el título de
anticuerpos.

31. → Aglutinación
Con anticuerpos particulados se permite la
detección de antígenos solubles.
Prueba rápida.

32. En casos de meningitis, se puede detectar en el LCR la presencia de antígenos
de Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningiditis
y de Streptococcus beta hemolítico grupo B.
Aglutinación con rosa de
Bengala empleada en el
diagnóstico de la
brucelosis.

33. ➔ Inmunofluorescencia
Pueden utilizarse para detectar anticuerpos o para detectar la presencia de un
patógeno. En ambos casos la reacción finaliza mediante la adición de un anticuerpo
conjugado a una sustancia fluorescente.
Se usa en la detección Bordetella
pertussis, Rickettsia y Chlamydia
trachomatis.
Rickettsia typhi IFA

34. ★ Directa: La muestra, se pone en contacto con el antisuero
específico marcado con una sustancia fluorescente
(rodamina o fluoresceína). Se espera un tiempo para que
se dé la reacción antígeno-anticuerpo.
★ Indirecta: Se utiliza el anticuerpo específico no marcado
y posteriormente se utiliza un anti anticuerpo marcado.
Se expone la lámina a la radiación ultravioleta para visualizar
la reacción, se observa con el microscopio de fluorescencia.

35. ➔ ELISA (ENZIMOINMUNOANÁLISIS)
Muy sensible y específica.
La reacción Ag-Ac tiene lugar sobre un soporte sólido, normalmente una microplaca
de plástico, a la que se ha adsorbido un antígeno o un anticuerpo. Si el suero posee
anticuerpos contra ese antígeno, éstos se habrán fijado a él, arrastrándose mediante
el lavado el resto de inmunoglobulinas presentes.

36. La reacción final se revela mediante un enzima
que modifica un substrato que adquiere color.
ELISPOT: Permite conocer de forma
cuantitativa el antígeno, incluso identifica el
número concreto de células donde se encuentra.

37. El color que se produce es proporcional a la cantidad de anticuerpo específico que
se fija al antígeno.
El método se utiliza en la detección de
Chlamydia trachomatis, Neisseria
gonhorreae.

38. Detección de antígenos
Detección del microorganismo por el uso de anticuerpos específicos marcados,
que pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales.
→ Aglutinación
→ Inmunofluorescencia
→ Inmunofluorescencia directa
→ Enzimoinmunoanálisis

39. Método de espectrofotometría de masas
MALDI-TOF
Consiste en una ionización suave del analito que provoca la evaporación de
moléculas termolábiles, no volátiles tales como proteínas y lípidos en un rango de
2 a 20 KDa.
Muy utilizada para obtener un espectro propio de un organismo y comparándolo
con bases de datos, identificar a nivel de género, especie e incluso cepa aislados
bacterianos y fúngicos. También es posible identificar virus.

40. En este tipo de espectrometría es de suma importancia la matriz ya que
funciona como un transmisor, transfiriendo la energía necesaria para la
ionización, del láser a las moléculas de la muestra.

41. Aplicaciones
La identificación bacteriana de acuerdo a su perfil de proteínas fue propuesta hace
décadas pero era poco usado.
Actualmente, cada vez aparecen más trabajos que han estudiado su eficacia en la
identificación de aislamientos clínicos de bacterias Gram positivas y Gram negativos
de diversos orígenes directamente desde los medios de cultivo habituales y sin
condiciones especiales, como método de rutina.

42. Se basan en la detección de proteínas ribosómicas S y L:
- Se utiliza directamente una colonia bacteriana.
- Comparan perfil o huella espectral desconocida frente a las de bacterias
conocidas.
- Comparación de espectros generados con bases de datos previas.
- Rapidez de la técnica (aprox. 90 microorganismos / hora).
- Identificación a nivel de género y especie, en ocasiones subespecies.

43. Métodos de detección molecular
PCR, Nothern blot, Southern blot, Western blot y Dot blot, RT-PCR, PCR-
ELISA
PCR in situ

44. PCR
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR permite generar una gran cantidad
de copias de un fragmento de DNA (ácido desoxirribonucleico).

47. Tipos de PCR
❖PCR anidada → el producto de una amplificación es el molde de la siguiente.
❖PCR multiplex → se amplifica más de una secuencia en una misma reacción
con el uso de varios pares de primers. Los amplificados se verán como
múltiples bandas en un gel.
❖PCR in situ → es realizada sobre secciones histológicas o células, donde los
productos generados pueden visualizarse en el sitio de la amplificación.

48. ❖PCR tiempo real → Cuantifica
la cantidad de ADN o ARN
amplificado en cada momento.
Para ello se emplea una sonda
unida a dos fluorocromos que
hibrida en la zona intermedia
entre el cebador forward y el
reverse, cuando la sonda está
intacta, presentan una
transferencia energética de
fluorescencia por resonancia,
no producida cuando la sonda
está dañada y los dos
fluorocromos están distantes.

49. ❖RT-PCR → el molde es el ARN, se usa la transcriptasa inversa para pasar
ARN a ADNc. Requiere dos tipos de cebadores, uno denominado
antisentido que inicia la reacción de RT-PCR y el cebador denominado
sentido que realiza el duplex de ADNc. Útil cuando se disponen pequeñas
cantidades de ARN.
❖Variantes de la PCR → secuenciación, pirosecuenciación.

50. → La hibridación in situ (ISH)
Es una técnica que se utiliza para la localización y la
detección de secuencias de ADN y de ARN específicas
en las células, a través de una secuencia
complementaria.
Se fundamenta en complementariedad de bases de ácidos
nucleicos. Se utilizan sondas de ADN, son secuencias de
oligonucleótidos de ADN marcados, con un elemento
radioactivo (32P,125I, 35S) o con una proteína unida a
una enzima como la fosfatasa alcalina.

51. La unión de la sonda a la secuencia complementaria se detecta mediante la señal
radiactiva que emite la sonda o mediante métodos enzimáticos.

52. → Western blot:
Se usa para identificar y caracterizar proteínas
específicas en una mezcla compleja, el reconocimiento
es por reconocimiento entre antígeno y anticuerpo, se
revela por actividad fluorescente o enzimática. Consta
de tres etapas:
1.Separación por tamaño (acrilamida)
2.Transferencia a un soporte sólido (nitrocelulosa)
3.Visualización mediante la marcación de proteínas
con el uso de anticuerpos primarios o secundarios
apropiados.

53. → Southern blot
Permite detectar la presencia de una secuencia de
ADN concreta en una mezcla compleja.
→ Se hace electroforesis en gel de agarosa con el fin
de separar los fragmentos de ADN (obtenidos con las
enzimas de restricción).
→ Se transfiere a una membrana en la cual se
efectúa la hibridación de la sonda.

54. → Northern blot
Variante del Southern blot, usada para
separación del RNA.
1.Aislamiento del RNA.
2.Desnaturalización del RNA.
3.Separación por electroforesis.
4.Transferencia a membrana de
nitrocelulosa o nylon.
5.Hibridación con sonda específica.

55. →Dot Blot
Es una técnica para detectar biomoléculas, confirma
la presencia o ausencia de una biomolécula
presuntiva. Es netamente cualitativa.
Las biomoléculas para ser detectados no son
separadas por cromatografía.
Una gota de la muestra a analizar se agrega sobre
una membrana. Esto es seguido por la detección por
sondas de nucleótidos (northern blot y southern blot)
o anticuerpos (para un western blot).

56. Equipos automatizados
El tiempo de la identificación convencional era de 24-48 hrs para permitir la
expresión de la reacción, ya que debía lograrse un número crítico de bacterias, que
dependen de su velocidad de replicación. Con la automatización se logró reducir este
tiempo a 8-10 horas, ya sea porque se detecta reacción con sustratos preformados, o
se logra visualizar la reacción bioquímica con un menor número de replicaciones,
dada la miniaturización de la reacción.
La inoculación, incubación y lectura se efectúan de modo automatizado.
InoquIA / MicroScan /Vitek I y II /Phoenix (Becton Dickinson Diagnostic System)

57. Sistema que utiliza tarjetas con reactivos
colorimétricos, que son inoculadas con la
suspensión de un cultivo puro microbiano
y el perfil de desarrollo es interpretado de
forma automática.
Las tarjetas reactivas tienen 64 pozos
con un sustrato de prueba cada uno, para
medir varias actividades metabólicas
como acidificación, alcalinización,
hidrólisis enzimáticas y desarrollo en
presencia de sustancias inhibidoras.
VITEK II

58. Se basa en las características fenotípicas del
microorganismo a nivel individual, no sólo por
grupos de familias.
Identifica mecanismos de resistencia
predeterminados e indica cuando no se
reconocen dichos mecanismos en una de las
muestras.
Su base de datos posee los patrones de
resistencia por organismo individual.
Los resultados son clasificados por colores de
acuerdo a su naturaleza.

59. MicroScan
Es un sistema que permite realizar identificación y pruebas de susceptibilidad
antimicrobiana simultáneamente, con procedimientos manuales, semi-automatizados
o automatizados.
Extensa identificación gram-positivas, gram-negativas.
Posee múltiples tipos de paneles con configuraciones de sensibilidad con CIM.
Permite una amplia selección de medicamentos que pueden ajustarse a la mayoría de
los formularios de los hospitales.

60. BD KIESTRA inoquIA
Procesador totalmente automatizado y versátil para el procesamiento de todo tipo
muestras, en todo tipo de contenedor, desde su etiquetado hasta su siembra en tubo,
placa o porta.

61. Alto rendimiento
➢Capacidad de procesar hasta 288 muestras en una carga.
➢Posibilidad de usar hasta 12 tipos diferentes de medio simultáneamente.
➢Rendimiento: Hasta 400 siembras/hora
➢Posibilidad de sembrar hasta 200 tubos por carga Siembra hasta 5 placas
simultáneamenteVersatilidad
➢Siembra Placas, Bi-Placas, Portas y tubos (Poliestireno y Cristal).
➢Posibilidad de configurar patrones de siembra personalizada.
➢Clasificación de las placas sembradas en función del protocolo

62. Rendimiento de hasta 400
inoculaciones/hora.
Rolling Bead Reutilizable
(autoclavable) hasta 10 usos: un
mínimo de costos desechables y
fungible.
Proporciona hasta 4 veces mayor
número de colonias aisladas en menor
tiempo en comparación con la siembra
manual.

63. BD KIESTRA TLA (Total Lab Automation)
Procesamiento de muestras
totalmente automatizado.
Hasta 600 siembras / h.

64. Incubadoras de O2 e incubadoras de
CO2 con capacidad desde 1.050 a
1.800 placas/incubadora.

65. Posibilidad de imágenes dinámicas: la cámara puede tomar imágenes de las
placas a intervalos de tiempo determinados (es decir, a la entrada en la
incubadora, y luego cada 6 horas) - definibles por el usuario.
Digitalización de la imagen de la placa para su lectura 24/7.
Las imágenes de placas se revisan en pantallas de ordenador.

66. Se utilizan paneles deshidratados los cuales se leen por colorimetría.
Paneles Convencionales: (16-24 hrs) Para Gram Positivos y Gram Negativos, con
un amplio rango de antibióticos en distintas configuraciones
Paneles Cromogénicos: Rápidos para la identificación de Levaduras, Anaerobios
Estrictos, Neisseria, Haemophilus en sólo 4 horas
Tecnología: Utiliza tecnología de fibras ópticas que permite la lectura
espectrofotométrica de todo el panel simultáneamente, garantizando la más absoluta
precisión en los resultados. Un programa completo de información llamado LabPro,
procesa cada panel simplificando las pruebas dID/AST y estandarizando a su vez los
resultados.

67. Computadora: Genera automáticamente reportes que se utilizarán para fines de
inspección.
Tiempo de lectura: menos de 5 segundos. Entrada automática del panel.
Ventajas:
1.Selección de los métodos de inoculación para ajustarse a su flujo de trabajo .
2.Mayor seguridad al saber que puede confirmar visualmente resultados
atípicos.
3.Proceso automatizado que asegura consistencia.
4.Menos manipulación ahorra tiempo al operador.
5.Calibración automática.

68. BD Phoenix
Es un sistema de
identificación y prueba de
sensibilidad a antibióticos .
Formado por paneles
descartables que combinan
ambos procedimientos y un
instrumento que realiza
lecturas a intervalos de 20
minutos.

69. Características
Capacidad de 99 paneles.
Paneles de identificación, sensibilidad y combo ID/AST.
PANEL PMIC/ID -108 único en el mercado que identifica cocos y bacilos gram positivos.
Identificación en 4 horas.
Sensibilidad MIC en 8 horas promedio.
Identificación en 4 horas.
Mínima Concentración Inhibitoria.
Actualización de puntos de corte.
Bioseguro; fácil inoculación de los paneles sin necesidad de equipos adicionales.

70. El instrumento controla tanto los cambios espectrales visibles como los niveles de
intensidad de fluorescencia; según el tipo de sustrato, interpreta los resultados y
proporciona una respuesta cuando el sistema tiene confianza en la identificación.
Stefaniuk y cols. El Phoenix mostró una tasa alta de concordancia con los métodos
de identificación convencionales, que varió del 100% para cocos gram positivos y
96% para los no fermentadores gramnegativos y 92.5%para enterobacterias

72. → La tuberculosis
Es una infección bacteriana causada por Mycobacterium
tuberculosis es una de las principales causas de
morbilidad y mortalidad en el mundo, se requiere un
diagnóstico temprano y un tratamiento adecuado para
que no llegue a ser mortal.
Es un importante problema de salud pública en
Bangladesh.
En 2004 se observó que la incidencia fue de 229 por
cada 100.000 personas y la tasa de detección sólo fue
del 31%

73. En Bangladesh rige un programa implementado a
nivel nacional aplicado a cada thana, según los
consejos de la OMS, Con cada thana cubre una
población de aproximadamente 250.000
Los métodos diagnósticos implementados son
convencionales, como sintomatología, esputo,
exámenes de frotis, radiografía de tórax, prueba de
tuberculina y otros.
La confirmación de TB por cultivo positiva toma 2 a
8 de semanas, este servicio está disponible en unos
pocos centros en el país.

74. → Diagnóstico temprano, y tratamiento adecuado.
→El diagnóstico de tuberculosis (TB) en países en
desarrollo, principalmente es la detección microscópica de
BAAR en las muestras clínicas, la técnica convencional de
examen directo de frotis es barata y fácil, pero es poco
sensible.
→ El diagnóstico por PCR es más rápido y más sensible,
pocos laboratorios lo usan para TBC en Bangladesh, pues es
bastante novedosa.
→Se hizo un estudio prospectivo para comparar el método
molecular con los procedimientos del diagnóstico
convencional.

75. → Métodos
Colección de muestras:
Se recolectaron 135 muestras de esputo, en pacientes sospechosos de TB pulmonar
antes de la quimioterapia, en la clínica ambulatoria del Programa Nacional de
Tuberculosis, Shayamoli, Dhaka.
1.Se sometieron a un lavado bucal con agua para eliminar contaminantes e
inhibidores de BAAR.
1.Se recogió una muestra de la mañana temprana, que era un material exudativo
después de una tos profunda y productiva.

76. Coloración ácida rápida
Se realizó un frotis directo de cada muestra de
esputo, y un frotis concentrado, y se les realizó
tinción por el método Ziehl Neelsen (ZeN)
Tinción fluorescente con auramina y rodamina
Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las
micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos
auramina y rodamina.
Las bacterias aparecen de color amarillo o naranja
brillante contra un fondo verdoso. El permanganato
de potasio, empleado como contraste, evita la
fluorescencia inespecífica, puede teñirse con ZN
encima para confirmar.

77. Tratamiento de muestras:

78. Cultivo y recuperación de micobacterias de muestras de esputo
Los tubos de cultivo LJ inoculados se
incubaron hasta 8 semanas con un examen
semanal para detectar evidencia de
crecimiento.
Los organismos en las botellas de proceso
MB / BacT, que fueron designados como
positivos por el sistema en 5 o 7 días,
también se subcultivaron en medio LJ.

79. Los últimos cultivos se incubaron durante un
máximo de 6 semanas con un examen semanal
para detectar evidencia de crecimiento.
El crecimiento de M. tuberculosis en todos los
tubos de cultivo de LJ se confirmó mediante
1.Test de niacina.
2.Sensibilidad al didrázido de ácido tiofeno-2-
carboxílico (TCH).
3.Sensibilidad al ácido p-nitrobenzoico).

80. Detección por PCR de la tuberculosis
El ADN cebador (IS6110) específico para el complejo M. tuberculosis se obtuvo
comercialmente y se usó como diana para la amplificación por PCR.
Ciclos de reacción usados con los cebadores IS6110:
→ Denaturación por 4 minutos a 94°C.
→ 35 ciclos de amplificación (94°C por 45 seg, 68°C por 45 seg y 72°C por 1 mn).
→ El último paso de 72°C fue extendido por cinco minutos más. La reacción fue
detenida por enfriamiento a 4°C.

81. Los productos de la amplificación
fueron analizados por una
electroforesis en gel de 2,5% de
agarosa, y se detectó una banda de
ADN específica de IS6110 del
complejo de M. tuberculosis por Gel
Doc 1000 Trans-iluminador (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA). Los controles
positivo y negativo fueron corridos con
cada lote o muestra analizada

82. Análisis estadísticos
Todos los valores fueron expresados como frecuencias, porcentajes, o medios, según
corresponda.
Las comparaciones entre grupos fueron hechas usando el test Chi-square y el test
exacto de Fischer.
Un valor p ⩽ 0,05 fue considerado como importante.

83. Todos los datos fueron analizados usando el programa SPSS (SPSS Inc.,
Chicago, IL, USA).
Las sensibilidades, especificidades y los valores predictivos positivos y negativos
fueron calculados contrastando los resultados con cada método.

84. Resultados
● Microscopía de las muestras de esputo
44 (32,6%) muestras fueron positivas ácido rápidas en tinciones de frotis directos.
49,6% 44,4%

85. Cultivos y test bioquímicos
55,6%
66,7%
Los periodos de tiempo medio generales para detectar micobacterias fueron de
32.7±4.56 días y 17.02±10.96 días para medios de cultivo directos de LJ y el
sistema de procesamiento MB/BacT seguido por LJ, respectivamente.

86. Detección por PCR
Sus colonias mostraron morfología típica similar a M. tuberculosis pero exhibieron
un comportamiento bioquímico diferente en los test TCH y PNB.
Un aislamiento mostró resistencia a PNB y el otro mostró sensibilidad a ambos,
TCH y PNB.

87. Discusión de resultados
135 muestras de esputo totales.
44 positivas por método directo.
60 positivas tinción de ZeN concentrada.
16 negativas por ZeN directo → positivas por ZeN concentrada.
La concentración de la muestra de esputo facilitó el examen de frotis.
Se observó que una porción de pacientes positivos para TB por frotis directo
no puede ser diagnosticada como positiva.

88. 67 positivas por microscopía de fluorescencia con tinción de auramina O.
23 negativas por ZeN directa.
8 negativas por ZeN concentrada.
1 negativa por microscopía de fluorescencia → positiva por ZeN concentrada.
Microscopía de fluorescencia es más sensible que la microscopía de campo
brillante.
Resultados falso-positivos (positivo por frotis ZeN y negativos por cultivos en
LJ) tanto para ZeN directo como concentrado, siendo el 4% a causa del

89. El cultivo en medio LJ es considerado como el “gold standard” sin embargo, el
porcentaje de recuperación aumenta cuando se procesa con MB/Bact.
Disminución del tiempo de recuperación en LJ con el kit MB/Bact(17.02+/-
10.96) a diferencia con el medio LJ tradicional (32,70 +/- 4,56)
El muy bajo número de micobacterias viables pudo haber sido recuperado sólo
por el MB / BacT procesado en el medio de cultivo LJ, pero no por el directo
LJ.

90. PCR y MB/BacT
→ Porcentaje similar de muestras positivas (68,9% y 66,7% respectivamente).
→ Porcentaje similar de sensibilidad (97,3% y 98,6% respectivamente).
→ PCR menor especificidad (66,7% vs 73,3%).
→ De 42 muestras negativas por PCR → 2 positivas por cultivo. Morfología de
colonias típica similar a M. tuberculosis, pero comportamiento bioquímico
diferente en pruebas de TCH y PNB.

91. Comparación de los métodos
PCR → presentó la menor especificidad de todos los métodos utilizados.
LJ directo → gold standard, porque los sistemas MB/BacT y de cultivo líquido no
han sido suficientemente evaluados y sólo están disponibles en instituciones
privadas en Bangladesh.
Subestimación de la especificidad de la PCR porque el gold standard usado fue
cultivo directo de LJ, frente a otros estudios donde el gold standard fueron
sistemas de cultivo líquidos.

92. El diagnóstico de TB en un país en desarrollo, como Bangladesh, se basa
principalmente en la detección microscópica de bacilos ácido-alcohol resistentes en
frotis de muestras clínicas, un método con una sensibilidad variable que oscila entre
el 22% y el 78%.

93. En este estudio, la especificidad del examen de frotis directo fue alta y las
especificidades de las coloraciones de Z-N y fluorescentes fueron las mismas.
Puede ser probable que el uso de una mayor magnificación en la microscopía de
fluorescencia aumentará aún más la especificidad de la prueba.

94. → Se observó una sensibilidad mayor para el sistema MB/BacT
(98.6%)que para el cultivo Gold Standard(73.3%).
→ Hubo una tasa de falsos positivos del 0% alta sensibilidad,
baja especificidad.
→ 16 muestras, que eran negativas para LJ cultivo medio, pero
positivas para MB/BacT, no eran falsos positivos.
→ Todos estos resultados fueron enviados a los respectivos
centros de diagnóstico para las acciones necesarias.

95. → Los valores predictivos positivos y negativos siguen el teorema
de Bayes y dependen de la prevalencia de muestras positivas de
esputo examinadas. (Tabla 4)
→ Como la prevalencia de muestras positivas de esputo fue alta en
este estudio, el valor predictivo positivo para ZeN microscopía
directa fue mayor (93,2%) que los de los otros métodos (Tabla 4).
→ El valor predictivo negativo del cultivo de LJ mediado con
MB/BacT (97,8%) fue mayor que el de cualquier otro método.
→ Si se busca reemplazar ZeN microscopía directa para el
diagnóstico, debe ser más eficiente utilizado en condiciones
idénticas.

96. A pesar de la alta sensibilidad de PCR y el método LJ MB/BacT se prefiere la
tinción ZN por su alta especificidad .
Sin embargo, otras ventajas del método rápido también deben ser consideradas para
el diagnóstico de TB.
PCR → permite realizarse en una sola muestra y produce resultados en un día.
Tiene un gran potencial para el diagnóstico de pacientes con tuberculosis negativa y
extra pulmonar, lo cual es otro gran desafío de "Implementar la estrategia de STOP
TUBERCULOSIS" de Bangladesh.