METODOS INDIRECTOS

1. Universidad de Guayaquil
Facultad de Ciencias Médicas
Cátedra deVirología
Tema de exposición:
METODOS INDIRECTOS O SEROLOGICOS
Docente: Dra. CARMEN MOSQUERA
Expositores:
• CATANI LUNA JHON
• CONTRERAS RODRIGUEZ JONATHAN
• COSTA MOSQUERA DODY
• DE LOS SANTOS CORONEL IVETTE

2. MUESTRA CLINICA
Envió en medio de transporte y a 4°C
Inoculación en
CULTIVOS CELULARES HUEVOS EMBRIONADOS RATONES
ACP, HA, Had placas
Despegar la monocapa por raspado o
congelación y descongelación
Pocks, detección del virus en fluidos
Obtener membranas, moler y preparar suspensiones
IC
Muerte, parálisis
IP
Obtener tejidos, moler y obtener
suspensiones
IDENTIFICACION
INMUNOFLUORESCENCIA (IF)
Preparar, extendidos,
fijar, teñir, incubar,
observar la IF
FIJACION DE
COMPLEMENTO
Lisar células, preparar
suspensiones, bloquear con
antisueros específicos,
añadir complemento,
incubar, añadir GR
sensibilizados, incubar,
observar F de C(ausencia
de hemólisis)
HEMOGLUTINACION
(HA)
Incubar sobrenadante
de cultivo o fluidos con
GR, observar HA
HEMADSORCION
(Had)
Lavar monocapa,
añadir GR,
incubar y
observar Had
INHIBICION DE
Had
Lavar monocapa,
añadir antisueros
específicos,
incubar añadir GR,
observar inhibición
de Had
NEUTRALIZACION
Incubar el virus,
aislado con
antisuero
específicos,
inocular en
huésped sensible,
observar el
efecto protector
del antisuero
INHIBICION DE
HA
Incubar diluciones
adecuadas del virus
aislado con
antisueros
específicos, añadir
GR, observar la
inhibición HA

3. METODOS
INDIRECTOS
Son aquellos que investigan la respuesta
de anticuerpos específicos antivirales en
el suero del paciente
No se basan en la detección del agente
etiológico, sino en la determinación de la
respuesta humoral especifica del huésped
Es necesario determinar : la Conversión
serológica o bien la presencia de IgM
especifica antiviral
METODOS RAPIDOS DE DIAGNOSTICO VIRAL:
1. Partículas virales por microscopia electrónica
2. Antígenos virales por métodos inmunomarcado
3. Genomas virales por hibridación molecular o PCR
4. INMUNOGLOBULINA (Ig)M

4. Métodos
indirectos
Conversión
serológica
Aparición de anticuerpos o el aumento
de 4 o + veces del titulo de anticuerpos
entre dos muestras pareadas de suero
1. SUERO AGUDO
2. SUERO DE CONVALECENCIA
(14-21 DIAS comienzo de síntomas)
Permite realizar diagnostico de una
infección reciente
IgM
especifica
Se realiza con certeza un diagnostico de
infección reciente
Duración en circulación 1-2 meses
Diagnostico de enfermedades virales
posnatales: rubeola, hepatitis A
Congénitas: rubeola, citomegalovirus
No atraviesa la barrera placentaria

5. INFECCION VIRAL AGUDA
DIA 0 SINTOMAS
DIAGNOSTICO VIROLOGICO POR MEDIO DE DETECCION DE CONVERSION SEROLOGICA

6. METODOS
CLASICOS
DIAGNOSTICO
SEROLOGICO
NEUTRALIZACION
FIJACION DE
COMPLEMENTO
INHIBICION DE LA
HEMAGLUTINACION E
INMUNOFLUORESCEN
CIA INDIRECTA(IFI)
ENZIMOINMUNOENS
AYO(ELISA)
RADIOINMUNOENSAY
O(RIA)
WESTERN BLOT

7. FIJACION DE
COMPLEMENTO ( F de C)
Se detectan
anticuerpos dirigidos
contra antígenos
internos del virus.
Los anticuerpos se
detectan tardíamente
luego de la infección,
títulos bajos,
desaparece entre 4 -6
meses posinfeccion
Es una de las
primeras técnicas
empleadas en el
diagnostico
serológico.
Su baja sensibilidad y
la corta duración en
circulación de los
anticuerpos F de C ya
casi no es utilizada
Detecta solamente
anticuerpos dirigidos
contra antígenos de
grupo o familia, por
lo que no se llega a
discriminar entre
diferentes serotipos
Representación esquemática de la aparición de anticuerpos antivirales. Infección viral
aguda.AcIHA: anticuerpos inhibidores de hemoglutinacion. AcFC: Anticuerpos fijadores
de complemento

8. NEUTRALIZACION
técnica se basa en poner en evidencia la capacidad neutralizante
de los anticuerpos presentes en el suero del paciente sobre
cepas virales patrón
Los anticuerpos neutralizantes están dirigidos contra antígenos
de superficie de los virus(glicoproteínas de envoltura, o
antígenos de la cápside) y son protectores
Estos anticuerpos son tipos-específicos, por lo que permite
determinar el serotipo viral causante de la enfermedad
Los anticuerpos neutralizantes persisten muchos años en
circulación, son detectables de por vida
Lo inconveniente de esta técnica es su complejidad,
requerimiento de virus que puedan propagarse en cultivos
celulares o de animales, paneles de antisueros específicos y
condiciones de bioseguridad
resulta indispensable para determinar la presencia de
anticuerpos protectores inducidos mediante vacunas

10. INHIBICION DE LA
HEMAGLUTINACION (IHA)
Los anticuerpos IHA se producen como respuesta a la infección con virus
que presentan en su envoltura hemaglutinina
Los anticuerpos son de tipo especifico aparecen luego de una infección
y persisten por años
Son de fácil detección ya que no son necesarios los cultivos celulares
Para realizar esta técnica se efectúan diluciones del suero del paciente, las
que se mezclan con una cantidad conocida de virus.
Luego de la incubación se añaden GR (de cobayo, pollo, etc.) y se observa IH, la que se
producirá solamente si en el suero del paciente hay anticuerpos específicos para el
virus que se esta ensayando
•La observación es visual, requiere un equipo mínimo, y es de fácil realización.En el suero
suelen existir inhibidores inespecíficos de la hemaglutinación, esto deben ser removidos antes
de realizar la reacción.

11. Inmunofluorescencia indirecta IFI
para detectar anticuerpos
• La IFI es uno de los principales procedimientos para el diagnóstico
serológico en infecciones virales.
• El fundamento es la detección de anticuerpos específicos antivirales (IgG o
IgM o bien Igs Totales) en el suero del paciente.
Proceso:
1. Para la realización de la IFI se incuba diluciones del suero
del paciente con células infectadas conteniendo los
antígenos virales.
2. Luego de ½ hora de incubación a 37°C la preparación es
lavada con solución salina isotónica para eliminar los
anticuerpos que no reaccionaron con los antígenos.
3. Siguiente paso se añade un anticuerpo anti-Igs humanas
conjugado con un fluorocromo.

12.  La reacción se lee en el microscopio de luz
ultravioleta y el operador debe de ser
experimentado.
• Las células infectadas y fijadas con acetona se
emplean como sustrato pueden conservarse en
el laboratorio durante meses a -20°C y durante
años a -70°C/-86°C

13. INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA
PARA DETECCIÓN DE IGM ESPECIFICA.
 Se utiliza para diagnostico de infección reciente en una
única muestra de suero en numerosas infecciones
agudas y para el diagnostico de infecciones congénitas.
 Mayoría de infecciones víricas desde el tercer días
iniciada la enfermedad (en títulos muy bajos).
 Asciende durante los 10 a 20 días y sigue elevado en la
convalecencia.
 IgM es diagnosticada de infección en curso

14.  Existen muchas técnicas que se
pueden buscas la IgM excepto en una
es necesario descartar la presencia en
el suero de pacientes de factores
reumatoides o altos títulos de IgG
especifica ya que ayudan a obtener
resultados falsos.
 Los altos títulos de IgG antiviral
pueden dar un falso resultado
negativo al competir con la IgM
presente en el suero, por el antígeno
viral ofrecido en la reacción
 En la actualidad la detección de IgM
especifica se usa para diagnostico de
infecciones recientes con rubeola,
citomegalovirus, herpes simplex en
suero y LCR, virus Epstein-barr,
paratoiditis, hepatitis A, sarampión y
otros

15. ENZIMOINMUNOENSAYO
En los últimos años se han desarrollado numerosos
métodos de Elisa tanto para la detección de antígenos
virales como anticuerpos específicos.
Es necesario elegir los materiales plásticos adecuados
como soporte y que algunos granos o sustratos como
la orto fenilendiamina pueden ser cancerigenos,.
ELISA para la detección de antígeno los procedimientos
mas usados consisten en una fase solida sobre cuya
superficie se absorbe el anticuerpo especifico antiviral o
anticuerpo de captura
luego se añade la muestra clínica si contiene antígeno
viral se unir a al anticuerpo de captura
Se detectara otro anticuerpo marcado con una enzima
ya sea peroxidasa, fosfatasa alcalina o biotina-avidina
Los ELISA indirectos tienen la ventaja de ser mas
sensibles y además de no necesitar un anticuerpo
conjugado para cada virus ya que se emplean
antisueros no conjugados y luego anti especie, este si
marcado con una enzima.

16. ELISA indirecto
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Ags específicos.
2. Lavado con solución salina Tween 20 como agente tensioactivo
(ph-7,2) para eliminar los Ags fijados deficientemente o nofijados.
3. Adición de Acs marcados (“conjugados”) con una enzima; silos
Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedarásolubilizado.
4. Lavado para eliminar los Acs marcados que nohayan
reaccionado.

17. ELISA indirecto
5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora.
6. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

18. ELISA indirecto
Por si no les ha
quedado claro…

19. LECTURA E INTERPRETACIÓN
DE RESULTADOS:
 Una de las grandes ventajas de la técnica
ELISA es la posible automatización de la
lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha
automatización se puede conseguir con un
simple colorímetro o espectrofotómetro de
cubeta o con sofisticados equipos de
lectura automática de microplacas.
 Los resultados finales de la lectura
colorimétrica se reflejan numéricamente
mediante valores de absorbancia o
densidad óptica que se obtendrán a la
longitud de onda más adecuada para la
coloración final alcanzada.

20. RADIOINMUNOENSAYO
Se describieron en 1960 para
detección de insulina.
En los RIA de fase solida el
fundamento es idéntico a Elisa
con la diferencia de que el
anticuerpo esta marcado con un
isotopo radiactivo en ves de
estar conjugado con una enzima.
La lectura de realiza con un
contador de radiación gamma

21. NUEVOS METODOS DE
DIAGNOSTICO VIROLOGICO
WESTERN BLOT / INMUNOBLOT
Para investigar antIcuerpos, la técnica inicia con el
fraccionamiento electroforético de las proteínas virales
obtenidas en el laboratorio en geles de proliacrilamida.
Las bandas asi formadas se transfieren a filtros de nitrocelulosa
o nylon mediante la aplicación de una adecuada intensidad de
corriente eléctrica.
Las bandas tienen las misma posición que en los geles si estos
filtros son incubados con anticuerpos específicos y luefo con un
antisuero Anti-Igs humana conjugado con peroxidasa, podrá
evidenciarse la reacción en forma de bandas coloreadas
mediante un sistema detector bromocloro indolilfosfato

22. PROCEDIMIENTO
a) Preparación de la muestra. Extracción de
las proteínas de las muestras biológicas
mediante disrupción mecánica o química.

23. b) Electroforesis en gel de Acrilamida. Las
proteínas en el extracto se separan de acuerdo
a su tamaño mediante electroforesis. Se
prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida.

24. c) Transferencia electroforética a una
membrana. Las proteínas son transferidas
electroforéticamente a un soporte rígido o
membrana, dónde quedan inmovilizadas.

25. d) Hibridación del Anticuerpo. La membrana con
las proteínas inmovilizadas debe tratarse para
bloquear las zonas con ausencia de proteínas
y así evitar la unión no específica de los
anticuerpos.

26. e) Detección de las Bandas. Después de un
lavado de la membrana para eliminar el
anticuerpo no unido, se procede a detectar
la localización de la banda en la membrana.

27. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
• Las proteínas se extraen mediante procesos
químicos y/o mecánicos.
• El método elegido dependerá del tipo de
muestra de partida, de la localización
subcelular de la proteína y de las
condiciones óptimas que requiera el
anticuerpo para reconocer el epítopo
proteico.

28. Métodos físicos de la disrupción de muestras.
MÉTODO DESCRIPCIÓN TIPO DE MUESTRA
Licuadora
La muestra se tritura mediante
cuchillas rotatorias
Gran cantidad de tejido
Homogeneizador Dounce
Tubo de vidrio con pistón
ajustado maja las células por
acción de corte
Células tisulares, útil para
protocolos de enriquecimiento
de proteínas mitocondriales o
nucleares.
Homogeneizador de
ultrasonidos
Ondas de sonido emitidas por
una sonda para romper las
membranas celulares
Células, tejido, bacterias
Pulverización de Nitrógeno
liquido
La muestra se pulveriza
utilizando un mortero y una
almirez refrigerados
Tejido animal o no vegetal
Perlas de vidrio
La ruptura celular se produce
por agitación de las perlas de
vidrio
Levaduras

29. Soluciones de tampón y detergentes
TIPO/LOCALIZACIÓN
PROTEÍNA DE INTERÉS
DETERGENTE O SOLUCIÓN
TAMPÓN
COMENTARIOS
Nativa (no desnaturalizada)
Detergente suave no iónico Evitar detergentes
desnaturalizantes (SDS,
Deoxicolatos)
Citoplasmáticos (soluble)
Tris-HCl
Puede combinarse con
métodos mecánicos, tales
como el homogeneizador
Dounce
Citoplasmático (unida a
citoesqueleto)
Tris – Triton
Los detergentes Triton son
suaves y no iónicos
Membrana mitocondrial o
nuclear
NP-40, RIPA (multiples
détergentes), Triton X-100
Para antígenos con niveles
bajos de expresión pueden
ser necesarios procesos de
enriquecimiento
Lisado total de celulas
NP-40, RIPA,
Triton X-100

30. Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas que
pueden degradar la proteína de interés. Por tanto, es
importante evitar, durante la preparación de la
muestra, cualquier actividad proteásica.
• Evitar excesivos ciclos de congelación/descongelación.
• Trabajar rápido y mantener las muestras en frío
durante todo el proceso.
• Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis.

32. ELECTROFORESIS EN
ACRILAMIDA
• Previamente a la
electroforesis, es
importante determinar la
concentración de proteínas
por las siguientes razones:
1. Asegurar la carga de la
cantidad correcta de
proteínas en el gel.
2. Realización de Western
Blot cuantitativos o
semicuantitativos.

33. 1. Una vez se tienen las muestras de proteína
• se pueden conservar congeladas, teniendo cuidado en evitar
ciclos repetitivos de congelación/ descongelación.
• se pueden utilizar inmediatamente, con un tampón de carga
2. las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante
5-10 minutos
3. cargar la muestra en un gel de electroforesis.

34. Inicio de electroforesis
• Antes de la carga del gel, es importante diseñar el experimento
incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de
los resultados.
1. Marcadores de peso molecular
2. Controles positivos

35. TRANSFERENCIA DE
MEMBRANA
• Después de la separación
electroforética de las proteínas
por su peso molecular, éstas
deben transferirse desde el gel de
electroforesis a la membrana.

36. Bloqueo de la
membrana
(leche PBS-Tween)
Retira solución de
bloqueo y lava 3
veces con PBS
Indirecto: Anticuerpo
secundario con
enzima
Incuba con sustrato
en agitación
Se enjuaga con
agua MQ
Lee
Quimioluminiscencia,
Fluorescencia y
Colorimetría
DirecItnod:iArenctticou:erpo
pArinmtiacruieorcpoon
pernimziamriao
Lavado 3 veces con PBS
tras cada incubación

37. • Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos. Es muy
importante bloquear los sitios de unión de la membrana sin
reaccionar con el antígeno, para reducir la unión inespecífica
de las proteínas.

38. HIBRIDACIÓN DEL ANTICUERPO
• Después del proceso de bloqueo, la membrana se incuba con
el anticuerpo primario  lavados  anticuerpo secundario
conjugado con HRP (D. indirecta)

39. DETECCIÓN DE LAS BANDAS
Los métodos directos
utilizan un anticuerpo
primario conjuga-do con un
marcaje detectable, como
un enzima, biotina o
molécula fluorescente.
Lo métodos indirectos
utilizan dos anticuerpos; un
anticuerpo primario y un
anticuerpo secundario
contra la especie del primer
anticuerpo.

40. • Los métodos más comúnmente utilizados para
detectar proteínas son:
1. Quimioluminiscencia
2. Fluorescencia
3. Colorimetría.

41. QUIMIOLUMINISCENCIA
• Los métodos de detección
de quimioluminiscencia
utilizan comúnmente
anticuerpos secundarios
conjugados con peroxidasa
(HRP). La reacción entre el
encima y el substrato
produce luz, que puede ser
detectada mediante la
exposición de la membrana
a una película de rayos X

47. APLICACIONES
Investigación: biología molecular.
*Detección de proteínas o
mutaciones puntuales Diagnóstico:
 *Prenatal
 * Enfermedades inflamatorias, perfil de
citoquinas en modelos experimentales,
Factores de crecimiento, Secreción de
proteínas
*Prueba de VIH: (estándar de oro) Ac´s
anti-VIH en suero. Membrana con proteínas
de células infectadas + suero muestra;
aparición de bandas indica = seropositivo.
*Confirma la encefalopatía
espongiforme bovina, "enfermedad de las
vacas locas".
 *Enfermedad de Lyme.
 *Oncogenes En veterinaria:
*FIV en gatos.

48. ventajas del uso de SDS – PAGE (electroforesis)
•La gran mayoría de las proteínas son
solubles en SDS.
•Todos los complejos de SDS-
proteína tiene carga negativa y
migran en el mismo sentido.
•Su densidad de carga es muy elevada,
la velocidad de migración es mayor y
las electroforesis son mas rápidas.
•Los complejos de SDS- proteína se
tiñen fácilmente.

49. *Costo elevado.
*Variabilidad reaccional en
las bandas según el ensayo ,
el tipo de muestras, las
condiciones técnicas, hacen
variar la subjetividad de
interpretaciones.
*Problema en las proteínas
de fácil degradación.
*Es tardado (inadecuada
transferencia) bandas
sesgadas, descolorido, o
incluso múltiple.
VENTAJAS
*Alta sensibilidad 0,1
nanogramos de proteína.
*Diagnóstico eficaz
temprano.
*Múltiples muestras y
tipos de estudio.
DESVENTAJAS

50. VENTAJAS Y DESVENTAJAS