El documento describe la investigación sobre la decoloración rosa en los frescos de la Capilla de San Brizio en la Catedral de Orvieto, Italia. Los análisis microbiológicos y bioquímicos indican que las cianobacterias son el principal agente causante de la decoloración, debido a su habilidad para crecer en la oscuridad utilizando compuestos orgánicos. El biocida Metatin 5810-101 fue el más efectivo para reducir la decoloración según las pruebas de ATP.

1. LA 261 Ecologia de microorganismos Deteccion y eliminacion de Cyanobacterias de frescos: El caso de la capilla de St. Brizio (Catedral de Orvieto , Italia)

3. La C. de Orvieto ha presentado deterioro , como alteraciones cromáticas en la piedra y los frescos (decoloración de color rosa “polvo” sobre la Signorelli frescos en el St. Brizio Capilla).

4. 1917: se observó alteraciones cromáticas y estructurales , en color rosa y extremadamente frágiles, en el interior de las superficies de las paredes y yeso.

5. 1971: polvo de color rosa se asociado con microorganismos.

6. 1979: la modificación conectada a Fototrofos(Chlorophytas y cianobacterias). Un fresco es una pintura realizada sobre una superficie cubierta con una delgada y suave capa de yeso, en la cual se va aplicando cal apagada (CaOH2) y cuando la última capa está todavía húmeda, se pinta sobre ella, de ahí su nombre.

7. Introducción Poca intensidad de luz y alta humedad son las condiciones donde se han reportado deterioros - semejantes ocurren en St. Brizio Capilla. La patinas formadas por fototrofos varían en color de acuerdo a características taxonómicas. También cambia por el Edo. Fisiológico de la célula y las condiciones ambientales. Bassi ha descrito que el polvo rosa se caracterizan por la presencia de formas cocoides encapsuladas. Una patina es un recubrimiento formado en la superficie de un metal con lustre que después de mucho tiempo se forma sobre la superficie de un objeto antiguo.

8. Objetivo Confirmar la presencia de formas cocoides y relacionarlos con las condiciones ambientales y la decoloración rosa, para reducir la alteración causal agente.

9. TOMA DE MUESTRAS Muestras de polvo de color de rosa en la zonas frescos en la Capilla de San Brizio (Catedral de Orvieto). Muestras incluye la reconstrucción de yeso, la pintura grotesca, y original de yeso y el fresco del "cuerpo de la resurrección " (piernas y cráneo de hombres y mujeres). A laboratorio en cond. Esteriles. Material y métodos

11. Sonicador(Sonicator HD 2700 plus, Bandelin) en las muestras en recip. esteriles con Solución salina tamponada (Sigma Italy) durante 20 min/ 4°C. para separar las células de la matriz mineral.

12. MEDIOS DE CULTIVO

13. Para la deteccion de cyanobacterias y chlorophyta Chu y Detmermedio mineral y Chu y Detmeradicionado con glucosa (10 g/L) y caseina (5 g/L).

14. El medio con caseína se ha utilizado en el estudió frescos con fines de conservación. Incubados bajo condiciones de luz y oscuridad en un cuarto a 4°C.

15. Material y métodos MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE Y EPIFLUORESCENCIA. Observaciones Micros. Se realizaron con una Leica DM4000B, equipado con Cool-Snap CF camera, controlada por el software WinSpec Versión. 1.9.2 OBS. MICROS. M. ELECTRONICO DE BARRIDO. Las observaciones del polvorosa realizadas para estimar presencia de microorganismos en la superficie dañada. Muestras fijadas toda la noche Observaciones hechas usando Jeol JMS 35 C Microscopio. Glutaraldehido 2% en buffer de fosfatos 0.01 M Deshidratado en series Etanol (50%-100%) Secado y cubierto de pintura de oro

16. Material y métodos EXTRACCION DE LA CLOROFILA Se llevó a cabo de acuerdo con la PAE US method 446.0. modificado.: 0.1 g polvo rosa/ 10mL de dd H2O –Sonicada. Espectrómetro de fluorescencia Perkin Elmer Espectrofluorímetromod. LS-3B Pigmento extraído Acetona 90% 2 hr Φ 1000xg/ 5 min 665 nmChl a 650 nmChl b Method 446.0 In Vitro Determination of Chlorophylls a, b, c + c and Pheopigments in 1 2 Marine And Freshwater Algae by Visible Spectrophotometry

17. Material y métodos CITOMETRIA DE FLUJO Se aplico a dos muestras tomadas de el “Cuerpo de la resurrecicion” en medio Chu (muestra A) y Detmer (muestra B) adicionados con materia organica. Para discriminar los desechos de microorganismos las muestras fueron teñidas con DNA- specific colorante SYBR- verde. SEÑALES CELL MICROB. 10 ЧL colorante-Dimetil sulfuro fue dosificada en 1 mL de muestra 15 min oscuridad 1- Manchas fluorecencias verde 2- Flu. Rojo-naranja (por fotosintesis de pigm. 550-600nm ) 20 000 cells analizadas C/ muestra Citometria de flujo Bryte-HS 470- 490 nm

18. Material y métodos BIOCIDAS MetatinTM y Neo Desogen fueron probados en el polvo de color de rosa a la derecha del wainscot (pared de madera), yeso de la reconstrucción. Los biocidas son rociados en la superficie, aplicandose ensayo bioluminiscencia de ATP --zonas tratadas y no tratadas. La concentración final de los dos biocidasutilizadas para la conservación de los tratamientos fue de 2% . DETERMINACION DEL ATP Test Kit de biomasa , incluidos NRM™ reactivo y el patron para el ensayo del ATP. Valores de Bioluminiscencia medidos en buffer Tris-HCl (0,001 M, pH 7,75) y 10Чg de solucion de ATP estandar. Bioiocounter P 1500.

19. Material y métodos EXTRACCION DEL DNA GENOMICO TOTAL 20 mg de polvo rosa sonicado de muestras de pinturas y yeso. Fue purificada a través de membranas de gel de sílice (QIAamp ARN viral Mini Kit de Qiagen) . PCR ESPECIFICO PARA CYANOBACTERIAS Antes y después de tratamiento con biocidas. 16S r DNA fragmentos específicos de cianobacterias fueron amplificados. Control positivo: medio nonaxenico . 1ª AmplificacionPrimers 27f and 1522r. Luego con primers CYA359f y CYA781r orientado al 16S r DNA . Se uso 50 pmol/ primer …… 25nmol/ dNTP . Deoxinucleosidotrifosfato. 200 μg bovineserumalbumin. ……..2 μl DNA templado.

20. Volúmenes de 100 μL en un termociclador de PCR-Express (Hybaid). utilizando 0,5 U de Taq . control negativo (agua estéril). Separado  2% en geles de agarosa 0,5 × Trisborate-EDTA buffer .

21. Material y métodos DGGE ESPECIFICOS PARA CIANOBACTERIAS Y SECUENCIACION DE BANDAS DGGE se realizó usando la mutación universal DCodesistema de detección (Bio-Rad, Italia), con un 6% de gel de acrilamida y un gradiente desnaturalizante del 35% al 55%. Electroforesis: a 90 V y temperatura de 60 ° C por 15 h. Se coloreo con SYBER greensolution/ 30 min. Bandas dominantes extraidas incubando el gel de fragmentos en 50 μl de d H2O estéril / 37 ° C / 12 h. Agitacion. 5 μlreamplificados pero sin GC clamp “abrazadera”. Secuenciación  Genbank DGGE : Denaturinggradient gel electrophoresis

22. Resultados OBSERVACIONES MICROSCOPICAS DEL POLVO ROSA Células microbianas forman biofilms, a menudo incluidos en la matriz mineral. Celulascocoidesdiametro mayor 5 Чm. Señales autoflorecentes (+). M. electronica de barrido predominio cocoidees en biofilm.

23. Resultados CARACTERIZACION GPOS MICROBIANOS PRESENTES EN EL POLVO ROSA Para mofototrofficos en cultivados medio liquido  crecimiento a 2 meses Presencia de células cocoide auto fluorescentes Cyanobacteria o algas??? - incubaron en medio con dif. Condiciones. En oscuridad sin M. orgánica  no crecimiento. Al imitar condiciones de Frescos en Chu y Detmer medio  crec. A lo 5 dias con presencia de colonias rosas. ANALISIS DE PIGMENTOS Se evaluaron los coeficientes de clorofila para la muestras de polvo de color rosa, y se resultó ser 8:1. ( a vs. b).

24. Resultados Citometría de flujo: Fluorescencia rojapresencia de clorofila (660-700 nm) Fluorescencia naranja se debe a ficoeritrina (560 -- 590 nm). Decoloracion causada por cianobacterias. No fotosinteticos procariotas 5% 95% por cianobacterias

25. Resultados DGGE ESPECIFICOS PARA CIANOBACTERIAS Y SECUENCIACION DE BANDAS Siete bandas claramente visible y de las correspondientes secuencias en la base de datos GenBank con los siguientes números: EU874241, EU874242, EU874243, EU874244, EU874245, EU874246, y EU874247. Las siete secuencias mostraron 94-98% de similitud incultos cianobacterias de los suelos y de muestras de rocas. ANALISIS DE EFICIENCIA DEL BIOSIDA POR DETERMINACION DE ATP Muestra con Neo Desogen 90000 pg ATP / g Metatin 15000 ATP pg / g Contra el ATP 68.000 pg / g para la superficie sin tratar.

26. DISCUSION Imperiet al. relaciono que la decoloración de antiguas murales con presencia de actinobacterias. Celulascocoides1-1.5 Чm. Las muestras observadas en la dif. Tecnicas demostraron presencia de especies cocoides encapsuladas > de 5 Чm. Previos estudios han reportado que la decoloración rosa esta asociada con cyanobacterias y clorophyta, en los frescos de la Catedral de Orvieto. La extracción de pigmentos demostró presencia de Chl a 8:1 respect. a Chl b. En algas esta proporción es de 3:1. Las cyanobacterias no poseen Chl b, suponiendo una predominancia de estas. El factor clave para la decoloracion rosa es la presencia de materia organica.

27. DISCUSION Un responsable de la presencia de la decoloración rosa es la ficoeritrina. Los resultados presentados en este documento nos llevan a creer que cianobacterias pueden crecer bajo condiciones oscuras porque son capaces de utilizar los compuestos orgánicos presentes en fresco superficie. la secuencia de las homologías de cianobacterias biopelícula no identifico a los géneros , porque bancos de datos de ADN comprenden principalmente las cianobacterias acuáticos; la Metatin se 5810-101 el más eficaz.

28. Conclusión Datos demuestran que las cianobacterias se el principal agente responsable de la decoloración en el color de rosa Signorelli frescos en la Capilla de San Brizioy, no hace falta decir, en muchas otras pinturas murales. Además, el eficiencia de los biocidasMetatin 5810-101 en la reducción de tal decoloración, ha sido comprobada por los resultados de nuestro investigación.