2. TOMA DE MUESTRA
Debe ser representativa del agua a analizar
Frascos estériles de vidrio o plástico con un volumen
entre 250 – 500ml ( no se llenan para poder agitar
contenido)
Para fijar cloro presente en agua ( agua potable) se
añade tiosulfato sódico ( 1gota al 20%)
Si en el agua hay presentes concentraciones de cobre,
zinc o metales pesados hay que incorporar EDTA (
forma quelatos)
Elementos: recipientes, hisopos estériles o sopletes de
soldadura

3. Procedimiento
1.-Canilla:
 se limpian la parte externa y la interna de la boca
del grifo
 Se deja salir chorro de agua fuerte durante 2 – 5
minutos para arrastrar suciedad en la cañería
 Se esteriliza la boca
 Se deja correr nuevamente agua
 Se toma el frasco y se abre en este momento
 Se procede al llenado

4. 2. Agua de río, arroyos, ríos :
Lejos de la costa y a una profundidad media
3.-Natatorios:
Cerca del borde y en zona de mayor profundidad
 Siempre se sumerge el frasco dirigiendo la boca en
sentido contrario a la corriente
 Se rotulan y se envían

5. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN
 Más rápido posible
 Si no es así refrigerar inmediatamente
 El transporte se realiza en envase aislante o en
refrigerador
 No pueden pasar más de 30 horas entre extracción y
procesado de la muestra

6. TÉCNICAS

7.  RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS TOTALES
 RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES
 RECUENTO DE COLIFORMES FECALES
 RECUENTO DE ENTEROCOCOS
 RECUENTO DE SEUDOMONAS
 RECUENTO DE CLOSTRIDIOS
SULFITOREDUCTORES

8. ELEMENTOS NECESARIOS
 Pipetas: 1 ml y 10 ml-
 Probetas graduadas-
 Tubos de ensayo con tapas y Gradillas
 Tubos de fermentación según Durham: para detección de la formación microbiana de
gases
 Placas de Petri: tamaño estándar de 9 cm de diámetro, de vidrio o descartables.
 Ansas de inoculación: de 3 mm de diámetro, de acero inoxidable o platino
 Frascos para la toma de muestras: de vidrio, con tapón esmerilado
 Baño de agua para templar el agar a 44-46ºC -- Contador de colonias
 Estufa de cultivo graduable a diversas temperaturas de incubación
 Estufa de aire caliente para esterilización (160-180°C)
 Autoclave: temperatura de esterilización 121°C
 Balanza analítica -- pH-metro: para control de los valores de pH de los medios de cultivo.
 Solución fisiológica o agua peptonda al 1% -- Matraz y/ o Erlenmeyer: para preparar
medios de cultivo, soluciones, etc.
 Medios de Cultivo: Agar para recuento en placa ( Agar plate count: APC) -- Caldo Mc
Conkey o Lauril Sulfato -- agar Cetridime -- Agar SPS -- Azida glucosa caldo – Caldo
verde de malaquita – Pseusomona P y F -

9.  Los materiales de vidrio, luego de la limpieza mecánica, se
limpian con agentes de lavado, y posteriormente se lavan varias
veces con agua de canilla, y seguidamente con agua desionizada o
destilada (los residuos de agentes de lavado impiden el
crecimiento microbiano). Luego se realiza el secado del material.
 Los materiales de vidrio que se han utilizado para el análisis de
aguas contaminadas deben someterse al autoclave antes de la
limpieza (20 min, 121°C, 1 atm).
 La esterilización de los aparatos de vidrio limpios se realiza en la
estufa de aire caliente, por 2 horas a 160-180°C.
LIMPIEZA Y ESTERILIZACIÓN DEL
MATERIAL

10. EXAMEN BACTERIOLÓGICO:
METODOLOGIA

11. Recuento de Aerobios
Totales
( Método de recuento estándar en placa)

12. Técnica
 Se realizan diluciones 1/10, 1/100 1/1000 …. Según tipo
de muestra con solución fisiológica

13. Se agrega 1 ml de muestra + 9 ml de solución fisiológica

14. Muestra directa Dilución 1/10 Dilución 1/100 Dilución 1/1000

15. Se incorpora posteriormente el APC ( Agar Plate Count preparado con anterioridad (
según instrucciones del frasco deshidratado)

16.  Se mezcla rotando cada placa. Dejar reposar hasta
solidificación.
 Llevar a estufa aeróbica a 35-37ºC durante 24, o
a 20ºC durante 48 hs.
 Contar en las placas donde se visualicen aisladas
perfectamente entre 30- 300 colonias
 Se promedia multiplicando por la inversa de la dilución

17. Cuando se informa el recuento se expresa con dos
dígitos significativos seguidos de tantos ceros como
la inversa de las placas cuyas diluciones promedios
se contaron las colonias ( notación científica
Ej: 84000= 8,4 x 104 )
Informar recuentos por ml de muestra

18. Recuento de Coliformes Totales
CARACTERÍSTICAS:
 Son buen indicador microbiano de la calidad del agua potable.
 Entre ellos se encuentran Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. se
asemejan morfológica y fisiológicamente. Estos M.O. con frecuencia difieren entre si en
características pequeñas
 Las bacterias coliformes no provienen solo de las heces de los animales de sangre
caliente, sino también de la vegetación y el suelo. E. Coli, rara vez se encuentra fuera del
intestino
 Por lo expuesto, la presencia de algunos organismos coliformes (1-10 coliformes en 100
ml) tiene poca importancia, siempre que haya ausencia de organismos coliformes fecal.
Diferenciar el tipo fecal (E.coli) y el no fecal (A: aerogenes o Citrobacter)
 Son bacterias aerobias o anaerobias facultativas, Gram negativas, no
esporuladas, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas.

19. . DETERMINACIÓN DEL NUMERO MAS PROBABLE
(NMP) / 100 ml de bacterias de coliformes totales
(Método de Wilson) o de Tubos múltiples
 Ordenar 3 filas de 3 a 5 tubos de ensayo con campanas
de Durham en una gradilla

20.  F1 10ml Medio de doble concentración + 10ml
de muestra
 F2 10ml Medio de concentración simple + 1ml
de muestra
 F3 10ml Medio de concentración simple + 1ml
de muestra

21.  Incubar los tubos a 32 - 35 ºC durante 48 horas.
 Determinar con los tubos positivos (ácido y gas) el NMP
utilizando la tabla de Hoskins.(Mc Grady) La formación de
gas a las 48 horas y/o viraje del indicador se consideran
evidencias suficientes de la presencia de coliformes.

22. TABLA DE HOSKINS / MC GRADY
3 tubos de 10 ml 3 tubos de 1 ml 3 tubos 0,1 ml Índice del NMP/100 ml
0 0 1 3
0 1 0 3
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
1 2 0 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15
2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
3 0 0 23
3 0 1 39
3 0 2 64
3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150

23. RECUENTO DE COLIFORMES FECALES
 Organismos coliformes fecales (termotolerantes)
 Los organismos coliformes fecales son capaces de fermentar la lactosa a 44.0-
44.5°C.
 Entre ellos se encuentra el género Escherichia y en menor grado algunas cepas
de Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella. De todos estos microorganismos,
solo E. coli tiene origen específicamente fecal.
 Para que en un sistema de distribución se desarrollen organismos coliformes
fecales deben existir suficientes nutrientes bacterianos, la demanda bioquímica
de oxigeno (DBO) debe ser mayor de 14 mg/l, la temperatura del agua debe
superar los 13°C, y no debe haber cloro libre residual.


24. Investigación de Escherichia coli : (coliformes termotolerantes)
 1. Escoger tubos gas positivos del caldo Mc Conkey o Lactosa bilis verde brillante
(Brila) procedentes del recuento de bacterias coliformes (NMP/100ml) Paralelamente
también se hace un repique a caldo EC
 2. Inocular una ansada de caldo de los cultivos seleccionados positivos en tubos de
Caldo Mc Conkey o Brila.
 3. Incubarlos tubos a 44,5 ºC ± 0,5 ºC y ver si son positivos de formación de gas a las 24
hs. y a las 48 hs.Si presenten gas o viran color son positivos : organismos coliformes
fecales ya que a esta temperatura solo el bacilo coli fecal produce ácido y gas.
 4. Para determinar Escherichia coli , de los tubos positivos mediante un ansa de ojal se
estría la superficie de una placa de EMB, se incuba a 37º C por 24 hs (Colonias específicas)
 Se confirma su presencia por las pruebas bioquímicas correspondientes al INVIC, como
mínimo.( Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato: ++-- para E.coli)

25. RECUENTO DE ENTEROCOCOS
 Otros indicadores de contaminación fecal
 Cuando existan dudas, sobre todo cuando se han encontrado
organismos del grupo coliforme y hay ausencia de coliformes
fecales, se pueden usar otros organismos que confirmen que la
contaminación es de naturaleza fecal.
 Entre estos indicadores secundarios están los estreptococos
fecales o enterococos
 Estreptococos fecales: se denominan así a los que se
encuentran normalmente en las heces humanas y animales.
Raramente se multiplican en el agua contaminada y pueden ser
algo más resistentes a la desinfección que los organismos
coliformes.

26. TEST CUALI- CUANTITATIVO
 Se mezclan igual cantidad de muestra de agua que de medio: azida glucosa de
doble concentración
muestra caldo azida glucosa
Sin Turbidez: reacción negativa
Se incuba a 37ºC durante 24 hs.
Turbidez por crecimiento: reacción
positiva ( pruebas confirmatorias)

27. RECUENTO DE CLOSTRIDIOS
SULFITOREDUCTORES
 El recuento o conteo de bacterias anaerobias sulfito reductores de la clase clostridios se encuentran
en heces, humus y aguas residuales.
 Se lo utiliza como indicador de contaminación fecal
 A una temperatura particular (por ser esporulados resisten un choque térmico.) y debido
a sus formas permanentes resistentes pueden permanecer con vida más tiempo en el agua
que las formas vegetativas
 Se realiza tratamiento térmico necesario para destruir todas las células vegetativas : 80º C
por 10 min.
 Luego se colocan 100 ml con 100 ml de caldo diferencial de clostridios o se hacen
diluciones en placa con agar SPS .
 Se incuba 48hs. A 37ºC en forma anaeróbica
 Reacción positiva: coloración negra del cultivo( sulfito pasó a sulfuro)
Existencia de clostridios
Reacción negativa: sin coloración negra

28. RECUENTO DE SEUDOMONAS
 Se realiza enriquecimiento colocando 100 ml de muestra de agua en
erlenmeyer con 100ml caldo verde de malaquita de doble
concentración o caldo cristal violeta.
 Reacción negativa: Sin turbidez, no se encuentra presente
Pseudomonas aeruginosa. Se concluye
el ensayo. Reacción positiva: Turbidez por crecimiento
microbiano.
 La muestra que presente turbidez, es repicada con ansa ojal sobre una
placa o pico de flauta de Agar Cetrimide.
 Se incuba 24hs. A 37ºC. Si se observa desarrollo y/o pigmentación se
procede a efectuar las siguientes pruebas:
Gram Oxidasa Reducción de Nitrato Gluconato Licuefacción de
Gelatina
Pseudomona
aeruginosa
- + + + +

29. De aquellas placas que presenten desarrollo de colonias con
fluorescencia, se repicaran colonias aisladas en: ( piocianina o
piorrubina)
Agar P y F para Pseudomonas, en forma de estriá con el
ansa para punción, durante 48 hs a 37 ºC.
Agar P para Pseudomonas:
a) Reacción positiva: colonias de color azul hasta verde o
respectivamente rojo hasta pardo obscuro del
medio de cultivo.
b) Reacción negativa: desarrollo de colonias sin formación de
color o de color amarillo.
Agar F para Pseudomonas:
a) Reacción positiva: Fluorescencia amarilla verdosa bajo
lampara UV
b) Reacción negativa: Ausencia de fluorescencia.