Informe de
Técnicas de
Aglutinación

por

Miguel Angel Figueroa Núñez
Inmunología Clínica
TM. Marcelo Ramirez Sandoval
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN

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¿DE QUE SE TRATA LA TECNICA DE ELECTROFORESIS PARA PROTEÍNAS?
¿CÓMO FUNCIONA?
SU UTILI...
INTRODUCCION
¿QUÉ SON LAS TECNICAS ELECTROFORETICAS PARA
PROTEÍNAS?
Por mucho y desde el descucbrimiento de la tecnica de ...
SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA
Su utilidad es gigantesca, pudiendo ser parte del rol diario de un laboratorio, pero...
MATERIALES Y MÉTODOS
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INSUMOS
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INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
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Lectura: Leer la placa en densitómetro a 525 nm.
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MUESTRA N°2

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Como observamos en las anteriores imágenes, cada banda fue interpretada por su
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VALORES DE REFERENCIA
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Albumina

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Para finalizar podemos ver en la muestra n°7 un SMC gammaclonal, donde observamos
las 3 fracciones bastante elevadas, esta...
El aumento de las proteínas gama globulinas puede indicar:
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Enfermedad inflamatoria crónica (...
REFERENCIAS

1) Ramirez, Marcelo. Manual de Laboratorio de Inmunología
Clínica. Edición 2013. Santiago, Chile. Pags. 3-6.
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Inmunologia 2

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Inmunologia 2

  1. 1. Informe de Técnicas de Aglutinación por Miguel Angel Figueroa Núñez Inmunología Clínica TM. Marcelo Ramirez Sandoval
  2. 2. TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN 2 ¿DE QUE SE TRATA LA TECNICA DE ELECTROFORESIS PARA PROTEÍNAS? ¿CÓMO FUNCIONA? SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA OBJETIVOS 2 2 3 3 MATERIALES Y METODOS 4 MATERIALES UTILIZADOS METODO OCUPADO CONTROL DE CALIDAD 4 4 5 INTERPRETACIÓN 6 RESULTADOS OBTENIDOS VALORES DE REFERENCIA INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS INTERPRETACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS SIGNIFICADOS CLÍNICOS DISCUSIÓN Y CONCLUCIÓN BIBLIOGRAFÍA 1 6 9 10 10 11 12 13
  3. 3. INTRODUCCION ¿QUÉ SON LAS TECNICAS ELECTROFORETICAS PARA PROTEÍNAS? Por mucho y desde el descucbrimiento de la tecnica de electroforetica que hemos tratado de maximisar su uso para el diagnostico de patologias y revelarnos nuevas aristas acerca de quienes somos y como funciona nuestro cuerpo. En esa misma arista que desde hace un tiempo hemos utilizado esta tecnica para el campo de la inmunología, con el fin de describir y descubrir el desarrollo de enfermedades infecciosas y procesos crónicos que hoy son tratables a traves de la identificación y pesquiza de los elementos que son de importancia inmunoclínica. La electroforesis es el movimiento de partículas (o moléculas) que son separadas de acuerdo a su carga neta en presencia de un campo eléctrico aplicado externamente. La eficiencia de una corrida electroforética dependiente de varios factores como pH y fuerza iónica de la solución buffer, soporte, voltaje aplicado y del calor generado en el proceso (temperatura). ¿CÓMO FUNCIONAN? Se basa en la propiedad de las proteínas para ser separadas de acuerdo con sus respectivas cargas eléctricas a un pH 8,8 sobre una placa de acetato de celulosa o gel de agarosa usando tanto las fuerzas electroforéticas como electroendosmóticas presentes en el sistema. Después que se separen las proteínas la placa se coloca en una solución de ácido sulfosalicílico y de ácido tricloroacético (para inmovilizarlas) y colorante Rojo Ponceau S (para teñir las bandas de proteínas). La intensidad de coloración tiene relación con la concentración de proteínas. Después de la deshidratación en metanol, el fondo de la placa se convierte en transparente por el tratamiento con una solución de limpieza. 2
  4. 4. SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA Su utilidad es gigantesca, pudiendo ser parte del rol diario de un laboratorio, pero además es decidora en cuanto a patologías como Hiperinmunoglobulinemias o desnutrición, o sindrome nefrotico. Todo depende del liquido que se use para su analisis y del cual el medico sospecha de un acercamiento a la alamnesis del paciente. Es importante destacar que a pesar de lo sofisticado que hoy es el metodo por el uso de lectores computarizados con la interpretación de cada banda como un valor aproximado en mg/dL. Este debe ser acompañado de otros analisis, ya que por si solo no contribuye como criterio diagnostico y el tecnologo debe estar atento a que esta tecnica es una contribucion a la ayuda de esclarecer una patología, o simplemente el segumiento de algún tratamiento. OBJETIVOS 1. 2. 3 Utilizar la técnica de electroforesis para separar las diferentes regiones de proteínas séricas en muestras problemas, y así ayudar en el diagnóstico de gamapatías monoclonales y otras patologías. Identificar los diferentes patrones electroforéticos de diagnóstico clínico mediante la utilización de muestras clínicas patológicas.
  5. 5. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES UTILIZADO S INSUMOS             Electra HR buffer (cat. n° 5805), Tris-Barbital-Barbital sódico pH 8.6 - 9.0 Proveedor Diagnostico Ltda.) Placas Acetato celulosa Titan III n° catalogo 3023 Diagnostico Ltda.) Ácido Acético Glacial n° catalogo 1.00063.2500 Metanol n° de catalogo 1.06009.2500 Probeta de 100 mL. Papel filtro Contenedores plásticos Guantes Tijeras Pinzas Horno o Estufa para secado Micropipeta de 20 a 200 uL EQUIPOS    Densitómetro Fuente de poder Cámara de Electroforesis METODO OCUPADO PRUEBA ELECTROFORETICA PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4 Sumergir lentamente la placa a utilizar en buffer barbital pH 8.6 por 15 min. Aproximadamente. Preparar la cámara de electroforesis: poner aproximadamente 100 ml. en cada uno de los compartimentos exteriores de la cámara de incubación. Sumergir dos papeles filtros en el buffer para humedecerlos y utilizarlos como puentes entre la placa y el buffer, pegar cuidadosamente, sin que queden burbujas en las paredes interiores,
  6. 6. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Verificar que queden sumergidos en el buffer. Cubrir la cámara para evitar evaporación. Poner 10 ul de cada una de las muestras de suero u orina en cada pocillo del porta muestras (hasta 7 muestras más un control de calidad interno) Sacar placa, y secar entre dos papeles filtros o blotters, y cortar esquina superior izquierda, para indicar lado de aplicación de muestras. Colocar gota de buffer en base del soporte y colocar la placa sobre este. Aplicación de la muestra: presionar el aplicador 3 - 4 veces sobre la muestra y luego probar aplicando en un papel. Si es correcto volver a tomar muestra y cargar la placa centralmente, dejar presionando aproximadamente 5 segundos. Control de Calidad: Colocar en cada corrida electroforetica en la posición nº 8 un control, normal o bajo, registrar Electroforesis: Colocar la placa con el acetato de celulosa hacia abajo, como es aplicación central, no es necesario dirigirla hacia el cátodo. Esperar 30 segundos y colocar voltaje 180 volts por 15 minutos, después de 2 minutos de haber estado la placa en la cámara (aproximadamente 5mAmp.). Tinción: Colocar en rojo ponceau por 6 minutos. Desteñir en ácido acético al 5 % por 2 minutos agitando, volver a lavar en ácido acético al 5% por 2 Minutos. Deshidratar colocando la placa en metanol absoluto por 2 minutos, dos veces. Preparar solución de Clear Aid: i. 30 partes Ac. Acético glacial ii. 70 partes metanol absoluto iii. 4 partes Clear Aid. iv. Mezclar bien, estable a 15 - 30 °C Transparentar la placa en Clear aid por 8 minutos. Secar en horno o estufa a 37°C por 10 minutos. O a temperatura ambiente. CONTROL DE CALIDAD Como se menciona anteriormente el control de calidad se debe colocar en cada corrida electroforética en la posición nº 8 como Control Normal. También es importante considerar estos puntos: • • • • • 5 Calidad de resolución de la técnica de electroforética (Separación de las bandas). Capacidad para detectar bandas inusuales. Ser metódico en el uso de los materiales para esta técnica y así observar una buena corrida electroforética. Seguir las instrucciones de la técnica. Tener precaución con el tiempo que las muestra biológicas están expuestas después de aplicarlas al pocillo ya que se pueden secar y no serán visibles.
  7. 7. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.   Lectura: Leer la placa en densitómetro a 525 nm. Análisis: Después de Escanear corrida electroforética, interpretar y analizar. INTERPRETACIÓN RESULTADOS OBTENIDOS 1 2 3 4 5 INTERPRETACIÓN DE LO S RESULTADOS MUESTRA N°1 6 6 7 C
  8. 8. MUESTRA N°2 MUESTRA N°3 7
  9. 9. MUESTRA N°4 MUESTRA N°5 8
  10. 10. MUESTRA N°6 MUESTRA N°7 Como observamos en las anteriores imágenes, cada banda fue interpretada por su intensidad de color y fue interpretada bajo una concentración lo que nos servirá comparar los valores de proteínas totales y el patrón electroforético. 9
  11. 11. VALORES DE REFERENCIA FRACCIONES (g/dL) NORMAL Albumina 3,0-5,0 Alpha 1 0,2-0,6 Alpha 2 0,5-1,1 Beta 0,6-1,2 Gamma 1,0-2,0 Proteínas Totales 6,7-8,8 IgA 70-400 mg/dL IgG 700-1600 mg/dL IgM 40-240 mg/dL INTERPRETACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS Con respecto a la muestra n° 1 podemos observar que existe un claro peack en la zona de la fracción Gamma y el analizador nos dijo que el valor de esta aumento a 3,3 g/dL lo que nos dice que en este trazado se observó un SMC (Spike Monoclonal Component), en la región Gamma). Las proteínas Totales de estas muestras observamos un aumento de 9,0 cuando su valor de referencia máximo es de 8,8. Respecto a sus distintos componentes Inmunoglobulinicos, IgA (<50 mg/dL) e IgM (<25 mg/dL) están bajas a comparación de IgG que está sumamente alta. (3490 mg/dL). Por el contrario la muestra 2 es totalmente normal y esta bajo los rangos de referenica. En la muestra n°3 nuevamente nos encontramos con un SMC Gamma que de 3,8 g/dL y así aumentando los valoresde Proteninas Totales. La muestra n°4 muestra una hipoalbuminemia y una hipergamaglobulinemia difusa, explicada por los valores de las 2 primeras bandas son bajos, sin embargo existe un peack monoclonal que eleva los valores. También mostro altos valores de IgA y IgG. Continuando con el análisis en la muestra n°5 observamos un SMC en la región Gamma y un aumento de IgG e IgM. Siguiendo con la muestra n°6 observamos una hipoglobulinemia con un déficit notable de IgG. Por consiguiente observamos además una disminución de las Proteínas Totales. 10
  12. 12. Para finalizar podemos ver en la muestra n°7 un SMC gammaclonal, donde observamos las 3 fracciones bastante elevadas, estas corresponden a un 10,1 % de las muestra. SIGNIFICADOS CLÍNICOS La disminución de la proteína total puede indicar:     Cirrosis Desnutrición Síndrome nefrótico Enteropatía gastrointestinal por pérdida de proteínas El aumento de las proteínas alpha-1 globulina puede deberse a:    Enfermedad inflamatoria aguda Cáncer Enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES) La disminución de las proteínas alfa-1 globulinas puede ser un signo de:  Deficiencia de alfa-1 antitripsina El aumento de las proteínas alfa-2 globulinas puede indicar:   Inflamación aguda Inflamación crónica La disminución de las proteínas alfa-2 globulinas puede indicar:  Hemólisis El aumento de las proteínas beta globulinas puede indicar:       11 Hiperlipoproteinemia (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar) Terapia de estrógenos La disminución de las proteínas beta globulinas puede indicar: Trastorno de coagulación congénito Coagulopatía de consumo Coagulación intravascular diseminada
  13. 13. El aumento de las proteínas gama globulinas puede indicar:       Mieloma múltiple Enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo, artritis reumatoidea, LES) Hiperinmunización Infección aguda Macroglobulinemia de Waldenstrom Enfermedad hepática crónica DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN Como se observó en las imágenes anteriores y en la electroforesis realizada anteriormente podemos darnos cuenta de distintas elevaciones y disminuciones que pueden ser explicadas por diversas patologías así como en la muestra n°2 observamos un patrón electroforético normal. Si bien es cierto en nuestra electroforesis la región 7 y 8 (esta última correspondiente al control) se fusionaron parcialmente, se logra evidenciar parte de sus diferencias y se explica que la placa no estuviese lo suficiente seca previo a la aplicación de las muestras y el control en esa zona, lo que nos indica que el proceso debió realizarse con más cuidado y aunque esto ocurrió, nuestras muestras pueden interpretarse y valorarse, por lo que consideramos que el paso práctico tuvo éxito. Por lo tanto, concluimos que la importancia de esta técnica radica en no solo en los valores entregados por el equipo, sino también en el cuidado y manejo que tenga el tecnólogo en la realización de esta técnica, con el fin de asegurar la calidad y la fiabilidad de los resultados obtenidos. Es importante remarcar el rol que juega esta técnica en otros campos, como en la hematología, bioquímica e incluso en la biología molecular. Pero que es en el campo de la Inmunología clínica donde se ocupa más y donde la valoración y el conocimiento del Tecnólogo médico a cargo juegan un rol importantísimo en la validación de los resultados y en la interpretación definitiva de estos. Lo anteriormente expuesto en este informe y lo enseñado en este práctico es solo un ejemplo más de cómo debemos tener en cuenta el rol que juegan nuestros conocimientos a la hora de exponer resultados o de analizar un caso, puesto que detrás de las muestras hay pacientes, y es satisfactorio que las equivocaciones ocurran en el aula, pero al momento de trabajar debemos abordar esto con la experiencia de que un fracaso no se tratara de una mala calificación, un fracaso puede significar la muerte o el empeoramiento de la calidad de vida de un ser humano. No te frustres de fracasar en la escuela, finalmente es un campo de pruebas, solo intenta practicar mucho para no hacerlo en la vida real. Sir Kent Robinson 12
  14. 14. REFERENCIAS 1) Ramirez, Marcelo. Manual de Laboratorio de Inmunología Clínica. Edición 2013. Santiago, Chile. Pags. 3-6. 2) Gersten, J. Et al. Electroforesis de proteínas en suero. Revisión 2012. Medline Plus. EEUU. www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003540.htm 3) Rajkumar SV. Plasma cell disorders. In: Goldman L, Schafer AI, eds. Cecil Medicine. 24th ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2011:chap 193. 4) Figueroa, Miguel. Castro, Eduardo. Fotografías prueba de electroforesis de proteinas. 2013. Universidad Iberoamericana de Ciencias y Tecnología, Ramo Inmunología Clínica. 5) Imagen Introducción obtenida a traves de Google: http://oldearth.files.wordpress.com/2008/10/electroforesis-deproteinas5.jpg 13

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