El documento describe la reacción antígeno-anticuerpo. Explica que cuando un anticuerpo entra en contacto con su antígeno correspondiente, ambos se unen formando un complejo reversible cuya fuerza de unión depende de la adaptación molecular y los enlaces entre ellos. Además, la reacción es específica, reversible, y sensible al pH, temperatura y fuerza iónica.

1. LA REACIÓNANTÍGENO - ANTICUERPO

2. Concepto de reacción Ag - Ac
• Cuando un Ac entra en
contacto con un Ag contra
el que está dirigido, ambos
se unen formándose un
complejo Ag-Ac.
• La unión Ag-Ac es
reversible.
• La permanencia de la unión
depende de:
• Grado de adaptación entre
ambas moléculas.
• Fuerza y estabilidad de los
enlaces que las unen.

3. Características de laCaracterísticas de la
Interacción Antígeno -Interacción Antígeno -
AnticuerpoAnticuerpo
 EspecíficaEspecífica
 ReversibleReversible
 Dependiente de pHDependiente de pH
 Sensible a la TemperaturaSensible a la Temperatura
 Sensible a la fuerza iónicaSensible a la fuerza iónica

4. Enlaces que intervienen en la unión Ac-Ag
• No son covalentes. Son cuatro tipos:
1. Electrostáticos: Entre grupos iónicos (NH3+
y -COO-) de Prots. distintas.
2. Puentes de hidrógeno entre grupos
polares hidrofílicos (-OH, -NH2, -COOH).
3. Hidrofóbicos: Gr. No polares hidrófobos en
medio acuoso (cadenas laterales de
algunos AA.)
4. De van der Waals: Fuerzas
intermoleculares débiles de origen
eléctrico que se ejercen a distancia entre
moléculas.
• Las fuerzas de unión de cada uno de ellos son
menores que en los covalentes, pero en
conjunto consiguen una considerable energía
de unión.

5. COMPLEMENTARIEDAD DE EPÍTOPE Y
PARATOPE
• EPÍTOPE Y PARATOPE han de
tener estructuras
complementarias que
encajan entre sí.
• Se forman varios enlaces no
coovalentes
simultáneamente.
• La distancia entre Ag y Ac es
muy pequeña en el punto de
unión, lo que incrementa la
fuerza de esa unión.

6. AFINIDAD DEL ANTICUERPO
• Es la fuerza de unión
entre el Ac con su Ag
• Determina la
atracción entre ellos.
• Esa fuerza es la suma
de las fuerzas de los
enlaces que
intervienen en la
unión.

7. AVIDEZ DEL ANTICUERPO
• Es una medida de la fuerza de unión y
estabilidad del complejo:
Ag multivalente – Ac multivalente.
• Ac multivalentes: Tienen más de un
punto de unión para Antígenos.
• Ag multivalentes: Tienen varios
determinantes antigénicos (más de
un punto de unión para los Ac).
• La fuerza de unión es mayor que la
suma de las afinidades de cada uno
de los puntos de unión

8. Cinética de la ReacciónCinética de la Reacción
(ecuación válida solo para moléculas monovalentes)(ecuación válida solo para moléculas monovalentes)
k’
Hapteno + Ac ( Hapteno-Ac)
k
k’
Ka=
k
=
(Hapteno-Ac)
(Hapteno)(Ac)
[Ac] la concentración de sitios libres de Ac[Ac] la concentración de sitios libres de Ac
[Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac[Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac

9. Equilibrio de diálisis
Para calcular Ka

10. ESPECIFICIDAD DEL
ANTICUERPO
• Si un anticuerpo reacciona
solo con un Ag: Es muy
específico.
• Si un Ac reacciona con varios Ag
: Tiene una especificidad
baja. Se habla de
REACTIVIDAD CRUZADA.
• Esto ocurre porque varios
antígenos tienen uno o más
determinantes antigénicos
iguales o similares, capaces
por tanto de unirse al
mismo Ac.

11. REACCIONES
ANTIGENO
ANTICUERPO
APLICACIÓN AL DIAGNOSTICO DE
ENFERMEDADES INFECCIOSAS

12. Los anticuerpos como sondas
para buscar antígenos de
interés
 EspecificidadEspecificidad
 SensibilidadSensibilidad
 EstabilidadEstabilidad
 Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot,Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot,
etc.etc.
 Tiempo de ejecución razonable: minutos aTiempo de ejecución razonable: minutos a ~~ hrshrs
 Costo convenienteCosto conveniente
 Infraestructura mínimaInfraestructura mínima
Ventajas

13. Inmunización con
Carrier-hapteno
Antisuero
Análisis de los Ac. unidos a:
Hapteno
libre Hapten
o
en
otra
Proteín
a
Hapteno
al
mismo
carrier
Los anticuerpos
como sondas para
buscar antígenos
de interés
Ej. Haptenos (drogas, toxinas,
hormonas, etc).

14. Técnicas InmunoanalíticasTécnicas Inmunoanalíticas
- Reacción de precipitación
En medio líquido
• Floculación
• Nefelometría
• Precipitación de complejos Inmunes
En gel • Inmunodifusión doble
• Inmunodifusión radial
• Inmunoelectroforesis
• Rocket electroforesis
• Contrainmunoelectroforesis
• Inmunoelectroforesis cruzda bidimensional de Laurel
- Reacción de aglutinación
• Aglutinación pasiva
• Aglutinación directa
- Fijación y actividad hemolítica del complemento
- Reacciones en fase sólida
o ELISA
o Western blot

15. REACCIONES DE INMUNOPRECIPITACION
CARACTERISTICAS:
Ag solubles
Ac de clase Ig G
Reacción poco sensible
Reacción muy específica
Intervienen Ac policlonales frente a Ag polivalentes

16. •Modalidades:
•Inmunoprecipitación simple en tubo
•Inmunodifusión o Inmunoprecipitación
en medio sólido:
Inmunodifusión simple: en tubo (Oudin)
En placa o Radial (Mancini)
Inmunodifusión doble o radial (Ouchterlony)
Inmunoelectroforesis (Grabar y Willians)
Contrainmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis en cohete (Rocket y Laurel)
Inmunoelectroforesis bidimensional.

17. Reacciones de Precipitación yReacciones de Precipitación y
Floculación en soluciónFloculación en solución
Exceso
A
c
ExcesoAg
Equivalencia
Tiroglobulina agregada (mg)
Precipitadodeproteínas(mg)
Reacciones de sueros humanos de pacientes
con Tiroiditis de Hashimoto auotoinmune.

18. Inmunodifusión DobleInmunodifusión Doble
(o de Ouchterloni)(o de Ouchterloni)
Ej: Mezcla de antígenos y suero
polivalente
AS (pozo central) : Antisuero de conejo anti-suero
humano
HSA: Albúmina humana purificada
HIg: Inmunoglobulina humana purificada
Suero humano
HSA
Suero
humano
HIg

19. Ensayo Immunoturbidimétrico
 Suero + Ag complejos
insolubles
 Aumenta turbidez de la
solución
y puede ser medida
ópticamente
 Turbidez proporcional a la
cantidad
de proteínas en la muestra
Sensibilidad de método
se puede
incrementar con los
anticuerpos
Unidos a látex:
mayores agregados

20. Inmunodifusión RadialInmunodifusión Radial
Anticuerpo incorporado al
gel
El tamaño de los halos es
proporcional a la
concentración del antígeno
Ag

21. • REACCIONES DE AGLUTINACION
• Características:
• Ag particulados, generalmente poliantigénicos
• Ac de clase Ig M e Ig G
• Reacción con Ag superficiales.
• Reacción bastante sensible
• Reacción relativamente específica
• Intervienen Ac policlonales frente a Ag
polivalentes.

22. • Modalidades:
Aglutinación directa:
Cualatitativa/cuantitativa
En tubo/en porta
Aglutinación pasiva:
Prueba de Coombs directa e indirecta
Hemaglutinación pasiva
Prueba de Látex
Pruebas de coaglutinación

23. Reacciones de AglutinaciónReacciones de Aglutinación
Aglutinación Directa: Las partículas o
células tienen un antígeno intrínseco.
Aglutinación Pasiva: partículas o
células a las cuales se le agrega el
antígeno
Se considera aglutinación cuando el antígeno es
particulado y tiene como tamaño mínimo el bacteriano

24. Reacciones mediadasReacciones mediadas
por Complementopor Complemento
Lisis celular

25. REACCIONES DE FIJACION DEL COMPLEMENTO
Reacción positiva (No hemolisis)

26. Reacción Negativa (Hemolisis)

27. Reacciones en fase sólidaReacciones en fase sólida
 ELISA
 Western blots
 Inmunofluorescencia
Cromatografía de Afinidad

28. ELISAELISA
(Enzime linked(Enzime linked
immunosorbent assay )immunosorbent assay )
Detección de anticuerpos Detección de Antígeno

29. Determinación de antígenosDeterminación de antígenos
por ELISApor ELISA
Competencia Sándwich
[ Ag ]
Densidadóptica
[ Ag ]
Densidadóptica
Caso de Haptenos Caso de Proteínas

30. Método indirecto
• También conocido como método Sándwich
(Antígeno-anticuerpos-anticuerpo), se basa en la
fijación de un antígeno a la fase sólida, el cual
atrapa los anticuerpos homólogos en la
muestras que posteriormente son identificados
con un anticuerpo específico marcado con una
enzima. En estos casos la cantidad de antígeno
es directamente proporcional a la cantidad de
producto enzimático formado.

31. POZO DE LA PLACA DE ELISAPOZO DE LA PLACA DE ELISA
MUESTRA DEL PACIENTEMUESTRA DEL PACIENTE
TMBTMB
STOPSTOP
Antígeno enAntígeno en
PlacaPlaca
PP
Anticuerpos anti-IgGAnticuerpos anti-IgG
Humana marcados conHumana marcados con
PeroxidasaPeroxidasa
TÉCNICA DE SANDWICH
Anticuerpos IgG en laAnticuerpos IgG en la
Muestra del pacienteMuestra del paciente

32. Directo
• Detecta al antígeno y se basa habitualmente en
la captura de este por anticuerpos específicos
unidos a una fase sólida
• El antígeno presente en la muestra se combina
con el anticuerpo fijado.
• El antígeno se detecta con otro anticuerpo
específico conjugado a una enzima, se adiciona
un sustrato para la enzima y se mide la
intensidad de color.

33. POZO DE LA PLACA DE ELISAPOZO DE LA PLACA DE ELISA
MUESTRA DEL PACIENTEMUESTRA DEL PACIENTE
TMBTMB
STOPSTOP
Antígeno enAntígeno en
La muestraLa muestra
PP
Anticuerpos IgGAnticuerpos IgG
marcados conmarcados con
PeroxidasaPeroxidasa
TÉCNICA DIRECTA
Placa con AnticuerposPlaca con Anticuerpos
IgG contra el AgIgG contra el Ag

34. POZO DE LA PLACA DE ELISAPOZO DE LA PLACA DE ELISA
MUESTRA DEL PACIENTEMUESTRA DEL PACIENTE
TMBTMB
STOPSTOP
Placa con AnticuerposPlaca con Anticuerpos
De CapturaDe Captura
contra IgM Humanacontra IgM Humana
Anticuerpos IgM en laAnticuerpos IgM en la
Muestra delMuestra del
pacientepaciente
Antígeno enAntígeno en
soluciónsolución
PP
AnticuerposAnticuerpos
anti-antígenoanti-antígeno
marcados conmarcados con
PeroxidasaPeroxidasa
TÉCNICA DE INMUNOCAPTURA

35. Método competitivo
• Se basa en la competencia que se establece entre
un antígeno marcado enzimáticamente y el
mismo antígeno sin marcar (muestra objetivo) al
ser colocados frente a una cantidad limitada del
anticuerpo homólogo fijado a la fase sólida. En
estos casos la cantidad de antígeno es
indirectamente proporcional a la cantidad de
producto enzimático formado.

36. Western blotWestern blot
Anticuerpo específico
Anti-anticuerpo-Enzima
Sustrato
Precipitado producto enzimático
Quimioluminiscencia

37. Inmunofluorescencia indirectaInmunofluorescencia indirecta
Anticuerpo anti-Acrosina
Anticuerpo anti-Ag de
embrión de ratón
Se puede hacer con células vivas o fijadas,
con o sin permeabilizar.

38. Cromatografía de AfinidadCromatografía de Afinidad
Anticuerpo
Anticuerpo no unido
Buffer de elusión
Elución de Anticuerpo
Ej: Purificación de un anticuerpo
uniendo el antígeno a una resina (sp).
Sin embrago, también se puede hacer
lo contrario.

39. Quimioluminiscencia
• Es el fenómeno que ocurre en las
luciérnagas:
• una reacción química con un muy alto
rendimiento energético produce una
molécula potencialmente fluorescente.
• (No hay excitación luminosa como en la
fluorescencia)
• Usualmente son reacciones redox
catalizadas por enzimas que involucran O2
o H2O2 y un sustrato orgánico oxidable. La
energía se libera como luz visible.

40. Quimioluminiscencia
Oxidante
(H2O2,, perborato Na)
Luminol
PO
N2
Intermediario
electrónicamente
excitado
Luz,
425
nm
(3-aminoftalhidrazida)
aminoftalato

41. Quimioluminiscencia
• Se utiliza para detectar
concentraciones muy bajas de
moléculas, menor límite de detección
que en los otros métodos enzimáticos.
• Se marcan Ag o Ac con sustancias que
participan en la reacción
quimioluminiscente (luminol,
peroxidasa).
• Se detecta la señal
quimioluminiscente Se hacen en fase
sólida, o en técnicas homogéneas

42. Electroquimioluminiscencia
• Ej.: determinación de TSH
• Incubación a 37º
Muestra con TSH
Partícula magn
Streptavidina
Anti-
TSH-
biotina
•anti-TSH-Ru(bipy)3

43. Electroquimioluminiscencia
• Ejemplo: TSH
IMÁN
ELECTRODO
Anal Chim Acta, 378, 1(1999)

44. Electroquimioluminiscencia
• Marca: Ru(bipy)2+
3
• Ru 2+
Ru 3+
En presencia de N(Pr)3, en un ánodo,
el pasaje de la forma +3 a +2 va
acompañado de
quimioluminiscencia.,
Con partículas magnéticas y un
imán asociado al electrodo, se
realiza la reacción allí.