ELISA

1. Ensayo por Inmunoabsorción
Ligado a Enzimas
Marcos E. Mendoza R.

2. Se trata de una
técnica de
laboratorio que fue
diseñada por
científicos suecos y
holandeses en 1971,
que permite detectar
pequeñas partículas
llamadas antígenos,
que habitualmente
son fragmentos de
proteínas.
Para poder
identificar los
antígenos se utilizan
moléculas con dos
componentes
acoplados:
un anticuerpo (que
se une al antígeno de
forma específica) y
una enzima (que se
activa y señala la
unión al antígeno).
Antes del
descubrimiento del
ELISA se utilizaban
moléculas
radioactivas en vez
de enzimas, lo que
suponía un riesgo
añadido innecesario
en el laboratorio y un
mayor costo.

3. Es un ensayo de bioquímica analítica que permite detectar y
cuantificar cantidades muy pequeñas de analitos en solución, por
medio de un anticuerpo conjugado a una enzima .
Los ensayos de ELISA se utilizan como una potente herramienta
de control de calidad en diversos sectores y de diagnóstico en
enfermedades humanas y animales (por ejemplo, metabólica o
cardiovascular); detección de toxinas, drogas o contaminantes
en los alimentos.
Se basan en la interacción antígeno-anticuerpo, que es
analizada a través del marcaje con una enzima (en la mayoría de
los casos con HRP). Esta enzima cataliza una reacción en la que
un sustrato se transforma generando un producto coloreado que
puede cuantificarse mediante un espectrofotómetro.

4. Se usa en muchos laboratorios para
determinar si un anticuerpo particular
esta presente en la muestra de sangre de
paciente.
Aunque el procedimiento es rutinario y
sencillo, involucra a un gran numero de
variables, tales como:
Selección de reactivo, temperatura,
medición de volumen y tiempo, que si
no se ajusta correctamente pude afectar
los resultados de la prueba.

5. La interacción de antígeno-anticuerpo
en el laboratorio
Puede ser utilizada para
determinar si un paciente
tienen una infección o una
enfermedad autoinmune
1. Un resultado positivo que confirma la presencia de
anticuerpos no significa necesariamente que el
paciente esté enfermo.
El cuerpo de una persona que ha estado enferma y
que ya se ha recuperado puede seguir produciendo
anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.

6. 2. hay personas que producen una
baja cantidad de anticuerpos, por lo
que estos pueden pasar
desapercibidos y no ser medidos,
dando lugar a un falso negativo.
Sería el caso, por ejemplo, de
personas que padezcan una
inmunodeficiencia, o que se
encuentren en el periodo ventana
de la infección en el momento de
realizar la prueba, o que estén
infectadas por una cepa extraña.
3. pueden aparecer falsos
positivos cuando se da
inespecificidad entre
antígeno-anticuerpo.

7. Fases de un ensayo ELISA
• El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los
ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno
marcado se emplea en ensayos de competición de
antígeno.
1.Conjugación del
anticuerpo o del
antígeno con una
enzima
• La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con
facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen
gran afinidad por proteínas. Si se usa mucho antígeno, se
pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se
usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción
falsa negativa.
2.Unión del
antígeno (o del
anticuerpo) a los
pocillos
• En el caso del antígeno unido a la placa, se puede
detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado
(ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario
anti-antígeno y un secundario anti-primario marcado
(ELISA indirecto). Este segundo método permite la
amplificación de la señal al poderse unir uno o más
anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario.
3.Formación de
una o más capas
de
inmunocomplejos

8. 4. Revelado de la
reacción
enzimática
•
•Después de un lavado para eliminar todas las
moléculas marcadas no fijadas en forma de
inmunocomplejos; se añade el sustrato enzimático
en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad
óptica mediante espectrofotometría

9. Tipo de ELISA
ELISA competitivo
• En este método, el anticuerpo de la
muestra va a competir con el
conjugado por un numero limitado de
sitios de unión del antígeno. Habrá
ausencia de color en una muestra
positiva debido a que el sustrato no
encontrara a la enzima porque el
conjugado ha sido desplazado por
anticuerpo presente en la muestra.
ELISA no competitivo
• Consiste en enfrentar la muestra con
el antígeno o anticuerpo que esta en
la fase solida. Si una muestra es
positiva se formara el complejo
antígeno-anticuerpo y al agregar el
conjugado reaccionara con el
respectivo sustrato desarrollando
color.

10. ELISA NO COMPETITIVO
ELISA directo
• Si la prueba se
diseña para
detectar un
antígeno, es un
ELISA
DIRECTO,
porque esta
buscando
sustancia extraña.
ELISA indirecto
• En cambio un
ELISA
INDIRECTO, por
su parte se diseña
para detectar los
anticuerpos que el
paciente ha creado
contra el antígeno.

12. ELISA
directo
• Es la forma más básica de realizar la técnica. Consiste en
recoger una muestra a estudiar y ponerla en un pocillo (un
recipiente pequeño) en frente de una muestra igual pero
contaminada con el germen a estudiar, y otra muestra en la
que se sabe que no hay germen.
ELISA
indirecto
• Se realiza de forma similar al ELISA directo, pero en este
caso se añade primero un anticuerpo sin enzima y después
uno con enzima. De esa forma, la señal que emite el enzima
es mucho más potente y la prueba es más sensible.
ELISA
sándwich
• En este caso en los pocillos primero se añade un anticuerpo y
después la muestra, para que los antígenos queden ya
retenidos en el fondo del pozo. Después se añade el
anticuerpo con la enzima.

13. Cúando se hace una ELISA
Diagnóstico de VIH:
• Es la primera prueba que se realiza para descartar una infección
por VIH. Se trata de una prueba muy sensible, así que prácticamente
detecta todos los casos. Sin embargo, puede dar falsos positivos, por
lo que se suele repetir de nuevo un ELISA y se confirma con
un Western-Blot.
Diagnóstico de hepatitis B:
• Al igual que con el VIH, el virus de la hepatitis B puede ser reconocido
fácilmente mediante un ELISA en sangre.
Detección de antígenos en orina:
• Es una prueba muy útil y sencilla para identificar gérmenes causantes
de neumonías. En las infecciones respiratorias las bacterias pasan a
la sangre y de ahí a la orina, por lo que se pueden identificar
antígenos fácilmente con un ELISA, que orienta el tratamiento
antibiótico directamente.

14. Cómo se hace una ELISA
1. Una vez depositada la muestra se añaden
los anticuerpos que detectan los antígenos si los hay. En
el otro extremo de los anticuerpos hay enzimas acopladas.
2. Si es un ELISA indirecto se pueden añadir otros
anticuerpos que detecten los anticuerpos previos; así se
amplía la señal.
3. Se realiza un lavado de los pocillos; así se eliminan los
anticuerpos que no estén unidos a antígenos.

15. 4. Se añade un sustrato, es decir, una sustancia química
que reacciona con las enzimas de los anticuerpos que
queden. Al reaccionar se forman metabolitos.
5. Por último, se mide la cantidad de metabolito que hay
mediante diferentes técnicas, como la espectrofotometría.

16. Tipos de reactivo que
generan color
• Peroxidasa,
• Fosfatasa alcalina,
• Beta-glucosidasa,
• Glucosa oxidasa) para todos los ELIASA

17. Resultados de la prueba de ELISA
Cuando el ELISA es positivo quiere decir que se han detectado
antígenos en la muestra recogida, y por tanto hay gérmenes
presentes. Cuando es negativa, no se han podido detectar
antígenos y se considera que la muestra no está contaminada.
En las situaciones en las que el ELISA sea determinante y
cambie radicalmente la actitud del médico, es habitual
realizar la prueba dos veces seguidas;
Es el caso de la prueba del VIH: su diagnóstico es
determinante para una persona, y por eso se realizan dos
ELISA seguidos y otra técnica más que permite confirmar el
diagnóstico con mucha más fiabilidad.

19. GRACIAS…