monografía

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MONOGRAFÍA
CURSO BIANUAL DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Organizado por Asociación de Infectología y Microbiología Clínica de
Tucumán (ASIM).
MARÍA EUGENIA MÓNACO
2010

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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL:
APLICACIONES EN EL PACIENTE TRANSPLANTADO
Las técnicas de Biología Molecular (BM) permiten la detección de material
genético (Ácidos Nucleicos), tanto DNA como RNA, que constituyen la
característica inequívoca de especie y sus modificaciones como mutaciones,
deleciones y translocaciones, las cuales tienen diferentes implicancias según la
situación estudiada. Estas técnicas permiten la detección de porciones de ácidos
nucleicos (AN) (DNA o RNA) que son específicos de cada microorganismo, en
diferentes materiales clínicos. Su aplicación, surge como una necesidad para
poder detectar microorganismos de difícil crecimiento en cultivos o desarrollos
tardíos y donde las técnicas serológicas de detección de antígenos (Ag) y
anticuerpos (Ac) carecen de suficiente sensibilidad y especificidad diagnóstica.
Esta circunstancia se ajusta principalmente a la detección de virus, es por ello, que
el desarrollo de técnicas moleculares comenzó en esta área.
Las primeras técnicas genéticas utilizadas en el diagnóstico microbiológico
se basaban en hibridación con sondas de ADN. Aunque de elevada especificidad,
en general su sensibilidad no es adecuada. La estrategia más utilizada para
aumentar la sensibilidad se basa en crear múltiples copias de un fragmento del
genoma. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) supuso un
gran avance y permitió introducir la biología molecular de forma generalizada en
los laboratorios asistenciales. Se trata de una reacción enzimática sencilla, rápida
y susceptible de ser automatizada.
En el ámbito de la microbiología clínica, la PCR se ha aplicado en tres
grandes campos:
1. Diagnóstico etiológico. La PCR es sobre todo útil en ausencia de
métodos de diagnóstico alternativos o cuando éstos son muy complejos, para
mejorar la eficacia diagnóstica complementando métodos convencionales o si se
requiere un diagnóstico rápido y precoz del agente etiológico para poder iniciar el
tratamiento específico lo antes posible.
2. Control del tratamiento con antimicrobianos. La PCR se utiliza tanto para
la selección de los pacientes que deben ser tratados como para, una vez iniciado
el tratamiento, comprobar su eficacia, siendo importante para ello disponer de
métodos cuantitativos.
3. Caracterización genética de agentes infecciosos. Genotipificación;
identificación de mutaciones determinantes de resistencias a fármacos o de
virulencia; epidemiología molecular; etc.
La PCR convencional en el contexto de la microbiología clínica
El proceso de detección de un agente infeccioso por amplificación genética
se desarrolla de manera habitual en tres etapas. La primera consiste en la
extracción y purificación de los ácidos nucleicos del microorganismo de la muestra

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biológica, seguido de la amplificación de un segmento seleccionado del genoma
del microorganismo mediante reacción en cadena de la polimerasa, es decir, la
PCR propiamente dicha. Finalmente, en la tercera etapa se lleva a cabo la
detección de los fragmentos amplificados en la PCR (amplicones) por
electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio, o mediante
hibridación con sondas específicas. En general todo este proceso suele durar
aproximadamente 48 h – 72 h.
Por otro lado, la cuantificación del ADN diana en la muestra por PCR
convencional, resulta complicada. La dificultad principal radica en que la eficacia
de amplificación de la PCR va disminuyendo con el tiempo, hasta que la reacción
llega a una fase de saturación en la que ya no se produce incremento de ADN.
Puesto que los fragmentos amplificados se detectan al final de la PCR cuando la
mayoría de reacciones han alcanzado ya la fase de saturación, la cantidad de
ADN obtenido no suele guardar mucha relación con la concentración inicial de
ADN en la muestra. Además, al ser la PCR una reacción de tipo exponencial,
pequeñas oscilaciones en la eficacia de amplificación para cada muestra se
traducen en importantes variaciones en la cantidad de ADN obtenido al final del
proceso.
La PCR en tiempo real
En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se
producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de
ninguna acción posterior. Además, mediante detección por fluorescencia se puede
medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento,
ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la
cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la
cinética de la reacción de amplificación.
Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un
lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier
momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la
amplificación. Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR
a tiempo real pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondas
específicas marcadas con fluorocromos.
Agentes intercalantes
Son fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia
cuando se unen a ADN de doble hélice. El más empleado en PCR a tiempo real es
el SYBR Green I. El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un aumento
proporcional de la fluorescencia emitida. Este sistema de detección tiene la
ventaja de que la optimización de las condiciones de la reacción es muy fácil y
además, es más barato que las sondas específicas. El principal inconveniente de
los agentes intercalantes es su baja especificidad, debido a que se unen de
manera indistinta a productos generados inespecíficamente o a dímeros de
cebadores, muy frecuentes en la PCR. Para mejorar la especificidad se deben
emplear condiciones de reacción óptimas y una selección cuidadosa de los

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cebadores para disminuir el riesgo de formación de dímeros. Además, es
recomendable iniciar la reacción de síntesis de ADN a temperaturas elevadas (hot-
start PCR) lo cual disminuye de forma notable el riesgo de amplificaciones
inespecíficas. Para ello se pueden usar polimerasas recombinantes modificadas
que sólo funcionan después de ser activadas a temperaturas elevadas o
anticuerpos que bloquean el centro activo de la polimerasa hasta que la reacción
alcanza temperaturas altas en las que el anticuerpo se desnaturaliza liberando la
polimerasa y permitiendo su actividad. Además, la mayoría de los equipos para
PCR a tiempo real tienen la posibilidad de determinar la temperatura de fusión de
los fragmentos amplificados (Tm = temperatura a la que el 50% del ADN de la
molécula está desnaturalizado). Cada fragmento amplificado tiene una Tm
característica, que depende sobre todo de su longitud y de la composición de sus
bases. Esta aplicación permite comprobar, la especificidad de los fragmentos
detectados en la PCR. Por otra parte, los agentes intercalantes no permiten la
identificación de polimorfismos en la secuencia diana.
Diagrama esquemático que muestra el formato SYBR GREEN:
Sondas de hibridación específicas
Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un
aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante
resonancia (FRET) entre las dos moléculas.
1. Sondas de hidrólisis.o sondas TaqMan. Son oligonucleótidos marcados
con un fluorocromo donador en el extremo 5’ que emite fluorescencia al ser
excitado y un aceptor en el extremo 3’ que absorbe la fluorescencia liberada por el
donador. Para que esto ocurra, las moléculas donadora y aceptora deben estar
espacialmente próximas. Además, el espectro de emisión de la primera se ha de
solapar con el espectro de absorción de la segunda. Mientras la sonda está
intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor. Sin
embargo, durante la amplificación de ADN diana, la sonda se hibrida con su
cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo de la cadena, en su acción de
síntesis, la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, que tiene actividad 5’

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exonucleasa, hidroliza el extremo libre 5’ de la sonda, produciéndose la liberación
del fluorocromo donador. Como donador y aceptor están, ahora, espacialmente
alejados, la fluorescencia emitida por el primero es captada por el lector.
Diagrama esquemático que muestra el formato TaqMan:
2. Molecular beacons. Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una
molécula donadora en el extremo 5’ y una aceptora en el extremo 3’ pero,
además, presentan una estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la
secuencia de unión específica con el ADN diana. Los extremos permanecen
plegados cuando la sonda no está hibridada, lo que conlleva que donador y
aceptor estén muy cerca uno de otro. En esta conformación la fluorescencia
emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del
equipo. Sin embargo, al hibridar con el ADN diana la sonda se abre, alejándose
donador y aceptor, pudiendo ser detectada la fluorescencia emitida por el primero.
Diagrama esquemático que muestra el formato Molecular beacons:

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3. Sondas FRET. El sistema se compone de dos sondas que se unen a
secuencias adyacentes del ADN diana. Una de las sondas lleva un donador en el
extremo 3’ y la otra un aceptor en el extremo 5’. Cuando las sondas están
hibridadas, los dos fluorocromos están próximos. Al ser excitado, el donador
transfiere su energía al aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que detecta
el lector del equipo.
En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se
corresponde con un aumento de hibridación de las sondas, lo que conlleva un
aumento en la misma proporción de fluorescencia emitida. El empleo de sondas
garantiza la especificidad de la detección y permite identificar polimorfismos o
mutaciones puntuales, pero su costo es más elevado que el SYBR GREEN y la
optimización de las condiciones de la reacción resulta más complicada.
Diagrama esquemático que muestra el formato de sondas FRET
Ventajas de la PCR a tiempo real
La primera gran ventaja de la PCR a tiempo real es su rapidez, puesto que
no se necesita ningún proceso adicional de detección. Además, debido a esta
característica, estos equipos se pueden rentabilizar al máximo, permitiendo un
flujo mucho mayor de muestras y de ensayos. Otra ventaja muy importante de la
PCR a tiempo real es que al utilizar sistemas cerrados, el riesgo de contaminación
disminuye de forma muy importante.
Los sistemas a tiempo real permiten cuantificar la concentración inicial de
ácido nucleico presente en las muestras de manera mucho más sencilla, más
precisa y sobre todo en un rango mucho mayor (5-6 log) que en los
procedimientos convencionales (2-4 log). Asimismo, la determinación de
mutaciones puntuales que pueden estar relacionadas con resistencias a
medicamentos antimicrobianos o con factores de virulencia, es mucho más fácil.
Los equipos para PCR a tiempo real tienen una capacidad muy elevada ya
que en el mismo instrumento se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos,

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cuantitativos, determinación de mutaciones, PCR múltiples, etc., mientras que
para los procedimientos convencionales se requieren múltiples equipos.
Aplicaciones de la PCR a tiempo real en la microbiología clínica
Las aplicaciones de la PCR a tiempo real en el campo de la microbiología
clínica no difieren de las que ya se han comentado al principio de esta revisión
para la PCR convencional.
No obstante, es previsible que gracias a sus indudables ventajas y a la
sencillez de su empleo, la PCR a tiempo real vaya reemplazando la PCR clásica, y
que su aplicación se extienda a un número cada vez mayor de agentes
infecciosos, implementándose progresivamente en el laboratorio de rutina.
Algunas empresas de diagnóstico (Roche Diagnostics, Artus, Abbott, Celera) han
hecho ya una apuesta decidida por la nueva tecnología y tienen disponibles kits
para el diagnóstico de los agentes infecciosos de mayor interés comercial
mediante sistemas de PCR a tiempo real (VIH, VHB, VHC, citomegalovirus). Sin
embargo, hay muchas enfermedades infecciosas, con menor interés comercial, en
las que el uso de métodos moleculares de diagnóstico aporta indudables ventajas.
La PCR a tiempo real, combinada con los nuevos sistemas automáticos
para la preparación de las muestras, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo
de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificación o
cuantificación de esos agentes infecciosos. Es el caso de muchos virus (familia de
los Herpesvirus, virus respiratorios, enterovirus, virus JC, virus BK, etc.) o de
bacterias que no crecen en medios de cultivo como Tropheryma wippeli, o que
crecen mal como Bordetella pertussis o Bartonella o muy lentamente como
Mycobacterium tuberculosis. También, de micosis invasivas, especialmente por
Aspergillus ssp. o de infecciones parasitarias como las ocasionadas por
Toxoplasma gondii en líquido amniótico o en líquido cefalorraquídeo (LCR).
Otro campo potencial de aplicación de la PCR a tiempo real es en la
identificación de organismos fácilmente cultivables, cuya detección rápida sea
beneficiosa por algún motivo. Por ejemplo, la identificación de Streptococcus del
grupo B (S. agalactiae) en frotis vaginales. La colonización del tracto genital de
mujeres parturientas por este agente se relaciona con un mayor riesgo de
infección neonatal grave. El tiempo necesario para el aislamiento de esta bacteria
mediante cultivo es de 1-2 días, mientras que por PCR a tiempo real su
identificación se puede llevar a cabo en 30 min. La reducción del tiempo de
diagnóstico puede mejorar la prevención de esas infecciones en recién nacidos.
En otros casos, como la sepsis, la supervivencia del enfermo puede
depender de un diagnóstico precoz del agente causal que permita establecer el
tratamiento antibiótico específico en etapas tempranas del proceso.
Probablemente en pocos años se habrán optimizado protocolos de PCR múltiple a
tiempo real para la identificación de los 10 o 20 agentes más frecuentes de la
sepsis en unas pocas horas.
Lógicamente, la PCR a tiempo real no va a reemplazar al hemocultivo,
porque la sepsis puede estar ocasionada por una variedad de microorganismos
mucho más amplia, pero la demora en el tratamiento se podrá reducir en un

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número considerable de casos, lo que sin duda puede mejorar el pronóstico de
este grave proceso.
El éxito de un tratamiento no sólo se basa en un diagnóstico etiológico
precoz, sino que en muchas ocasiones la determinación rápida de la sensibilidad
del agente causal a los fármacos antimicrobianos puede ser determinante.
La PCR a tiempo real proporciona métodos ágiles y sencillos para la
identificación de mutaciones puntuales asociadas con resistencias a fármacos
antimicrobianos. Por ejemplo, en apenas dos horas se puede determinar la
presencia en heces de enterococos resistentes a vancomicina facilitando el control
de la transmisión de este patógeno en los centros sanitarios.
En los últimos años se han desarrollado métodos sencillos para la detección
rápida de mutaciones asociadas con resistencias a meticilina en Staphylococcus
aureus y a rifampicina y a isoniacida en Mycobacterium tuberculosis. También se
han descrito procedimientos para la identificación de mutaciones asociadas con
resistencia a agentes antivíricos, como la lamivudina en VHB.
No obstante, hay que hacer hincapié en que esta potente metodología sólo
será útil si los laboratorios de microbiología clínica participan en programas de
control de calidad bien definidos.
PCR en tiempo real, una nueva herramienta para el diagnóstico de las
infecciones virales en el paciente trasplantado
Las complicaciones infecciosas continúan siendo la causa principal, junto al
rechazo, de la morbilidad y mortalidad después del trasplante de órganos. Muchas
de estas complicaciones tienen un origen exógeno, incluyendo las producidas por
aquellos patógenos transmitidos por el órgano trasplantado. En otras ocasiones,
es el propio receptor el que alberga previamente, de forma crónica o latente,
microorganismos que pueden reactivarse.
Ciertas complicaciones pueden prevenirse, o sus efectos negativos
aminorarse, mediante una correcta evaluación de donante y receptor. El número
de patógenos, tanto primarios como oportunistas que pueden afectar al
trasplantado es amplísimo y la integración del microbiólogo/infectólogo en
“equipos multidisciplinarios” de trasplante es un requisito clave para llevar a cabo
un diagnóstico eficaz de las complicaciones infecciosas, en beneficio del
trasplantado, y para optimizar los recursos.
En la actualidad, el paciente trasplantado, ha logrado mayor tiempo de
sobrevida debido al avance en el manejo clínico y terapéutico. Pero, pese a la
aplicación de las nuevas técnicas quirúrgicas y terapias inmunosupresoras
dirigidas a evitar el rechazo del órgano trasplantado, el factor de riesgo más
importante en estos pacientes son las infecciones primarias y la reactivación post-
trasplante de algunos virus latentes.
El riesgo de infección viral tras el trasplante está condicionado por la suma
de muchos factores entre los que se incluyen la intensidad, virulencia y
mecanismos de la exposición viral, la intensidad y tipo del régimen de
inmunosupresión y la presencia o ausencia de inmunidad antiviral preexistente. A

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pesar de esta variabilidad, se puede distinguir un patrón general en la cronología
de estas infecciones tras el trasplante.
Diagrama esquemático que muestra la cronología de las infecciones virales
más frecuentes luego del transplante
Así, los pacientes infectados por virus de herpes simple (VHS) pueden
presentar una reactivación precoz durante los primeros dos meses postrasplante.
Igualmente, las infecciones adquiridas a través del injerto, como las producidas
por virus de la hepatitis B (VHB) y C (VHC) y virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH) pueden aparecer en el primer mes tras la cirugía. Respecto al
citomegalovirus (CMV), tanto la reactivación como la infección adquirida en
período peritrasplante, suelen producirse entre el primero y el cuarto mes
postrasplante, aunque en la actualidad se describen cada vez con más frecuencia
episodios de enfermedad por CMV más allá de este período (enfermedad tardía
por CMV). Ello se ha relacionado fundamentalmente con las pautas de profilaxis
universal en el caso de Transplante de Organos Sólidos o con la aparición de
enfermedad injerto contra huésped (EICH) crónica en receptores de Transplantes
Progenitores Hematopoyéticos.
Otros virus latentes como el virus de Epstein-Barr (VEB) y el virus herpes-
zoster (VHZ) se presentan mayoritariamente entre el segundo y el sexto mes
postrasplante. En el caso del poliomavirus BK, se ha observado una distribución
bimodal en la presentación de los casos; el 50% de ellos aparece durante las

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primeras 8 semanas postrasplante y el resto en períodos posteriores que pueden
abarcar desde meses hasta años tras el trasplante. Finalmente, las infecciones por
virus adquiridos en la comunidad como Influenza, virus sincitial respiratorio (VSR)
y adenovirus pueden aparecer en cualquier período.
Desde el laboratorio, se acompaña con nuevas técnicas para diagnosticar
tempranamente estas infecciones que, anteriormente, eran consideradas fatales.
Infecciones por CMV y EBV en el paciente trasplantado
Los síntomas relacionados a la infección y enfermedad, varían en los
diferentes pacientes, según el tipo de trasplante e intensidad de la
inmunosupresión.
En la población trasplantada, existen, tres patrones de infección para estos
virus, cada uno con diferente probabilidad de causar enfermedad clínica. La
infección primaria, como mayor factor de riesgo para el desarrollo de enfermedad,
se presenta en individuos seronegativos que reciben órganos o productos
derivados de sangre seropositivos. Este es el mayor factor de riesgo para el
desarrollo de enfermedad.
La infección secundaria o reactivación de infección latente ocurre
postrasplante en pacientes seropositivos, que a menudo permanecen
asintomáticas por la movilización de la memoria inmunológica. En este caso, el
factor más crítico, es el tipo e intensidad de terapia inmunosupresora.
Por último, la reinfección o superinfección con una nueva cepa, es otra de
las posibilidades. El mayor factor de riesgo es el estado serológico del receptor del
trasplante. Los riesgos de enfermedad resultan más altos en donante positivo y
receptor negativo, remarcando como se ha dicho, la importancia del grado de
inmunosupresión que presente el paciente.
En todos los casos la falla para reconstituir la inmunidad celular específica
después del trasplante conduce a la progresión de la enfermedad.
Virus Epstein Barr humano (EBV)
El EBV es el agente causal de la Mononucleosis infecciosa (MI). En la
infección primaria, su habilidad para infectar e inmortalizar linfocitos B es
balanceada por la respuesta efectiva de células T, provocando un estado de
latencia, donde el virus puede ser encontrado en algunas células B de la sangre
periférica.
Luego del trasplante puede sobrevenir la infección primaria, de mayor
riesgo en la población pediátrica, atento a la mayor probabilidad de los niños de
ser seronegativos para EBV con anterioridad al trasplante. La reactivación ocurre
regularmente, siendo asintomática en individuos inmunocompetentes, pero
pudiendo traer complicaciones en los pacientes en estado de inmunosupresión.
Tanto la infección primaria como la reactivación, se asocian frecuentemente
con la enfermedad linfoproliferativa post trasplante (ELPT), que aún, con el mejor
tratamiento disponible, es una de la complicaciones más importantes en el
paciente trasplantado, ya que la mitad de ellos fallecen dentro del término de un

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año. La enfermedad linfoproliferativa postrasplante (ELPT) engloba a un grupo
heterogéneo de trastornos linfoproliferativos que comprenden desde un síndrome
mononucleósico inducido por el VEB hasta proliferaciones monomórficas muy
agresivas, las cuales pueden ser indistinguibles de formas graves de linfoma. Esta
proliferación linfoide aparece como consecuencia de las pautas de
inmunosupresión que son instauradas tras el trasplante, las cuales condicionan un
descenso en la función de células T específicas frente al VEB. Esto desencadena
una proliferación incontrolada de células B infectadas por dicho virus.
Clasificación actual de la OMS de la enfermedad linfoproliferativa
postrasplante
Existe amplia evidencia respecto a que la Mononucleosis infecciosa
complicada y el riesgo de desarrollar ELPT, están asociadas a las altas cargas
virales de EBV en sangre. Por el contrario, la remisión de la enfermedad se
correlaciona con la disminución de esa carga viral. De allí que el monitoreo de la
viremia de EBV es sumamente importante, en el diagnóstico y tratamiento de
ELPT.
Citomegalovirus ( CMV)
El estado de inmunocompromiso postrasplante, provee un medioambiente
ideal para que este virus ejerza su potencial patogénico. Los efectos de la
infección por CMV pueden ser clasificados en directos e indirectos.

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El CMV puede producir tanto efectos directos como indirectos.Entre los
efectos directos se incluyen el síndrome viral (fiebre acompañada de neutropenia,
trombopenia o alteración de transaminasas) y la enfermedad invasora por CMV,
cuyo riesgo se incrementa de forma exponencial con el aumento de la carga viral.
Entre los órganos más frecuentemente afectados se encuentran el pulmón, el
hígado, el tracto gastrointestinal y la retina, en los cuales se produce una
respuesta inflamatoria responsable del daño tisular. Para el diagnóstico de certeza
de enfermedad por CMV se requiere la presencia de un cuadro clínico analítico
compatible junto con la demostración de lesiones histológicas en una biopsia
(inclusiones intracelulares en “ojo de lechuza”) y/o cultivo positivo para CMV. En el
caso de la neumonía, se acepta la detección del virus en el lavado broncoalveolar.
Inclusiones citomegálicas en “ojo de
lechuza”.
Los efectos indirectos, a diferencia de la enfermedad invasora, son
independientes del grado de viremia, y resultan de la interacción del CMV con la
respuesta inmune del huésped. Estos efectos pueden estar, al menos en parte,
relacionados con la presencia durante largos períodos de tiempo de baja
concentración de replicación viral, lo que facilitaría una disfunción de los linfocitos
CD4+ y macrófagos inducida directamente por el CMV e indirectamente a través
de la producción de citocinas supresoras. Entre los numerosos efectos indirectos
del CMV descritos hasta el momento se encuentran un aumento en el riesgo de
rechazo y disfunción del injerto, ateroesclerosis acelerada en el trasplante
cardíaco, bronquiolitis obliterante (BOS) en el trasplante pulmonar, infecciones
oportunistas, neoplasias, síndrome de Guillain-Barré y diabetes mellitus
postrasplante
En ambos tipos de efectos, el tiempo de sobrevida del paciente disminuye.
Varios aspectos de la biología del CMV, conducen a concluir que la diseminación
en sangre, se produce en la infección activa, siendo la viremia reconocida como el
mayor factor de riesgo para la progresión a la enfermedad clínica. El manejo
apropiado de estos pacientes, depende de la detección temprana y la
cuantificación de la viremia, para identificar el riesgo de enfermedad,
diagnosticando la infección y determinando la respuesta y duración del
tratamiento.

13. 13
La introducción de los ensayos de antigenemia y moleculares marcó una
nueva era en la habilidad para detectar rápidamente la infección citomegálica y
conducir al uso de terapia adecuada.
Efectos de citomegalovirus en pacientes trasplantados.
Estrategia de prevención de enfermedad
En las últimas décadas, la práctica de la prevención y el manejo del
paciente trasplantado, ya sea en órgano sólido o hematopoyético, han
evolucionado notoriamente. El manejo de las infecciones producidas por estos

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virus abarca la identificación del factor de riesgo, la detección temprana de
infección, seguida por la iniciación de terapia antiviral, la estrategia antiviral
profiláctica y reducción en inmunosupresión.
Para prevenir el desarrollo de enfermedades causadas por estos virus se
utilizan dos estrategias básicas:
- La primera, consiste en administrar un agente antiviral efectivo, a los
pacientes con posibilidad de reactivación del virus (profilaxis).
- La segunda, sólo utilizable en individuos con reactivación viral
demostrada, consiste en usar un antiviral, pero antes de que ocurra la enfermedad
(terapia temprana o pre-emptive). Un uso selectivo de las drogas antivirales por un
corto período de tiempo en pacientes de alto riesgo, podría evitar los efectos
colaterales innecesarios relacionados con la prolongada terapia, acelerando la
reconstitución inmune y evitando la enfermedad tardía.
Para esta segunda estrategia, es importante un rápido diagnóstico de las
infecciones que permita el manejo crítico de la enfermedad. De allí la relevancia
de contar con un marcador sensible y temprano de reactivación y métodos de
laboratorio cuantitativos rápidos, sensibles y precisos para monitorear la carga
viral.
Diagnóstico CMV y EBV en el paciente trasplantado
La introducción de diagnósticos sensibles y rápidos que detecten
replicación viral e infección activa antes del comienzo de la enfermedad, posibilita
una terapia temprana que efectivamente administrada a pacientes con alto riesgo,
evita el desarrollo de la enfermedad, y también, la profilaxis indiscriminada a
individuos sin factores de riesgo.
Hasta hace poco tiempo atrás, la aplicación primaria de los tests
diagnósticos de laboratorio, consistían en confirmar o excluir el agente etiológico,
EBV o CMV, como causa de los síntomas clínicos. Actualmente, en cambio, el
incremento de la vigilancia y la terapia temprana (pre-emptive), demuestran la
necesidad de tests más sensibles que detecten la infección con anterioridad al
comienzo de los síntomas clínicos.
Son varios los requisitos para monitorear un ensayo de CMV o EBV:
1) Alta sensibilidad para permitir una detección temprana del riesgo de
enfermedad.
2) Potencial para cuantificar los resultados e incrementar el valor predictivo
positivo de detección de la enfermedad y posibilitar el seguimiento del tratamiento
antiviral.
3) Rapidez en la instauración o cambio de tratamiento.
En la actualidad, los métodos de detección de antígeno y moleculares
cuantitativos, están disponibles y cumplen estos requerimientos.
El ensayo de antigenemia pp65, método cuantitativo específico desarrollado
a principio de los años 90, ha sido ampliamente utilizado en el diagnóstico de la
enfermedad y monitoreo de la terapia. Sin embargo, este ensayo puede tener
falsos negativos debido a la baja expresión del antígeno en pacientes con bajo
recuento celular. Además, es éste un ensayo laborioso que requiere el
procesamiento inmediato de las muestras y su interpretación es subjetiva.

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En cambio, la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), ha
revolucionado el diagnóstico virológico otorgando una poderosa herramienta para
detectar y cuantificar ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico)
viral en muestras clínicas. Esta técnica otorga la oportunidad de mejorar
sustancialmente la detección de muy bajo nivel de viremia, así como también, la
de monitorear la eficacia de la terapia antiviral.
La detección cualitativa del ADN por PCR en muestras de sangre provee
una sensibilidad cercana al 100% para la detección de la enfermedad, pero una
especificidad de sólo el 50% o menos, ya que no permite diferenciar entre
infección latente y enfermedad activa.
La detección de ARNm (Ácido Ribonucleico mensajero), indica replicación
viral e infección activa, sin embargo este ensayo posee menor sensibilidad que los
dos anteriores. La PCR cuantitativa es diseñada con una menor sensibilidad para
mejorar la especificidad clínica. La PCR en tiempo real ha introducido un test
altamente sensible, específico, rápido y cuya relación costo beneficio es positiva
para determinar la carga viral.
La PCR en tiempo real ha revolucionado el diagnóstico en el laboratorio de
microbiología, al combinar la química de la PCR con sondas fluorescentes para
detectar el producto amplificado en la misma reacción, permitiendo, además,
medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizada en cada momento,
mostrando y registrando, la cinética de la reacción de amplificación.
Esta técnica ha resultado un test altamente sensible, específico, rápido y de
mejor relación costo beneficio para determinar la carga viral. Permite predecir
enfermedad y monitorear la respuesta a la terapia antiviral, pudiendo, además ser
utilizada como marcador subrogante de resistencia antiviral y reactivación clínica.
En general, es una técnica rápida de aproximadamente una hora,
operativamente más sencilla y con igual o mayor sensibilidad y especificidad que
una PCR convencional. Se agrega a ello, la virtud de que al no manipularse el
producto amplificado para su detección, presenta menor riesgo de contaminación
cruzada.
Otorga resultados cuantitativos de ácidos nucleicos virales presentes en
una muestra clínica, permitiendo establecer una relación entre la carga viral de
dicho espécimen y la predicción de infección de enfermedad clínica.
Este conocimiento respecto de las cargas virales de determinados virus es
relevante en el paciente trasplantado, especialmente en el monitoreo de la
evolución de infección y el manejo de la efectividad de la terapia antiviral.
Técnicamente se puede cuantificar la concentración inicial de ADN (o ARN)
diana en la muestra de manera muy sencilla, añadiendo simplemente unos
controles externos con concentraciones conocidas y crecientes de ADN diana
(curva patrón) en la tanda de amplificación.
En la PCR a tiempo real el programa informático va registrando el
incremento de fluorescencia (proporcional al aumento de ADN) en cada ciclo, y
esta información se refleja gráficamente en curvas de cinética de la reacción para
cada una de las muestras y controles.
Por lo tanto, se puede controlar la amplificación en las fases iniciales,
cuando la concentración de los reactivos todavía no es limitante y el efecto de la
variabilidad en la eficiencia de amplificación es menos importante. Para cada

16. 16
muestra el programa informático calcula el número de ciclo en el que el lector
empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo, con respecto a la
señal de base.
El ciclo en el que se empieza a detectar el aumento de fluorescencia se
denomina punto de corte (Cp, de crossing point) o ciclo umbral (Ct, de threshold
cycle) y es inversamente proporcional a la concentración inicial de ADN diana
presente en la muestra. Con las concentraciones previamente conocidas de los
controles externos y sus Cp correspondientes se dibuja una curva patrón.
Interpolando en ella los valores de los Cp de cada muestra problema se puede
inferir su concentración de ADN inicial.
La utilización de estándares comerciales es ideal para lograr la uniformidad
de los resultados, pero no están disponibles para todas las determinaciones, y en
nuestro país, no siempre son accesibles y generalmente tienen un alto costo.
Una alternativa para solucionar estos inconvenientes, es insertar en un
plásmido un segmento de ADN, proveniente de un cultivo viral, posteriormente
amplificado en una PCR y subclonado en un vector. Este plásmido puede ser
cuantificado espectofotométricamente y ser utilizado realizando diluciones
seriadas por triplicado para generar la curva estándar externa (Cp versus log
número de copias).
Esta curva estándar es utilizada para cuantificar las muestras clínicas. La
PCR en tiempo real tiene así, un amplio rango dinámico, mayor sensibilidad,
exactitud y reproducibilidad que cualquier otro ensayo. La combinación de su
excelente sensibilidad y especificidad, el bajo riesgo de contaminación, su fácil y
rápida operatividad han convertido esta técnica en una alternativa muy interesante
en el diagnóstico clínico frente a la convencional técnica de laboratorio.
Es indudable que por sus cualidades se extenderá ampliamente a
diferentes aplicaciones microbiológicas.
Diagramas esquemáticos que muestran la curva patrón para cuantificación:

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En conclusión, los pacientes con enfermedad o riesgo de desarrollar
enfermedad por CMV o EBV muestran altos títulos de carga viral, más que los que
tienen una infección latente. Si bien ha de reconocerse que cada paciente puede
tener un valor de corte individual, en el cual la carga viral conduce a infección
sintomática, es necesario contar con una guía práctica para el comienzo de la
terapia antiviral apropiada, y, en tal sentido, la utilidad de la cuantificación de estos
virus, podría resultar aplicable con resultados exactos y reproducibles a cada
población de pacientes.
La detección cuantitativa por PCR en Tiempo Real está siendo utilizada
cada vez con mayor frecuencia para el monitoreo de riesgo de enfermedad en
pacientes inmunocomprometidos. Las ventajas de esta determinación sobre otros
métodos virológicos moleculares y no moleculares, han sido ampliamente
descriptas, incluyendo su amplio rango dinámico, bajo límite de detección, alta
precisión y exactitud, bajos tiempos de realización, por lo que resulta
indudablemente una técnica con mejor relación costo beneficio. El futuro debe
direccionarse a implementar instrumentos automatizados para realizar tests
reproducibles y estandarizados que pueden ser comparados entre los laboratorios.
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