Método III (ELISA)

1. Métodos de Investigación III
(Investigación Biomédica)
• 2.4. Técnicas de laboratorio básicas en el
área biomédica
• 2.4.5. Técnicas inmunológicas
• Biól. Miriam Romero Grijalva

2. PRUEBA DE ELISA

3. Objetivo de Enseñanza
• El profesor explicará la importancia de la
Prueba de ELISA en la Investigación
Biomédica.

4. Objetivo de Aprendizaje
• El alumno comprenderá la importancia de
la aplicación de la prueba de ELISA en la
Investigación Biomédica.

5. Respuesta inmune innata
Epidermis
Lutzomia
Leishmania
Complemento
Lisis
Viaja a los Ganglios linfáticos
Fagocitosis
IL-12
TNF-a IL-6
APC NK
NK
NK
Macrófago
Eosinofilo
Basofilo
Neutrofilo
Antígeno

6. Respuesta inmune celular
Citocinas
IL-12
IFN-g
TNF-a
Leishmania
iNOS
Macr
o
Macr
o
Parásitos
Extracelulares
(Taenia )
IL-4
Th2
IL-4
IL-10
IL-5
B
B
IgG, IgE
Parásitos
intracelulares
IFN-g
Th1
IL-12
APC
Promastigote de
Leishmania
Fago lisosoma
Antígeno
CD4

7. ¿Qué son los anticuerpos?
• Son unas proteínas que
forman parte del sistema
inmune y circulan por la
sangre. Cuando
reconocen sustancias
extrañas para el
organismo, como los virus
y las bacterias o sus
toxinas, las neutralizan.

8. Técnica ELISA
La técnica de Elisa es un procedimiento de
ensayo inmunoenzimático cuyo nombre
resulta de la asociación de las iniciales de su
denominación inglesa (enzyme linked
inmuno sorbent assay).
La prueba recurre al empleo de anticuerpos
marcados con una enzima, para revelar el
reactivo complementario a nivel de distintos
fluidos biológicos.

9. MUESTRA

10. ¿QUE SE NECESITA PARA HACER LA PRUEBA?
KIT para
ELISA
PIPETA
MULTICANAL
PIPETEADOR
AUTOMATICO
PIPETAS
ESTERILES
RAKS DE PUNTAS
ESTERILES
Solución de sales
(PBS): Cloruro de
sodio, Cloruro de
potasio, fosfato de
sodio y fosfato de
potasio
Placas de
96 pozos

11. Tipos de ELISA
• Método indirecto: Es
el método más utilizado para
la determinación de
anticuerpos específicos. Se
pueden utilizar como
antígenos, proteínas virales o
bacterianas e incluso virus
completos.
Cada día es más frecuente
utilizar exclusivamente las
proteínas de interés
inmunológico y no todas las
proteínas antigénicas.

12. ELISA por Competición
• Método competitivo: Se basa en la competencia que se establece
entre un antígeno marcado enzimáticamente y el mismo antígeno
sin marcar (muestra objetivo) al ser colocados frente a una
cantidad limitada del anticuerpo homólogo fijado a la fase
sólida. En estos casos la cantidad de antígeno es indirectamente
proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.
•

13. Elisa Directo
• Directo o también llamada
ELISA "Sándwich". En esta
forma, la placa suele ya venir con
un anticuerpo fijado (monoclonal
ó policlonal) frente al antígeno
problema, sobre el que se
añadirá el macerado del órgano
sospechoso o suero, que en caso
de reaccionar con el anticuerpo
de la placa, será puesto en
evidencia tras la adición del
segundo anticuerpo marcado con
la enzima (biotina-avidina). Por
último, se añade el substrato
(ABTS) para revelar la reacción.

14. ELISA sándwich

15. Pasos de la técnica ELISA
• 1.-SENSIBILIZAR LA PLACA colocar el
anticuerpo de captura de la citocina a
detectar (TNF-a, IL-6,IFN-g etc) en placas
maxisorp de 96 pozos. Incubar a 4ºC por 12
hrs.
POZO
Y
YY
Y
YY
YY
YY
Y Y
Y
Anti-anticuerpo de captura de TNF-a se
pega al fondo del pozo ya que este tiene
afinidad por proteínas.

16. • 2.-Lavar la placa 3 o 4 veces con buffer de
lavado (TEEW-20 al 0.05% en PBS).
Sumergiendo la placa y decantando la
solución y secar por aspiración con
sanitas.
TEEW-20
Lavador automático

17. • 3.-BLOQUEAR LA
PLACA. Ya seca la placa se
bloquea con PBS + albúmina
bovina al 0.1%, con el objetivo
de evitar que otras proteínas
se peguen a la placa y metan
ruido en los datos.
• Dejar 1 a 2 hrs incubando a
temperatura ambiente
PBS + albúmina
bovina al 0.1%
Poner 100 ml por pozo = 10 ml/placa
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

18. • 4.-Curva patrón. Poner 100 ml de PBS en los pozos de la A Y B asta el #
12. colocar el estándar de la citocina a una concentración aproximada
de 12500 pg/ml en pozo A y B (homogeneizar bien ). Hacer pases de
100 ml en cada pozo hasta el pozo 11 (soluciones al doble), esto es con
el objetivo de hacer una curva patrón con los valores del estándar y a
si interpolar los datos de las muestras.
• 5.-Colocar de 25 a 50 ml del suero del paciente u organismo infectado
con alguna patología. Dejar incubar 12 hras a 4ºC.
CURVA: 100ml de
PBS + estándar
en los 2 primeros
pozos
Tirar la
muestra
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Sueros

19. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Curva
B Curva
C Experimental control
D Experimental control
E Experimental control
F Experimental control
G Experimental control
H
Mapa para saber donde coloque las
muestras y poder determinar los datos

20. • 5.-Lavar la placa de 4 a 5 veces en buffer de lavado y
secar.
• 6.- Colocar 100ml por pozo del anticuerpo de Biotina
+PBS. Incubar 1 a 2hrs a temperatura ambiente.
Y
Y
Anticuerpo
biotinilado
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Poner 100 ml por pozo = 10 ml/placa

21. • 7.-Ya secas las placas se le pone 100ml por pozo de
una solución de 6 ml de avidina en 10ml de PBS/esto
es por placa. Dejar incubando 1hr.
Y
Y Avidina
Poner 100 ml por pozo = 10 ml/placa
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

22. • 8.- Lavar la placa 6 veces y secar.
• 9.-REVELADO DE LA PLACA. La placa se revela con un
sustrato llamado ABTS, este sustrato oxida al conjugado de
biotina y avidina y da un color verde. Este color nos da una
Densidad óptica la cual se lee en un Lector de ELISA a 405nm
y cada dato del suero lo podemos interpolar en una curva
patrón que son los valores que nos da el estándar de la
citocina.
Y
Y
ABTS
Poner 100 ml por pozo = 10 ml/placa
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

23. LECTOR DE PLACAS DE ELISA
Lectura de la placa

24. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1.344 0.823 0.546 0.404 0.38 0.281 0.274 0.227 0.194 0.168 0.158 0.138
B 1.268 0.936 0.569 0.411 0.357 0.258 0.239 0.252 0.178 0.185 0.145 0.125
C 0.289 0.263 0.259 0.288 0.21 0.248 0.305 0.239 0.275 0.267 0.252 0.213
D 0.281 0.26 0.291 0.259 0.253 0.257 0.278 0.224 0.279 0.379 0.285 0.262
E 0.228 0.284 0.266 0.262 0.322 0.276 0.26 0.223 0.308 0.353 0.199 0.174
F 0.263 0.31 0.272 0.182 0.22 0.203 0.208 0.205 0.188 0.207 0.166 0.155
G 0.255 0.289 0.161 0.197 0.193 0.16 0.185 0.158 0.154 0.144 0.135 0.131
H 0.192 0.179 0.14 0.176 0.141 0.141 0.128 0.128 0.146 0.13 0.113 0.12
Resultados
Lecturas en densidad óptica de la curva
y de los sueros problema.
CURVA PATRON: se hace un promedio de las densidades
ópticas de la curva (pozos A y B por duplicado).

25. curva patron
D:optica 1.344 0.823 0.546 0.404 0.38 0.281 0.274 0.227 0.194 0.168
D:optica 1.268 0.936 0.569 0.411 0.357 0.258 0.239 0.252 0.178 0.185
promedio 1.306 0.8795 0.5575 0.4075 0.3685 0.2695 0.2565 0.2395 0.186 0.1765
Concentración 12500 6250 3125 1562.5 781.25 390 195 97 48 24
D:O de la curva 1.306 0.8795 0.5575 0.4075 0.3685 0.2695 0.2565 0.2395 0.186 0.1765
CURVA PATRON DE TNF-a
y = 0.0001x + 0.2
R2
= 0.971
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 2000 4000 6000 8000
concemtración en
Las concentraciones de los sueros problema en
pg/ml se calculan con la ecuación: y=mx + b
Esta ecuación se despeja de la siguiente manera:
x= (Y-b)/m.
Donde y=densidad óptica del suero problema
m= pendiente
b= intersección

26. Ex
C
TNF-alfa

27. Aplicaciones de la prueba de
ELISA
La prueba de ELISA tiene muchas aplicaciones en la investigación
biomédica, ya que con esta prueba se pueden determinar
anticuerpos específicos e Inter leucinas que están involucradas con
diferentes enfermedades como son :
 Diabetes, Tuberculosis, Cáncer, SIDA, diversas parasitosis como:
cisticercosis, salmonelosis, Leishamniosis, toxoplasmosis,
tripanosomiosis, artritis reumatoide, et.

28. MIF+/+
MHC
IFN-g
Célula infectada
iNOS
parásitos
EPIDERMIS
GANGLIOS LINFATICOS
Linfocito
CD 4
TH1
TH2
IFN-g
TNF-a
IL-12
IL-4
*
Linfocito mRNA TNF-a
IFN-g
IL-12p35
IL-12p40
iNOS
Macrófagos
LPG de
Leishmania
TLR
amastigotes
Antigeno
mRNA TNF-a
IFN-g
IL-12p35
IL-12p40
iNOS
MIF
IL-12
NK NK
TNF-a
MIF+/+
Infectados con Leishmania mexicana
Infectado con Trypanosoma cruzi
Ratones diabéticos
MHC
Ratones
controles
Ratones
Experimentales
Fago lisosoma

29. Gracias