INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS ELISA

1. INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Departamento de Inmunología

2. • - USO DE ENZIMAS COMO MARCADOR
• - PRESENTAN EXTRAORDINARIAS VENTAJAS:
• • ELEVADA SENSIBILIDAD, DETECTABILIDAD Y
ESPECIFICIDAD.
• • PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS RÁPIDOS Y
SENCILLOS.
• • REACTIVOS RELATIVAMENTE
ECONÓMICOS Y DE LARGA VIDA.
• • GRAN VARIEDAD DE SUBSTRATOS Y
CROMÓGENOS QUE INCREMENTA SU
VERSATILIDAD

3. CLASIFICACIÓN
Fase homogénea
Fase heterogénea
❖ No requiere de fase sólida.
❖ La dosificación Ag-Ac-E se
efectúa directamente en la
mezcla de reacción.
❖ Requiere de fase sólida para inmovilizar el Ag
o Ac previo a su interacción con la muestra
biológica.
❖ Permite evaluar así complejo Ag-Ac-E.
❖ Requiere lavados en cada paso.

4. ELISA
Enzyme-linked inmunosorbent assay.
Descrito por investigadores suecos
Eva Engvall y Peter Perlmann (1971).
Técnica para detección de Ag y Ac.
Emplea Ac o Ag conjugados con una
enzima.
Mide Ag o Ac de manera cualitativa,
semicuantitativa y cuantitativa.

5. ELEMENTOS DE ELISA
Fase sólida
❖Poliestireno
❖Cloruro de polivinilo
❖Polipropileno
❖Nitrocelulosa
❖Látex, Nylon, Celulosa

6. Muestra Soluciones
Bloqueo
Lavados
❖ Ajenas al sistema Ag-Ac.
❖ Satura sitios no ocupados
por el reactante
inmunológico.
Albúmina, Gelatina, Caseína
❖ Elimina lo que no
reacciona.
❖ No altera reacción Ag-Ac.
PBS-Tween 20 al 0.1%

7. SustratosEnzimas
Revelador de
actividad enzimática
(cromógeno)
Peroxidasa de rábano
H2O2
Peróxido de urea
OPD (amarillo)
o-dianisidina (café)
Fosfatasa alcalina
(intestino de ternera; E. coli)
p-nitrofenil fosfato (amarillo)
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato (azul)
-
B-galactosidasa
(E. coli)
p-nitrofenil-B-galactósido
(amarillo)
-
*Glucosa oxidasa, ureasa, glutamato descarboxilasa

8. PROCEDIMIE
NTO DE ELISA
1) Sensibilización
2) Bloqueo
3) Adición del suero
problema
4) Adición del conjugado
5) Adición del sustrato-
cromógeno
6) Desarrollo de color
(soluble y estable)

9. MODALIDADES DE ELISA
DIRECTO
Comúnmente
utilizado para
detectar Ag
conocidos

10. INDIRECTO
Se busca y cuantifica Ac
contra Ag conocidos

11. SANDWICH
Búsqueda y
cuantificación de Ag

12. INHIBICIÓN
Determinar
concentración de Ag de
una muestra problema
mediante curva tipo
Muestra biológica
(Ag) + Ac específicos
Inhibición de Ac con
los Ag de la
muestra
Eliminación de
complejos Ag-Ac
Adición del
conjugado
Adición del sustrato Abs se ubica en
curva tipo

13. COMPETITIVA
Para medir
cantidades de Ag
Muestra biológica
(Ag) + Ag-E[Ac] limitada
Competencia
por el Ac

14. APLICACIONES DE ELISA
• ELISA INDIRECTO
• - MÉTODO PRESUNTIVO PARA VIH
• AC SÉRICOS CONTRA VIH
• - TOXOPLASMA GONDII
• FASE SÓLIDA RECUBIERTA CON ANTÍGENOS ESPECÍFICOS DE TOXOPLASMA GONDII.
• ANTICUERPOS EXISTENTES EN MUESTRA SE UNEN A LOS AG INMOVILIZADOS DE LA PLACA.
• CONJUGADO DE ANTICUERPOS IGG ANTI HUMANO CON PEROXIDASA DE RÁBANO.

15. VENTAJAS
❖NO UTILIZA SUSTANCIAS RADIACTIVAS
❖REPRODUCIBLE
❖ALTAMENTE SENSIBLE
❖ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS
❖ECONÓMICA
❖SIMPLE

16. METODOLOGÍA
100 uL Ag
(extracto
soluble de
larva muscular)
[ ]=1 uL/ug
4 pozos
poliestireno
100 uL CG
4 pozos
poliestireno
Incubar a 4°C,
24 hrs

17. Eliminar
soluciones por
inversión *
Sacudir sobre
tira de papel
absorbente *
Lavar con 100 uL
de PBS-T
Dejar en
reposo 3 min
Eliminar
solución *
Repetir
lavados x2
Agregar
100 uL
PBS-TL a
todos los
pozos
Incubar a 37°C
30 min
Repetir pasos *

18. 100 uL suero
negativo *
100 uL suero
positivo *
100 uL suero
problema *
100 uL PBS-T
Incubar a 37°C
30 min
* Diluidos 1:320
en PBS-TL
Eliminar
soluciones y
realizar lavados
Testigo +
Testigo -
Testigo de
conjugado

19. Adicionar 100 uL de
conjugado (IgG de
cabra anti Ig humanas
totales acoplada a
peroxidasa).
Diluido 1:8000
en PBS-TL
Incubar a
37°C 30
min
Eliminar
exceso y
realizar
lavados
Adicionar 100
uL sol. recién
preparada
del sustrato de
la enzima
Incubar en
oscuridad
(cromógeno es
fotosensible)
Adicionar 1
gota H2SO4
8N para
detener
reacción

20. RESULTADO
S
Testigo +
Testigo -
Testigo de
conjugado
Problema

21. 1 2 3 4 5 6 7 8
A 0.764 0.736 0.586 0.577 0.583 0.370 0.503 0.522
B 0.059 0.060 0.081 0.077 0.052 0.052 0.054 0.055
C 0.052 0.048 0.075 0.046 0.058 0.052 0.047 0.052
D 0.039 0.048 0.080 0.059 0.065 0.046 0.051 0.047
E 0.074 0.065 0.089 0.075 0.063 0.059 0.074 0.069
F 0.071 0.051 0.086 0.051 0.076 0.046 0.051 0.050
G 0.619 0.624 0.614 0.509 0.673 0.326 0.417 0.406
H 0.054 0.055 0.063 0.047 0.052 0.047 0.063 0.050
Tabla 1. Lecturas de absorbancia realizadas en lector de ELISA a λ de 492 nm.

22. CONCLUSIO
NES
- Técnica sencilla que permite
obtener resultados en un periodo
corto de tiempo.
- ELISA indirecto detecta Ac en una
muestra biológica contra un Ag
conocido.
- Resultados semicuantitativos,
fáciles de apreciar y analizar.

23. BIBLIOGRAFÍA
❖ABBAS A., (2018). INMUNOLOGÍA. 9ª EDICIÓN. ED.
ELSEVIER. ESPAÑA. PP. 531-533.
❖HARRIS D., (2007). ANÁLISIS QUÍMICO CUANTITATIVO.
3ª EDICIÓN. ED. REVERTÉ. ESPAÑA. PP. 444-446.
❖OWEN J., PUNT J., STANFORD S., (2014). KUBY.
INMUNOLOGÍA. 7ª EDICIÓN. ED. MC GRAW-HILL.
CHINA. PP. 660-663.