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INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Departamento de Inmunología
• - USO DE ENZIMAS COMO MARCADOR
• - PRESENTAN EXTRAORDINARIAS VENTAJAS:
• • ELEVADA SENSIBILIDAD, DETECTABILIDAD Y
ESPECIFICIDAD.
• • PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS RÁPIDOS Y
SENCILLOS.
• • REACTIVOS RELATIVAMENTE
ECONÓMICOS Y DE LARGA VIDA.
• • GRAN VARIEDAD DE SUBSTRATOS Y
CROMÓGENOS QUE INCREMENTA SU
VERSATILIDAD
CLASIFICACIÓN
Fase homogénea
Fase heterogénea
❖ No requiere de fase sólida.
❖ La dosificación Ag-Ac-E se
efectúa directamente en la
mezcla de reacción.
❖ Requiere de fase sólida para inmovilizar el Ag
o Ac previo a su interacción con la muestra
biológica.
❖ Permite evaluar así complejo Ag-Ac-E.
❖ Requiere lavados en cada paso.
ELISA
Enzyme-linked inmunosorbent assay.
Descrito por investigadores suecos
Eva Engvall y Peter Perlmann (1971).
Técnica para detección de Ag y Ac.
Emplea Ac o Ag conjugados con una
enzima.
Mide Ag o Ac de manera cualitativa,
semicuantitativa y cuantitativa.
ELEMENTOS DE ELISA
Fase sólida
❖Poliestireno
❖Cloruro de polivinilo
❖Polipropileno
❖Nitrocelulosa
❖Látex, Nylon, Celulosa
Muestra Soluciones
Bloqueo
Lavados
❖ Ajenas al sistema Ag-Ac.
❖ Satura sitios no ocupados
por el reactante
inmunológico.
Albúmina, Gelatina, Caseína
❖ Elimina lo que no
reacciona.
❖ No altera reacción Ag-Ac.
PBS-Tween 20 al 0.1%
SustratosEnzimas
Revelador de
actividad enzimática
(cromógeno)
Peroxidasa de rábano
H2O2
Peróxido de urea
OPD (amarillo)
o-dianisidina (café)
Fosfatasa alcalina
(intestino de ternera; E. coli)
p-nitrofenil fosfato (amarillo)
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato (azul)
-
B-galactosidasa
(E. coli)
p-nitrofenil-B-galactósido
(amarillo)
-
*Glucosa oxidasa, ureasa, glutamato descarboxilasa
PROCEDIMIE
NTO DE ELISA
1) Sensibilización
2) Bloqueo
3) Adición del suero
problema
4) Adición del conjugado
5) Adición del sustrato-
cromógeno
6) Desarrollo de color
(soluble y estable)
MODALIDADES DE ELISA
DIRECTO
Comúnmente
utilizado para
detectar Ag
conocidos
INDIRECTO
Se busca y cuantifica Ac
contra Ag conocidos
SANDWICH
Búsqueda y
cuantificación de Ag
INHIBICIÓN
Determinar
concentración de Ag de
una muestra problema
mediante curva tipo
Muestra biológica
(Ag) + Ac específicos
Inhibición de Ac con
los Ag de la
muestra
Eliminación de
complejos Ag-Ac
Adición del
conjugado
Adición del sustrato Abs se ubica en
curva tipo
COMPETITIVA
Para medir
cantidades de Ag
Muestra biológica
(Ag) + Ag-E[Ac] limitada
Competencia
por el Ac
APLICACIONES DE ELISA
• ELISA INDIRECTO
• - MÉTODO PRESUNTIVO PARA VIH
• AC SÉRICOS CONTRA VIH
• - TOXOPLASMA GONDII
• FASE SÓLIDA RECUBIERTA CON ANTÍGENOS ESPECÍFICOS DE TOXOPLASMA GONDII.
• ANTICUERPOS EXISTENTES EN MUESTRA SE UNEN A LOS AG INMOVILIZADOS DE LA PLACA.
• CONJUGADO DE ANTICUERPOS IGG ANTI HUMANO CON PEROXIDASA DE RÁBANO.
VENTAJAS
❖NO UTILIZA SUSTANCIAS RADIACTIVAS
❖REPRODUCIBLE
❖ALTAMENTE SENSIBLE
❖ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS
❖ECONÓMICA
❖SIMPLE
METODOLOGÍA
100 uL Ag
(extracto
soluble de
larva muscular)
[ ]=1 uL/ug
4 pozos
poliestireno
100 uL CG
4 pozos
poliestireno
Incubar a 4°C,
24 hrs
Eliminar
soluciones por
inversión *
Sacudir sobre
tira de papel
absorbente *
Lavar con 100 uL
de PBS-T
Dejar en
reposo 3 min
Eliminar
solución *
Repetir
lavados x2
Agregar
100 uL
PBS-TL a
todos los
pozos
Incubar a 37°C
30 min
Repetir pasos *
100 uL suero
negativo *
100 uL suero
positivo *
100 uL suero
problema *
100 uL PBS-T
Incubar a 37°C
30 min
* Diluidos 1:320
en PBS-TL
Eliminar
soluciones y
realizar lavados
Testigo +
Testigo -
Testigo de
conjugado
Adicionar 100 uL de
conjugado (IgG de
cabra anti Ig humanas
totales acoplada a
peroxidasa).
Diluido 1:8000
en PBS-TL
Incubar a
37°C 30
min
Eliminar
exceso y
realizar
lavados
Adicionar 100
uL sol. recién
preparada
del sustrato de
la enzima
Incubar en
oscuridad
(cromógeno es
fotosensible)
Adicionar 1
gota H2SO4
8N para
detener
reacción
RESULTADO
S
Testigo +
Testigo -
Testigo de
conjugado
Problema
1 2 3 4 5 6 7 8
A 0.764 0.736 0.586 0.577 0.583 0.370 0.503 0.522
B 0.059 0.060 0.081 0.077 0.052 0.052 0.054 0.055
C 0.052 0.048 0.075 0.046 0.058 0.052 0.047 0.052
D 0.039 0.048 0.080 0.059 0.065 0.046 0.051 0.047
E 0.074 0.065 0.089 0.075 0.063 0.059 0.074 0.069
F 0.071 0.051 0.086 0.051 0.076 0.046 0.051 0.050
G 0.619 0.624 0.614 0.509 0.673 0.326 0.417 0.406
H 0.054 0.055 0.063 0.047 0.052 0.047 0.063 0.050
Tabla 1. Lecturas de absorbancia realizadas en lector de ELISA a λ de 492 nm.
CONCLUSIO
NES
- Técnica sencilla que permite
obtener resultados en un periodo
corto de tiempo.
- ELISA indirecto detecta Ac en una
muestra biológica contra un Ag
conocido.
- Resultados semicuantitativos,
fáciles de apreciar y analizar.
BIBLIOGRAFÍA
❖ABBAS A., (2018). INMUNOLOGÍA. 9ª EDICIÓN. ED.
ELSEVIER. ESPAÑA. PP. 531-533.
❖HARRIS D., (2007). ANÁLISIS QUÍMICO CUANTITATIVO.
3ª EDICIÓN. ED. REVERTÉ. ESPAÑA. PP. 444-446.
❖OWEN J., PUNT J., STANFORD S., (2014). KUBY.
INMUNOLOGÍA. 7ª EDICIÓN. ED. MC GRAW-HILL.
CHINA. PP. 660-663.

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INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS ELISA

  • 1. INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Departamento de Inmunología
  • 2. • - USO DE ENZIMAS COMO MARCADOR • - PRESENTAN EXTRAORDINARIAS VENTAJAS: • • ELEVADA SENSIBILIDAD, DETECTABILIDAD Y ESPECIFICIDAD. • • PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS RÁPIDOS Y SENCILLOS. • • REACTIVOS RELATIVAMENTE ECONÓMICOS Y DE LARGA VIDA. • • GRAN VARIEDAD DE SUBSTRATOS Y CROMÓGENOS QUE INCREMENTA SU VERSATILIDAD
  • 3. CLASIFICACIÓN Fase homogénea Fase heterogénea ❖ No requiere de fase sólida. ❖ La dosificación Ag-Ac-E se efectúa directamente en la mezcla de reacción. ❖ Requiere de fase sólida para inmovilizar el Ag o Ac previo a su interacción con la muestra biológica. ❖ Permite evaluar así complejo Ag-Ac-E. ❖ Requiere lavados en cada paso.
  • 4. ELISA Enzyme-linked inmunosorbent assay. Descrito por investigadores suecos Eva Engvall y Peter Perlmann (1971). Técnica para detección de Ag y Ac. Emplea Ac o Ag conjugados con una enzima. Mide Ag o Ac de manera cualitativa, semicuantitativa y cuantitativa.
  • 5. ELEMENTOS DE ELISA Fase sólida ❖Poliestireno ❖Cloruro de polivinilo ❖Polipropileno ❖Nitrocelulosa ❖Látex, Nylon, Celulosa
  • 6. Muestra Soluciones Bloqueo Lavados ❖ Ajenas al sistema Ag-Ac. ❖ Satura sitios no ocupados por el reactante inmunológico. Albúmina, Gelatina, Caseína ❖ Elimina lo que no reacciona. ❖ No altera reacción Ag-Ac. PBS-Tween 20 al 0.1%
  • 7. SustratosEnzimas Revelador de actividad enzimática (cromógeno) Peroxidasa de rábano H2O2 Peróxido de urea OPD (amarillo) o-dianisidina (café) Fosfatasa alcalina (intestino de ternera; E. coli) p-nitrofenil fosfato (amarillo) 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (azul) - B-galactosidasa (E. coli) p-nitrofenil-B-galactósido (amarillo) - *Glucosa oxidasa, ureasa, glutamato descarboxilasa
  • 8. PROCEDIMIE NTO DE ELISA 1) Sensibilización 2) Bloqueo 3) Adición del suero problema 4) Adición del conjugado 5) Adición del sustrato- cromógeno 6) Desarrollo de color (soluble y estable)
  • 10. INDIRECTO Se busca y cuantifica Ac contra Ag conocidos
  • 12. INHIBICIÓN Determinar concentración de Ag de una muestra problema mediante curva tipo Muestra biológica (Ag) + Ac específicos Inhibición de Ac con los Ag de la muestra Eliminación de complejos Ag-Ac Adición del conjugado Adición del sustrato Abs se ubica en curva tipo
  • 13. COMPETITIVA Para medir cantidades de Ag Muestra biológica (Ag) + Ag-E[Ac] limitada Competencia por el Ac
  • 14. APLICACIONES DE ELISA • ELISA INDIRECTO • - MÉTODO PRESUNTIVO PARA VIH • AC SÉRICOS CONTRA VIH • - TOXOPLASMA GONDII • FASE SÓLIDA RECUBIERTA CON ANTÍGENOS ESPECÍFICOS DE TOXOPLASMA GONDII. • ANTICUERPOS EXISTENTES EN MUESTRA SE UNEN A LOS AG INMOVILIZADOS DE LA PLACA. • CONJUGADO DE ANTICUERPOS IGG ANTI HUMANO CON PEROXIDASA DE RÁBANO.
  • 15. VENTAJAS ❖NO UTILIZA SUSTANCIAS RADIACTIVAS ❖REPRODUCIBLE ❖ALTAMENTE SENSIBLE ❖ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS ❖ECONÓMICA ❖SIMPLE
  • 16. METODOLOGÍA 100 uL Ag (extracto soluble de larva muscular) [ ]=1 uL/ug 4 pozos poliestireno 100 uL CG 4 pozos poliestireno Incubar a 4°C, 24 hrs
  • 17. Eliminar soluciones por inversión * Sacudir sobre tira de papel absorbente * Lavar con 100 uL de PBS-T Dejar en reposo 3 min Eliminar solución * Repetir lavados x2 Agregar 100 uL PBS-TL a todos los pozos Incubar a 37°C 30 min Repetir pasos *
  • 18. 100 uL suero negativo * 100 uL suero positivo * 100 uL suero problema * 100 uL PBS-T Incubar a 37°C 30 min * Diluidos 1:320 en PBS-TL Eliminar soluciones y realizar lavados Testigo + Testigo - Testigo de conjugado
  • 19. Adicionar 100 uL de conjugado (IgG de cabra anti Ig humanas totales acoplada a peroxidasa). Diluido 1:8000 en PBS-TL Incubar a 37°C 30 min Eliminar exceso y realizar lavados Adicionar 100 uL sol. recién preparada del sustrato de la enzima Incubar en oscuridad (cromógeno es fotosensible) Adicionar 1 gota H2SO4 8N para detener reacción
  • 21. 1 2 3 4 5 6 7 8 A 0.764 0.736 0.586 0.577 0.583 0.370 0.503 0.522 B 0.059 0.060 0.081 0.077 0.052 0.052 0.054 0.055 C 0.052 0.048 0.075 0.046 0.058 0.052 0.047 0.052 D 0.039 0.048 0.080 0.059 0.065 0.046 0.051 0.047 E 0.074 0.065 0.089 0.075 0.063 0.059 0.074 0.069 F 0.071 0.051 0.086 0.051 0.076 0.046 0.051 0.050 G 0.619 0.624 0.614 0.509 0.673 0.326 0.417 0.406 H 0.054 0.055 0.063 0.047 0.052 0.047 0.063 0.050 Tabla 1. Lecturas de absorbancia realizadas en lector de ELISA a λ de 492 nm.
  • 22. CONCLUSIO NES - Técnica sencilla que permite obtener resultados en un periodo corto de tiempo. - ELISA indirecto detecta Ac en una muestra biológica contra un Ag conocido. - Resultados semicuantitativos, fáciles de apreciar y analizar.
  • 23. BIBLIOGRAFÍA ❖ABBAS A., (2018). INMUNOLOGÍA. 9ª EDICIÓN. ED. ELSEVIER. ESPAÑA. PP. 531-533. ❖HARRIS D., (2007). ANÁLISIS QUÍMICO CUANTITATIVO. 3ª EDICIÓN. ED. REVERTÉ. ESPAÑA. PP. 444-446. ❖OWEN J., PUNT J., STANFORD S., (2014). KUBY. INMUNOLOGÍA. 7ª EDICIÓN. ED. MC GRAW-HILL. CHINA. PP. 660-663.