Como controlar cultivos masivos de microalgas

1. Seguimiento de Cultivos Masivos en Dunaliella tertiolecta
PatriciaJara, Solange Olivares
Laboratoriode Cultivos Masivos, Facultadde Ciencias Marinas yRecursos Biológicos, Universidad de Antofagasta
Resumen
Para el trabajoen laboratorioesesencial el control de estos,sobre todo cuando se trabaja con
microorganismos vivos. En Cultivos Masivos de microalgas, al tener una gran cantidad de
biomasase debenutilizarmétodosque simplifiquen el control estricto de estos, para esto se
pueden utilizar tres tipos de técnicas, las cuales son recuento celular a través de análisis
microscópico con ayuda de una Cámara de Neubauer, que permite tener un estimativo de
cuantas células haypresente pormLde muestra.Tambiénse utiliza la medición de Peso seco,
ya que es la única manera directa de medir la masa celular. Para poder obtener una
concentración se utiliza la medición de O.D. (Densidad Óptica) a través de un
espectrofotómetro. En esta oportunidad se utiliza como muestra a la microalga Dunaliella
tertiolecta, la cual es un microorganismo móvil, y para realizar análisis sobre esta se deben
tener ciertas precauciones para no falsos resultados.
Introducción
Muchos factores contribuyen para el
desarrollo óptimo de los cultivos de
microalgas, algunos de éstos afectan las
características del crecimiento, es por ello
que se debe realizar periódicamente un
seguimiento de los cultivos en estudio,
para esto se utilizan diferentes métodos.
Se debe tener en conocimiento el
crecimiento el cual se expresa como el
incremento de la biomasa, para esto se
puede utilizar tres métodos que son,
recuentodirecto celular en una Cámara de
Neubauer, cálculo del Peso Seco y la
determinación de Concentración a través
de la obtención de Densidad Óptica (D.O.)
con espectrofotometría.
La Cámara de Neubauer,sirve paraobtener
el estimado recuento celular a través de
microscopio, este es un método sencillo y
poco costoso, el cual permite un mejor
seguimiento del cultivo mediante su
inspección visual. Uno de los problemas
para el recuentoal microscopio es obtener
una buenareproductibilidad,por lo cual es
importante saberseleccionarel tamaño de
la muestra,ladilución,el tipode cámarade
recuento, el objetivo del microscopio y la
técnica de llenado de la cámara. 1
El cálculo de Peso Seco es muy utilizado,
por la rápida determinación de este a
través de una membrana de nitrocelulosa,
su complicación radica en la fácil captura
de humedaddel ambiente, es por ello que
se debe sermuy pulcro a la hora de utilizar
este método.
Para el cálculo de Densidad Óptica, se
puede realizar un barrido en los espectros
cercanos a los compuestos que se deseen
analizarpara obtenerunalongitudde onda
más específica.
En esta oportunidad de obtendrán estos
tres parámetros para mantener un control
en la microalga Dunaliella tertiolecta. Para
así obtener el conocimiento de cómo

2. procederfrente aun cultivomasivode este
microorganismo.
Materialesy Métodos
RecuentoCelular
Para el Recuento Celular, se utilizó la
cámara de Neubauer, la cual tiene un área
de 0,025 mm2
, y una profundidad de 0,1
mm. La cual permite una extrapolación en
células/mL.
Para la preparación de la muestra se
adiciona Lugol, para lograr la fijación de la
muestra ya que Dunaliella es móvil, con
solotresgotas, ademásde homogeizar por
inversión. Se toma una alícuota hasta
lograr la homogeneidad correspondiente
en la Cámara de Neubauer. Se observa a
través de microscopía, y se lleva el control
con un Contador Manual. Se toman cuatro
cuadrantes para realizar el promedio.
Peso Seco
Para la determinación de Peso Seco, se
utiliza una Membrana de Nitrocelulosa
(filtro), la cual posee un diámetro
apróximado de 4,7 cm, y tiene un tamaño
de poro de 0,45 micras. Estos Filtros están
previamentetratados,dejadosenunhorno
y luego en la desecadora para que no
absorbahumedaddel medio ambiente. Se
pesa el filtro antes de adicionar 10 ml de
muestra para obtener su peso. La muestra
debe ser previamente tratada, ya que se
cuenta con una microalga proveniente de
agua salada, para esto se adiciona
Formiato amónico hasta completar los 50
mL (previamente tomado 10 mL de
muestra), y este debe ser homogenizado.
Al adicionar la muestra a la Membrana se
expone a un XXXX, para extraer el exceso
de agua, luego se deja por 24 horas en un
horno a 105ºC, para luego dejar en la
desecadoraaproximadamente 30 minutos.
Al obtener esto se vuelve a pesar y se
utiliza la fórmula:
Peso Seco= P.F. inicial –P.F. con muestra
Litros de muestra
; Donde P.F. corresponde al peso del filtro
en gramos.
Determinación de O.D.
Para esta determinación se utilizó un
espectrofotómetro, Sprectroquant Pharo
300,donde primero se realiza un barrido
entre las longitudes de onda de 400 a 700
nm, ya que este es el espectro de los
pigmentos fotosintéticos, para lo cual se
analizan los picks donde el menor, sería el
indicado para obtener el resultado de la
espectrofotometría. Como blanco para el
análisis se utiliza agua destilada.
Resultados
Recuento Celular
Para el análisisse toma una alícuota la cual
es expuesta a tres gotas de lugol, y se
analizó bajo microscopio, del cual se
obtuvieron diferentes conteos de los
cuadrantes mostrados en la Tabla 1, del
cual se obtuvo un promedio de 43, el cual
da un resultado de 43 x 10 4
cél./mL.
Cuadrante Conteo
A 43
B 46
C 44
D 40
Tabla 1. Conteo Celular, se realizó con Cámara
Neubauer, segúnpatronesentregados de conteopor
cuadrante
Peso Seco
Al obtener los dato de peso en gramos del
filtrose debe obtenerun promedio para el
cual arrojó 0,42265 gramos, luego se
deposito la muestra y se llevo a XXXX y se
dejó en el horno por 24 horas y se obtuvo

3. una media de 0,42755. Para lo cual se
obtiene 0,49 g/L de solución.
Determinación de O.D.
Al realizarel barridoel pickmás bajofue de
482 nm, donde se realiza la lectura lo cual
entregalos datos de Absorvancia de 0,127,
y el máximo de 0,65. Para los cuales los
valores son aceptables ya que deben ir en
un rango de 0 a 1.
Discusión
Para poder mantener un control eficiente
se deben mantener estos tres métodos de
fácil manejo, además de poder
complementarlos con otros que puedan
ser más específicos para cada especie.
Estos procedimientos se deben realizar
periódicamente paraobservarla viabilidad
del cultivo.
Referencia
1. Abalde, J., P. Hidalgo y E. Torres,
1995. Microalgas: Cultivos y
Aplicaciones. Universidad de
Coruña, España. 210 p.