1. BAM: La enumeración de Escherichiacoli y las bacterias coliformes
09 2002
Manual Analítico Bacteriológico
Capítulo 4
La enumeración de Escherichiacoli y las bacterias coliformes
Autores:Peter Feng , Stephen D. Weagant (retirado), Michael A. Grant (diciembre), William Burkhardt
Historial de revisiones:
Febrero de 2013 - Método de análisis de los mariscos revisado para ser coherente con el examen
APHA del agua de mar y mariscos, 4 ª ed.
Febrero de 2013 - métodos de filtro de membrana añadido al análisis de agua.
Contenido del capítulo
Método convencional para determinar Coliformes y E.coli
Método LST-MUG para la detección de E.coli en refrigerada o congelada Alimentos
Exclusivo de Moluscos Bivalvos
Agua embotellada
El examen de los mariscos y carne de mariscos
Análisis para E.coli en jugos cítricos
Otros métodos para que enumera los coliformes y E.coli
Referencias
Escherichiacoli, originalmente conocidos como Bacteriumcoli comuna, fue identificado en 1885 por el
pediatra alemán, Theodor Escherich ( 14 , 29 ). E.coli se distribuye ampliamente en el intestino de los
seres humanos y animales de sangre caliente y es el anaerobio facultativo predominante en el intestino y
parte de la flora intestinal esenciales que mantiene la fisiología del huésped sano ( 9 , 29 ). E.coli es un
miembro de la familia Enterobacteriaceae ( 15 ), que incluye muchos géneros, incluyendo patógenos
conocidos, tales como Salmonella, Shigella y Yersinia. Aunque la mayoría de cepas de E.coli no se
consideran patógenos, pueden ser patógenos oportunistas que causan infecciones en huéspedes
inmunocomprometidos. También hay cepas patógenas de E.coli que cuando se ingiere, causa
enfermedades gastrointestinales en humanos sanos (ver. Cap 4A).
En 1892, Shardinger propuso el uso de E.coli como un indicador de la contaminación fecal. Esto se basó
en la premisa de que la E.coli es abundante en las heces humanas y animales, y que no suelen
encontrarse en otros nichos. Además, dado que E.coli pueden ser detectadas fácilmente por su capacidad
para fermentar la glucosa (más tarde cambiado a la lactosa), que era más fácil de aislar de patógenos
gastrointestinales conocidos. Por lo tanto, la presencia de E.coli en los alimentos o el agua llegó a ser
aceptada como indicativo de contaminación fecal reciente y la posible presencia de patógenos francas.

2. Aunque el concepto de la utilización de E.coli como un indicador indirecto de riesgo para la salud se
sonido, era complicado en la práctica, debido a la presencia de otras bacterias entéricas como
Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter que también puede fermentar la lactosa y son similares a E.coli
en características fenotípicas, de manera que no se distinguen fácilmente. Como resultado, el término
"coliformes" fue acuñado para describir este grupo de bacterias entéricas. Coliformes no es una
clasificación taxonómica sino más bien una definición de trabajo utilizado para describir un grupo de
bacterias Gram-negativas, anaeróbicas facultativas en forma de varilla que fermenta la lactosa para
producir ácido y gas dentro de 48 horas a 35 ° C. En 1914, el Servicio de Salud Pública de los EE.UU.
aprobó el recuento de coliformes como un estándar más conveniente de importancia sanitaria.
Aunque coliformes eran fáciles de detectar, su asociación con la contaminación fecal es cuestionable
debido a que algunos coliformes se encuentran naturalmente en muestras ambientales ( 6 ). Esto condujo
a la introducción de los coliformes fecales como indicador de la contaminación. Los coliformes fecales,
primero se define sobre la base de las obras de Eijkman ( 12 ) es un subconjunto de coliformes totales
que crece y fermenta la lactosa a temperatura de incubación elevada, por lo tanto, también se refirió a los
coliformestermotolerantes como. Análisis de coliformes fecales se realizan a 45,5 ° C durante el análisis
de alimentos, excepto para los análisis de agua, crustáceos y mariscos agua de la cosecha, que utilizan
44,5 ° C ( 1 , 3 , 30 ). El grupo de coliformes fecales se compone principalmente de E.coli, pero algunos
otros entéricos tales como Klebsiella también pueden fermentar la lactosa a estas temperaturas y por lo
tanto, ser considerados como los coliformes fecales. La inclusión de Klebsiellaspp en la definición de
trabajo de coliformes fecales disminuyó la correlación de este grupo con la contaminación fecal. Como
resultado, E.coli ha resurgido como un indicador, en parte facilitado por la introducción de nuevos
métodos que pueden identificar rápidamente E.coli.
Actualmente, todos los 3 grupos se utilizan como indicadores pero en diferentes aplicaciones. La
detección de coliformes se utiliza como un indicador de la calidad sanitaria de agua o como un indicador
general de condiciones sanitarias en el entorno de procesamiento de alimentos. Los coliformes fecales
siguen siendo el indicador estándar de elección para la cría de moluscos y mariscos aguas de
recolección; y E.coli se utiliza para indicar la contaminación fecal reciente o procesamiento
antihigiénico. Casi todos los métodos utilizados para detectar E.coli,coliformes totales o coliformes
fecales son métodos de enumeración que se basan en la fermentación de la lactosa ( 4 ). El método del
número más probable (MPN) es un ensayo de múltiples pasos estadístico que consiste en fases
presuntivos, confirmadas y completadas. En el ensayo, diluciones seriadas de una muestra se inoculan
en caldo de cultivo. Los analistas anotan el número de positivos gas (fermentación de la lactosa) tubos,
de los cuales se llevan a cabo las otras 2 fases del ensayo, y luego usa las combinaciones de resultados
positivos para consultar una tabla estadística ( Apéndice 2 ), para estimar el número de organismos
presente. Típicamente sólo los primeros 2 fases se llevan a cabo en coliformes y análisis de coliformes
fecales, mientras que todas las 3 fases se realizan para E.coli. La prueba NMP 3-tubo se utiliza para
probar la mayoría de los alimentos. Análisis de agua de mar mediante una serie de dilución múltiple no
debe utilizar menos de 3 tubos por dilución (se recomiendan 5 tubos); en ciertos casos una sola serie de
dilución usando no menos de 12 tubos también puede ser aceptable. (Para más detalles, véase:. FDA
Programa Nacional de Saneamiento Mariscos, Manual de Operaciones de 2009 Revisión DHHS / PHS /
FDA, Washington DC.).. Del mismo modo, el análisis de los moluscos bivalvos se debe realizar
mediante una serie NMP dilución múltiple que no menos de 5 - se deben utilizar tubos por dilución,
véase la sección IV. También hay un método NPF 10 de tubo que se utiliza para probar el agua

3. embotellada o las muestras que no se espera que sean altamente contaminada ( 3 ). Análisis de jugo de
cítricos para E.coli se realiza como un método de ausencia / presencia, véase la sección V.
Además, no es un sólido método de chapado medio para coliformes que utiliza Agar Violeta Rojo Bilis,
que contiene indicador de pH rojo neutro, de modo que los resultados de fermentación de la lactosa en la
formación de colonias de color rosa. También hay pruebas de filtración de membrana para coliformes y
coliformes fecales que miden la formación de aldehído debido a la fermentación de la lactosa. Este
capítulo también incluye variaciones de las pruebas anteriores que utilizan sustratos fluorogénicos para
detectar E.coli ( 18 ), pruebas especiales para el análisis de los mariscos, una breve consideración de las
pruebas de agua embotellada y un método para el ensayo de grandes volúmenes de jugos de cítricos para
la presencia de E.coli en conjunción con la norma HACCP Juice.
I. Método convencional de coliformes, coliformes fecales y E.coli
A. Equipo y materiales
1. Cubiertos baño de agua, con sistema de circulación para mantener la temperatura de 45,5
± 0,2 ° C.
Nota: La temperatura de los baños de agua para el programa de los mariscos es 44,5 °
C ± 0,2 ° C. El nivel del agua debe estar por encima del medio en tubos sumergidos.
2. De tipo inmersión termómetro, 1-55 ° C, a unos 55 cm de largo, con 0,1 ° C
subdivisiones, certificada por el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST), o
equivalente
3. Incubadora, 35 ± 1,0 ° C
Nota: La temperatura de la incubadora para el programa de los mariscos es de 35 ° C
± 0,5 ° C
4. Equilibrio con capacidad> 2 kg y sensibilidad de 0,1 g
5. Blender y vaso de la licuadora (véase el Capítulo 1)
6. Pipetas graduadas estériles, 1,0 y 10,0 ml
7. Utensilios estériles para la manipulación de muestras (véase el Capítulo 1)
8. Botellas de dilución de vidrio borosilicato, con tapones de rosca de polietileno equipado
con revestimientos de teflón. Botellas de dilución preparada comercialmente que
contienen tampón de fosfato estéril de Butterfield también se pueden utilizar.
9. Quebec contador de colonias, o equivalente, con lente de aumento
10. Luz de onda larga UV [~ 365 nm], que no exceda 6 W.
11. pH-metro
B. Medios y Reactivos
1. Brilliant bilis lactosa verde (BGLB) de caldo, 2% ( M25 )
2. Lauriltriptosa (LST) de caldo ( M76 )
3. Caldo lactosa ( M74 )
4. Caldo EC ( M49 )

4. 5. Azul de metileno-eosina de Levine (L-EMB) agar ( M80 )
6. Triptona (triptófano) caldo ( M164 )
7. Caldo MR-VP ( M104 )
8. Caldo citrato de Koser ( M72 )
9. Agar para recuento en placa (PCA) (métodos estándar) ( M124 )
10. Agua tamponada con fosfato de Butterfield ( R11 ) o diluyente equivalente
(Nota:.... Esta misma fórmula se conoce como Buffered agua de dilución en la
Asociación Americana de Salud Pública 1970 Procedimientos recomendados para el
Análisis de agua de mar y mariscos, 4 ª ed APHA, Washington, DC, p14-15)
11. Reactivo de Kovacs ( R38 )
12. Voges-Proskauer (VP) reactivos ( R89 )
13. Reactivos de tinción de Gram ( R32 )
14. Indicador rojo de metilo ( R44 )
15. Violet agar bilis-rojo (VRBA) ( M174 )
16. Agar VRBA-MUG ( M175 )
17. Medio EC-MUG ( M50 )
18. Lauriltriptosa MUG (LST-MUG) caldo ( M77 )
19. Peptona Diluyente, 0,5% ( R97 )
C. NMP - prueba presuntiva de coliformes, coliformes fecales y E.coli
Pesar 50 g de alimento en la jarra de la licuadora de alta velocidad estéril (véase el capítulo 1 y
los actuales programas de cumplimiento de la FDA para obtener instrucciones sobre el tamaño
de la muestra y de composición) Las muestras congeladas pueden suavizarse mediante el
almacenamiento de <18 horas a 2-5 º C, pero no descongelar. Añadir 450 ml de agua tamponada
con fosfato de Butterfield y mezclar durante 2 min. Si <50 g de muestra están disponibles, pesar
porción que es equivalente a la mitad de la muestra y añadir un volumen suficiente de diluyente
estéril para hacer una dilución 1:10. El volumen total en el vaso de la licuadora debe cubrir
completamente las cuchillas.
Preparar diluciones decimales con diluyente fosfato estéril de Butterfield o equivalente. Número
de diluciones para estar preparados depende de la densidad de coliformes anticipada. Agite todas
las suspensiones de 25 veces en 30 cm de arco o mezcla de vórtice durante 7 s. Uso de al menos
3 diluciones consecutivas, inocular 1 ml de alícuotas de cada dilución en 3 tubos LST para un
análisis NPF 3 tubo (otro análisis puede requerir el uso de 5 tubos para cada dilución; ver IV).
Caldo lactosa también se puede utilizar. Para una mayor precisión, utilice un 1 ml o 5 ml pipeta
para la inoculación. No utilice pipetas para entregar <10% de su volumen total; por ejemplo. una
pipeta de 10 ml para entregar 0,5 ml. Mantenga la pipeta en ángulo de modo que su borde
inferior se apoya contra el tubo. No más de 15 min debe transcurrir desde el tiempo de la muestra
se mezcla hasta que todas las diluciones se inocularon en los medios de comunicación
apropiados.
Incubar los tubos LST a 35 ° C ± 0,5 ° C. Examinar los tubos y reacciones récord a 24 ± 2 h de
gas, es decir, el desplazamiento de medio en el frasco de fermentación o efervescencia cuando
los tubos se agitan suavemente. Vuelva a incubar los tubos de gas-negativo durante 24

5. hyexaminar y registrar las reacciones de nuevo a los 48 ± 3 h. Realice la prueba confirmada en
todos los tubos presuntivos positivos (gas).
D. Confirmado prueba para coliformes - MPN
De cada tubo LST o caldo de lactosa gaseado, la transferencia de un asa de siembra de la
suspensión a un tubo de caldo de BGLB, evitando película si está presente. (Un palillo aplicador
de madera estéril puede también ser utilizado para estas transferencias). Incubar los tubos BGLB
a 35 ° C ± 0,5 ° C y examinar la producción de gas a 48 ± 3 h. Calcular el número más probable
(NMP) (véase el Apéndice 2 ) de coliformes basado en la proporción de confirmados
gaseamiento tubos LST para 3 diluciones consecutivos.
E. Confirmado prueba para coliformes fecales y E. - MPNcoli
De cada LST gasificación o tubo de caldo de lactosa a partir de la prueba de presunción,
transferir un asa de siembra de cada suspensión a un tubo de caldo de CE (un palillo aplicador de
madera estéril también puede ser utilizado para estas transferencias). Incubar los tubos de la CE
24 ± 2 horas a 45,5 ° C y examinar la producción de gas. Si es negativo, reincubate y examinar
de nuevo a las 48 ± 2 h. Usar los resultados de esta prueba para calcular NPF de coliformes
fecales. Para continuar con E. análisis coli, proceda a la Sección F de abajo. El método NPF
caldo de CE puede ser utilizado para el agua de mar y mariscos, ya que se ajusta a los
procedimientos recomendados ( 1 ). (Precaución: ver nota abajo).
NOTA: análisis de coliformes fecales se realizan a 45,5 ± 0,2 ° C para todos los alimentos,
excepto para las pruebas de agua y en los mariscos y crustáceos análisis de agua de la cosecha,
que utiliza una temperatura de incubación de 44,5 ± 0,2 ° C ( 1 ).
F. Contestó la prueba para E. - MPNcoli.
Para realizar la prueba completa para E.coli, agite suavemente cada tubo CE gaseamiento,
eliminar un asa de siembra de caldo y la racha de aislamiento en una placa de agar L-EMB e
incubar durante 18-24 horas a 35 ° C ± 0,5 ° C. Examinar las placas para sospechar E. colonias
de E. coli, es decir, oscuro centradas y plana, con o sin brillo metálico. Traslado hasta 5 colonias
sospechosas de cada placa L-EMB a sesgos de PCA, los incuban durante 18-24 horas a 35 ° C ±
0,5 ° C y utilizar para realizar más pruebas.
NOTA: La identificación de cualquier 1 de las 5 colonias como E.coli es suficiente para
considerar que el tubo de la CE como positivos; por lo tanto, pueden necesitar ser probado no
todos los 5 aislamientos.
Lleve a cabo la tinción de Gram. Todas las culturas que aparecen como bacilos Gram-negativos,
cortos deben ser probados para las reacciones IMViC a continuación y también volvieron a
inocular nuevamente dentro de LST para confirmar la producción de gas.

6. Producción de indol. Inocular tubo de caldo triptona e incubar 24 ± 2 horas a 35 ° C ± 0,5 ° C.
Prueba de indol añadiendo ,2-,3 ml de reactivo de Kovacs. Aparición de característico color rojo
en la capa superior es prueba positiva.
Voges-Proskauer (VP) reactiva compuestos. Inocular tubo de caldo MR-VP e incubar 48 ± 2
horas a 35 ° C ± 0,5 ° C. Transferir 1 ml de 13 × 100 mm tubo. Añadir 0,6 ml de solución de α-
naftol y 0,2 ml KOH al 40% y agitar. Añadir unos pocos cristales de creatina. Agitar y dejar
reposar 2 horas. La prueba es positiva si el color rosa eosina desarrolla.
Metil-compuestos rojos reactivos. Después de la prueba VP, incubar tubo MR-VP adicional de
48 ± 2 horas a 35 ° C ± 0,5 ° C. Añadir 5 gotas de solución de rojo de metilo a cada tubo.
Característico color rojo es positivo. El amarillo es la reacción negativa.
Citrato. Ligeramente inocular tubo de caldo citrato de Koser; evitar turbidez detectable. Incubar
durante 96 horas a 35 ° C ± 0,5 ° C. Desarrollo de turbidez es distinta reacción positiva.
Gas de la lactosa. Inocular un tubo de LST e incubar 48 ± 2 horas a 35 ° C ± 0,5 ° C. La
producción de gas (el desplazamiento de medio de vial interno) o la efervescencia tras una suave
agitación es reacción positiva.
Interpretación: Todas las culturas que (a) la lactosa fermento con la producción de gas dentro
de 48 horas a 35 ° C, (b) aparecen como barras nonsporeforming Gram-negativas y (c) dan
patrones IMViC de + + - (biotipo 1) o - + - (biotipo 2) son considerados como E.coli. Calcular la
MPN (véase el apéndice 2) de E.coli basado en la proporción de tubos de la CE en 3 diluciones
sucesivas que contienen E.coli.
NOTA: Como alternativa, en lugar de realizar la prueba IMViC, utilizar API20E o el ensayo
bioquímico VITEK automatizado para identificar el organismo como E.coli. Utilice el
crecimiento de los cultivos inclinados de PCA y llevar a cabo estos ensayos como se describe por
el fabricante.
G. Método medio sólido - Coliformes
Preparar violeta de agar bilis rojo (VRBA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Enfriar a 48 ° C antes de su uso. Preparar, homogeneizar y decimalmente diluir la muestra como
se describe en la sección I. C por encima de manera que se obtengan las colonias aisladas cuando
se siembran. Transferir dos alícuotas de 1 ml de cada dilución a placas petri, y utilizar cualquiera
de los dos siguientes métodos emplear siembra, dependiendo de si las células dañadas o
estresadas son sospechosos de estar presente (1).
Verter 10 ml VRBA atemperada a 48 ° C en placas, placas de remolino para mezclar, y dejar que
se solidifique. Para evitar el crecimiento de la superficie y la difusión de las colonias,
superposición con 5 ml VRBA, y dejar que se solidifique. Si la reanimación es necesario, vierta
una capa basal de 8-10 ml de agar de soja tríptico atemperada a 48 ° C. Placas del remolino para
mezclar, e incubar a temperatura ambiente durante 2 ± 0,5 h. Luego superponer con 8-10 ml de
derretida y enfriada VRBA y dejar solidificar.

7. Invertir las placas e incubar 18-24 solidificadas horas a 35 ° C. Incubar productos lácteos a 32 °
C (2). Examinar las placas bajo lupa y con iluminación. Recuento de las colonias rojo-púrpura
que son 0,5 mm o más de diámetro y rodeado por zonas de los ácidos biliares precipitadas. Las
placas deben tener 25 a 250 colonias. Para confirmar que las colonias son coliformes, recoger al
menos 10 colonias representativas y transferir cada uno a un tubo de caldo BGLB. Incubar los
tubos a 35 ° C. Examine a las 24 y 48 h para la producción de gas.
NOTA: Si el tubo de gas BGLB positivo muestra una película, lleve a cabo la tinción de Gram
para asegurar que la producción de gas no se debió a bacilos Gram-positivos, la lactosa fermenta.
Determinar el número de compañeros homogeneizados Alimentación obstruye fácilmente los
filtros, por lo tanto, MF son los más adecuados para el análisis de muestras de agua; Sin
embargo, MF se puede utilizar en el análisis de los alimentos líquidos que no contienen altos
niveles de partículas como el agua embotellada (véase la Sección III para la aplicación de MF).
liforms por gramo de multiplicar el número de colonias sospechosas por ciento confirmados en
BGLB por el factor de dilución.
Alternativamente, E. colonias de E. coli se pueden distinguir entre las colonias de coliformes en
VRBA mediante la adición de 100 g de 4-metil-umbeliferil-β-D-glucurónido (MUG) por ml en
la superposición VRBA. Después de la incubación, observar la fluorescencia azulada alrededor
de las colonias bajo luz UV de onda larga. (Ver sección LST-MUG II para la teoría y la
aplicabilidad.)
H. Membrana de filtración (MF) Método - coliformes: véase la Sección III.El agua
embotellada.
Homogeneizados de alimentos se atascan fácilmente filtros, por lo tanto, MF son los más
adecuados para el análisis de muestras de agua; Sin embargo, MF puede ser utilizado en el
análisis de alimentos líquidos que no contienen altos niveles de partículas, tales como agua
embotellada (véase la Sección III para la aplicación de MF).
II. Método LST-MUG para la detección de E.coli en refrigerada o congelada Alimentos Exclusivo
de Moluscos Bivalvos
El ensayo LST-MUG se basa en la actividad enzimática de la β-glucuronidasa (GUD), que escinde el
sustrato 4metilumbeliferil β-D-glucurónido (MUG), para liberar 4 metilumbeliferona (MU). Cuando se
expone a la onda larga (365 nm) de luz UV, MU exhibe una fluorescencia azulada que se visualiza
fácilmente en el medio o alrededor de las colonias. Más del 95% de E.coli produce GUD, incluyendo
(no productoras de gas) cepas anaerogenic. Una excepción es enterohemorrágicaE.coli (EHEC) del
serotipo O157: H7, que es negativo consistente GUD ( 11 , 17 ). La falta de fenotipo GUD en O157: H7
se utiliza a menudo para diferenciar este serotipo de otras E.coli, aunque las variantes positivas GUD de
O157: H7 no existe ( 24 , 26 ). La producción de GUD por otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae es poco frecuente, a excepción de algunos shigellae (44 -58%) y Salmonella (20-
29%) ( 18 , 27 ). Sin embargo, la detección inadvertida de estos patógenos mediante ensayos basados-
GUD no se considera un inconveniente desde la perspectiva de la salud pública. Expresión de la
actividad GUD se ve afectado por la represión de catabolitos ( 8 ) de modo en ocasiones, algunos

8. E.colison GUD-negativo, a pesar de que llevan el UID Un gen (gus A) que codifica para la enzima ( 19
). En la mayoría de los análisis, sin embargo, alrededor del 96% de E.coli cepas aisladas son-GUD
positivos sin necesidad de inducción enzimática ( 27 ).
TAZA puede incorporarse en casi cualquier medio para su uso en la detección de E.coli. Sin embargo,
algunos medios de comunicación tales como EMB, que contienen componentes fluorescentes, no son
adecuados, ya que enmascarar la fluorescencia de MU. Cuando TAZA se incorpora en el medio de LST,
coliformes se pueden enumerar sobre la base de la producción de gas a partir de lactosa y E.coli son
presuntamente identifican por fluorescencia en el medio bajo luz UV de onda larga, por lo que es capaz
de proporcionar una identificación presuntiva de E.coli en 24 horas ( 18 , 28 ). El método LST-MUG
describe a continuación ha sido adoptado como acción final oficial de la AOAC para el análisis de E.coli
en los alimentos refrigerados o congelados, con exclusión de los mariscos ( 28 ). Consulte Sec. IV.4. D.
Para las precauciones en el uso de MUG en las pruebas de los mariscos. Para obtener información sobre
contactos de ensayo MUG, Dr.Peter Feng FDA, CFSAN, College Park, MD, 20740; 240-402-1650.
PRECAUCIÓN: para observar la fluorescencia, examine tubos LST-MUG inoculadas bajo onda larga
(365 nm) de luz UV en la oscuridad. Una lámpara de UV de mano 6 vatios es adecuada y segura.
Cuando se utiliza una fuente de UV más potente, como una lámpara fluorescente de 15 vatios, usar
anteojos o gafas protectoras. Además, antes de su uso en ensayos de taza, examinar todos los tubos de
vidrio para la autofluorescencia. El óxido de cerio, que a veces se añade al vaso como medida de control
de calidad, será fluorescente bajo la luz ultravioleta e interferir con la prueba de MUG ( 25 ). El uso de
cepas de control positivo y negativo para la reacción MUG es esencial.
A. El equipo y los muestra en la sección IA supra y además,
1. Nuevos tubos de vidrio borosilicato, desechables (100 × 16 mm)
2. Nuevo, de vidrio borosilicato desechable Durham viales (50 × 9 mm) para la recolección
de gas
3. Lámpara UV de onda larga, que no exceda de 6 vatios
B. Medios y reactivos: ver sección IB
C. Presunta prueba LST-MUG para E.coli.
Preparar las muestras de alimentos y realizar la prueba de la MPN presuntiva como se describe en la
sección IC anterior, excepto el uso de tubos LST-MUG lugar de LST. Asegúrese de inocular un tubo de
LST-MUG con una conocida E. GUD-positivo coli aíslan como control positivo (ATCC 25922).
Además, inocular otro tubo con un cultivo de Enterobacteraerogenes (ATCC 13048) de cultivo de
Enterobacteraerogenes (ATCC 13048) o una cepa de Klebsiellapneumoniae como control negativo, para
facilitar la diferenciación de tubos de muestra que muestran sólo el crecimiento de aquellos que muestra
el crecimiento y la fluorescencia . Incubar los tubos de 24 a 48 ± 2 horas a 35 ° C. Examine cada tubo
para el crecimiento (turbidez, gas) y luego examinar los tubos en la oscuridad bajo la lámpara UV de
onda larga (365 nm). A fluorescencia azulada es una prueba presuntiva positiva para E.coli. Los estudios
realizados por Moberg et al. ( 28 ) muestran que un 24 h de lectura de fluorescencia es un indicador
preciso de E.coli y puede identificar 83-95% de la E. tubos coli-positivos. Después de 48 h de
incubación, 96-100% de E. tubos coli-positivos pueden ser identificados ( 28 ). Realice una prueba
confirmada en todos los tubos presuntamente positivos rayando una asada de la suspensión de cada tubo
fluorescente de agar L-EMB e incubar 24 ± 2 horas a 35 ° C. Seguir los protocolos descritos en I. F, por

9. encima, para prueba Completado por E.coli. Calcular NMP de E.coli basado en la combinación de tubos
fluorescentes confirmados en 3 diluciones sucesivas.
III. Examen del agua embotellada
El consumo de agua embotellada está aumentando rápidamente en todo el mundo. Sólo en los EE.UU.,
más de 3,6 millones de galones de agua embotellada se consumieron en 1998 (Asociación Internacional
de Agua Embotellada, Alexandria, VA). A diferencia del agua potable, que está regulado por los
EE.UU. EPA, el agua embotellada está clasificada legalmente como alimentos en los EE.UU. y está
regulado por la FDA (Federal Register 1995 21 CFR Parte 103 y otros bebidas:.... Agua embotellada;
regla final 60 ( 218) 57.076 a 57.130). FDA define el agua embotellada como "el agua que se destina al
consumo humano y que se sella en botellas u otros recipientes, sin ingredientes añadidos, excepto que
puede contener agentes antimicrobianos inocuos e idóneos" y, dentro de las limitaciones, algunos
agregado fluoruro. El agua embotellada puede ser utilizado como una bebida por sí mismo o como
ingrediente en otras bebidas. Estas normas no se aplican a los refrescos o bebidas similares. Además de
"agua embotellada" o "agua potable", en el 21 CFR Parte 103 FDA también define varios tipos de agua
embotellada que cumplan con ciertos criterios. Estas identidades son "agua artesiano o pozo artesiano",
"aguas subterráneas", el agua mineral "," agua purificada o desmineralizada "," agua con gas en botella
"," agua de manantial "y" pozo de agua ". Además" agua estéril "se define como el agua que cumple con
los requisitos de acuerdo con la "Prueba de esterilidad" de la Farmacopea de Estados Unidos.
Los organismos coliformes no son necesariamente patógenos y rara vez se encuentran en el agua
embotellada, sin embargo, sirven como un indicador de insalubridad o una posible contaminación. Las
encuestas han demostrado que los coliformes son indicadores útiles de la calidad del agua embotellada,
pero algunos países también monitorear las poblaciones microbianas adicionales como indicadores de la
calidad del agua de la botella ( 10 , 33 ). En virtud de la norma de calidad del agua embotellada actual, la
FDA ha establecido un requisito de la calidad microbiológica que se basa en los niveles de detección de
coliformes. Estos niveles se pueden obtener por filtración de membrana (MF) o por 10-tubo de análisis
de NMP de diez unidades de análisis 10-mL. Para obtener información sobre los métodos de agua
embotellada en contacto con el Dr.Peter Feng , FDA, CFSAN, College Park, MD, 20740; 240-402-1650.
A. Equipos y Materiales.
1. Incubadora a 35 ° ± 0,5 ° C.
2. Unidades de filtración de membrana (base del filtro y embudos): vidrio, plástico o acero
inoxidable; envuelto en papel de aluminio o papel y esterilizada.
3. Cámara de esterilización ultravioleta para la esterilización de la base del filtro y embudos
(opcional).
4. Colector de filtro o frasco de vacío para sujetar embudos filtrantes.
5. La fuente de vacío (vacío línea, bomba eléctrica de vacío o aspirador de agua).
6. Los filtros de membrana; estéril, blanca, cuadrícula, de 47 mm de diámetro, 0,45 m de
tamaño de poro (o equivalente, según lo especificado por el fabricante) para el recuento
de bacterias.
7. Placas de Petri, estéril, de plástico, 50 × 12 mm, con tapas bien ajustadas.
8. Pinzas diseñadas para transferir las membranas y sin daños.
B. Los medios de cultivo.
1. Lauril sulfato triptosa (LST) de caldo ( M-76 ).

10. 2. Brilliant caldo lactosa bilis verde (BGLB) ( M-25 ).
3. M-Endo Medio (BD # 274930) ( M-196 ).
4. LES-Endo Agar (BD # 273620) ( M-197 ).
C. Ten tubo NMP prueba de coliformes - Presunta y procedimientos confirmados.
Para el examen de rutina de agua embotellada, tomar 100 ml de muestra e inocular 10 tubos de
2X LST (10 ml de medio) con 10 ml de muestra sin diluir cada una. Incubar los tubos a 35 ° C.
Examinar los tubos a 24 ± 2 h para el crecimiento y la formación de gas como se evidencia por el
desplazamiento del medio en el frasco de la fermentación o la efervescencia cuando los tubos se
agitan suavemente. Si es negativo a las 24 h, tubos reincubate para un adicional de 24 h y
examinar de nuevo para el gas. Realizar una prueba confirmada en todos presuntamente positivo
(gaseado) tubos como sigue: agitar suavemente cada tubo LST positiva y, usando un 3.0 - 3.5
mm asa estéril, transferir una o más asas llenas de suspensión a un tubo de caldo de BGLB. Palos
aplicador de madera estéril también puede ser usado para la transferencia mediante la inserción
de por lo menos 2,5 cm en el caldo de cultivo. Incubar los tubos BGLB durante 48 ± 2 horas a 35
° C. Examine para la producción de gas y registro. Calcular NMP utilizando 10 tubos NMP
Tabla (9221.III), p. 9-52, Métodos Estándar para el Análisis de Aguas y Aguas Residuales ( 3 ).
NOTA: si se encuentra que una muestra contiene coliformes (en cualquier nivel) seguir el
procedimiento descrito en la sección. SI anteriormente para determinar si es E.coli. No se
permite el agua embotellada para contener E.coli.
D. Método de filtro de membrana para coliformes.
Filtrar 100 ml de muestra de ensayo y transferir el filtro a medio M-Endo ( M-196 ) o LES Endo
Agar ( M-197 ) y se incuba a 35 ° C ± 0,5 ° C durante 22-24 h. Recuento de las colonias que son
de color rosa a rojo oscuro con un brillo metálico superficie verde. El brillo puede variar de
Pinpoint para completar la cobertura de la colonia. Se recomienda el uso de una energía baja, de
tipo microscopio de disección para examinar los filtros.
Confirmación - Si hay de 5 a 10 brillo colonias sobre el filtro, confirma en su totalidad mediante
la inoculación de crecimiento de cada colonia con brillo en los tubos de LST y se incuba a 35 ° C
± 0,5 ° C durante 48 h. Si el número de colonias con brillo supera 10, seleccionará al azar y
confirmar 10 colonias que son representativos de todas las colonias con brillo. Cualquier tubos
LST positivos de gas deben ser subcultivaron a BGLB y se incubaron a 35 ° C ± 0,5 ° C durante
48 h. La producción de gas en BGLB dentro de 48 h es una prueba de coliformes confirmados.
Informe traduce como el número de colonias de coliformes por 100 ml. NOTA: El método
estándar, 1998, 20a ed, p. 9-60 (3), permite la inoculación simultánea de LST y BGLB durante la
verificación. Sin embargo, BGLB es algo inhibitoria por lo que el método descrito anteriormente,
donde las muestras se subcultivaron de LST en BGLB es considerado como un ensayo de
verificación más sensible y, por lo tanto, recomendable.
NOTA: si se encuentra que una muestra contiene coliformes (en cualquier nivel) seguir el
procedimiento descrito en la sección. SI anteriormente para determinar si es E.coli. No se
permite el agua embotellada para contener E.coli.

11. IV. El examen de los mariscos y carne de mariscos
El procedimiento oficial de la FDA para el análisis bacteriológico de los moluscos bivalvos, nacionales e
importados se completa y adecuada se describe en los procedimientos recomendados por la APHA para
el Análisis de agua de mar y mariscos, 4 ª ed. 1970 (1). Los métodos, incluyendo el 5 tubos
convencionales MPN para coliformes, coliformes fecales y recuento en placa estándar total para las
bacterias (véase la Parte III, del APHA Procedimientos recomendados sobre el examen de agua de mar y
mariscos, cuarta ed. 1970 ( 1 ), se describen a continuación para el examen de la cáscara de valores, las
carnes frescas sin concha, mariscos congelados-frescos desconchados y mariscos congelados en su
concha. Estos procedimientos no se aplican al examen de los crustáceos (cangrejos, langostas y
camarones) o carne de mariscos procesados, tales como empanadas, , productos precocinados y
procesados térmicamente sin concha (véase la sección IC de este capítulo). Además, hay muchos
métodos que se utilizan para las pruebas para la cosecha de mariscos y el agua del medio ambiente para
los coliformes fecales. Un ejemplo, el agar MTEC ( M-198 ) es un medio de filtro de membrana
adecuado para el recuento de coliformes fecales en las aguas de estuario marina y. Brevemente, después
de la filtración de 100 ml de agua, los embudos de filtro deben enjuagarse dos veces con aprox. 20 ml de
PBS. El filtro se transfiere a continuación sobre MTEC agar y se incubaron durante 22-24 horas a 44,5 °
C en Ethyfoam. Todos, de color verde amarillo amarillo o amarillo-marrón colonias se cuentan como los
coliformes fecales. Sólo se cuentan las placas que tienen menos de 80 colonias. Sin embargo, el análisis
de las aguas ambientales no se cubrirá en detalle aquí, ya que los análisis de agua y ambientales son
realizados por la EPA de los EE.UU. ( 3 ) y la calidad de las aguas de captura de mariscos son
principalmente las responsabilidades de las autoridades de control de mariscos de cada Estado ( 20 ).
A. Preparación de la muestra
El uso de 10-12 mariscos, obtener 200 g de licor de mariscos y carne. Mezcla 2 min, con 200 ml
de fosfato estéril de agua de dilución tamponada o 0,5% de agua de peptona ( R97 ) para
producir una dilución 1:02 de la muestra. El análisis de la muestra de suelo debe comenzar
dentro de 2 minutos después de la mezcla. Hacer diluciones seriadas en el 0,5% de agua de
peptona estéril o tampón fosfato agua de dilución estéril.
B. NMP - Presunta y prueba confirmada de Coliformes
Utilice Lactosa Caldo ( M74 ) o lauriltriptosa caldo ( M76 ), en concentración natural en el
volumen de 10 ml. Para el análisis de NMP de 5 tubos, inocular los tubos 5 en cada dilución de
la siguiente manera:
Para cada uno de los 5 tubos, añadir 2 ml de homogenado mezclado (equivalente a 1 g de
mariscos).
Para cada uno de los 5 tubos, añadir 1 ml de la dilución 1:10 del homogeneizado (0,1 g
mariscos).
Para cada uno de los 5 tubos, añadir 1 ml de la dilución 1:100 de homogeneizado (0,01 g
mariscos).

12. Para cada uno de los 5 tubos, añadir 1 ml de la dilución 1:1000 de homogeneizado (0,001 g
mariscos).
Diluciones adicionales pueden ser necesarias para evitar resultados indeterminados. Incubar los
tubos a 35 ° C ± 0,5 ° C y siga las instrucciones en la sección 1.C y realizar pruebas Confirmado
como en 1.D anteriormente en "Método convencional de coliformes, coliformes fecales y E.
coli". Calcular NPF como se describe en la sección 1.D anteriormente, excepto que el análisis de
los mariscos especifica que la densidad de coliformes puede expresar como NMP por 100 g de
muestra en lugar de por g.
C. NMP - Presunta y prueba confirmada de coliformes fecales en los mariscos
Realice la prueba de presunción que se describe en la sección II. Para confirmar tubos positivos,
transferir un asa de tubos LST positivos de gas para el caldo EC y se incuba en un baño de agua,
cubierto al 44,5 ° ± 0,2 ° C durante 24 ± 2 horas. La producción de gas en la CE es una prueba
confirmada positiva para coliformes fecales. Calcular el NMP por 100 g de coliformes fecales
como se describe anteriormente para coliformes.
D. NMP - Método EC-MUG para determinar E.coli en carne de mariscos
El ensayo MUG de β-glucuronidasa (GUD) se ha descrito anteriormente para la detección de
E.coli en alimentos refrigerados y congelados también se puede utilizar para la prueba para
E.coli en carne de moluscos; pero con ligeras modificaciones. Esto es debido al hecho de que los
alimentos tales como carne de moluscos contienen actividad GUD naturales ( 32 ). Como
resultado, homogeneizado ostra inoculado directamente en tubos LST-MUG en la fase
presuntiva de la prueba de la MPN puede provocar falsas reacciones positivas de fluorescencia.
Por lo tanto, en el análisis de E.coli en carne de moluscos, se añade el reactivo MUG al medio
EC y se utiliza en la fase de confirmación del ensayo. Los tubos CE-taza, se incubaron a 44,5 ° C
± 0,2 ° C, se pueden utilizar en la fase de confirmación de un ensayo convencional NPF 5-tubo
para determinar los niveles de coliformes fecales en carne de moluscos, a continuación, mediante
el examen de tubos para fluorescencia bajo UV de onda larga, una E.coli NPF también se puede
conseguir fácilmente ( 32 ).
Vea la sección 1.A y 1.B anterior para los materiales y reactivos necesarios. Utilice preparado
comercialmente deshidratada EC-MUG, o preparar el medio añadiendo TAZA de caldo EC (0,05
g / L) ( M50 ). Varias fuentes de compuesto TAZA son adecuados: MarcorDevelopment Corp.,
Carlstadt, NJ; Biosynth International, Itasca, IL; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO y Hach
Química, Loveland, CO Dispense 5 ml en nuevos tubos de vidrio borosilicato desechable (100 ×
16 mm) que contiene, nuevo vidrio borosilicato desechable Durham viales (50 × 9 mm) para la
recolección de gas . Esterilizar tubos de caldo EC-MUG a 121 ° C durante 15 minutos;
almacenar hasta 1 semana a temperatura ambiente o hasta un mes en condiciones de
refrigeración.
Lleve a cabo el 5 tubos NMP presuntivo y confirmada Prueba para Coliformes Fecales en
mariscos como se ha descrito anteriormente en la Sección 3, a excepción de utilizar tubos de EC-
MUG lugar de la CE para la prueba confirmada. Determinación de la fluorescencia en caldo CE-

13. MUG requiere el uso de tubos de control 3, uno inoculado con E.coli como control positivo; uno
con Enterobacteraerogenes (ATCC 13048) o K.pneumoniae como control negativo; y un tubo
sin inocular como EC-MUG medio de control por lotes. Inocular los controles positivos y
negativos en el momento en que se realizó la prueba confirmada e incubar los tubos a 44,5 ° C ±
0,2 ° C durante 24 h.
Leer la fluorescencia como se describe anteriormente en el ensayo LST-MUG. Tenga en cuenta
que algunos (<10%) E.coli son anaerogenic (gas-negativa), sino que debe ser MUG-positivos.
Incluir todos los tubos positivos de fluorescencia en el E. cálculos coli MPN. Determinar E.coli
MPN/100g de las mesas en el BAM (Apéndice 2) usando la combinación de tubos positivos de
fluorescencia en cada dilución.
NOTA: Si el análisis es determinar el cumplimiento con lo establecido E.coli límites, será
necesario para confirmar la presencia de E.coli en tubos positivos taza.
V. Análisis para E.coli en jugos cítricos
Análisis para E.coli se ha implementado para identificar jugos potencialmente contaminados o para la
verificación de la eficacia del sistema HACCP durante el procesamiento de jugos no pasteurizados (21
CFR Parte 120, vol. 66, No. 13, 19 de enero de 2001). El método estándar comúnmente utilizado para la
prueba para E.coli es la MPN sin embargo, no parece adecuado para las pruebas de jugo debido a la
acidez (pH 3,6 a 4,3) de jugos, que puede interferir con la prueba, además de que sólo permite para el
ensayo de 3,33 ml de muestra. A diferencia de la mayor parte E. coli métodos, que son ensayos de
enumeración, el siguiente método es una simple prueba de presencia / ausencia que puede examinar
volumen de 10 ml de jugos ( 34 , 35 ). Este ensayo, designado como Método modificado ColiComplete
(CC), es una modificación del método de la AOAC Oficial 992.30, que utiliza taza para la detección de
E. coli (véase la sección sobre el método LST-MUG para más detalles).
A. Equipo y materiales
1. Cubiertos baño de agua, con sistema de circulación para mantener la temperatura de 44,5
± 0,2 ° C.
El nivel del agua debe estar por encima del medio en tubos sumergidos.
2. Incubadora, 35 ± 0,5 ° C
3. Luz de onda larga UV [~ 365 nm], que no exceda 6 W.
B. Medios y reactivos:
1. Universal Preenrichment Caldo (UPEB) ( M188 ) o se puede comprar a partir de BD (#
223510)
2. Medio EC ( M49 )
3. ColiComplete discos (CC) (# 10800) - BioControl, Bellevue, WA
C. Preparación de la muestra, el enriquecimiento y el análisis
Realizar el ensayo por duplicado. Asépticamente, inocular porción de 10 ml de jugo en 90 ml de
UPEB e incubar a 35 ° C ± 0,5 ° C durante 24 h. Después del enriquecimiento, mezclar y
transferir 1 ml de cada caldo de enriquecimiento UPEB en 9 ml de caldo EC contiene un disco de
CC. Incubar los tubos de caldo de CE / cc a 45,5 ± 0,2 ° C en un baño de agua circulante for24 ±
2 h. Incluya un tubo inoculado con una TAZA (+) E. coli cepa como control positivo y otro con

14. K. pneumoniae o Enterobacteraerogenes (ATCC 13048) como control negativo. Examinar los
tubos en la oscuridad y bajo la luz ultravioleta de onda larga. La presencia de fluorescencia azul
en cualquiera de los tubos es indicativo de que E. coli está presente en la muestra. Nota: Los
discos de CC también contienen X-gal, que cuando se escinde por β-galactosidasa se produce un
color azul en o alrededor del disco. Esta reacción es análoga a la medición de la producción de
ácido / de gas de la fermentación de la lactosa, por lo tanto, la presencia del color azul es
indicativa de coliformes.
VI. Otros métodos para que enumera los coliformes y E. coli
Hay muchos otros métodos para la enumeración de coliformes y E. coli , incluyendo varias que utiliza
reactivos fluorogénicos como MUG u otros sustratos cromogénicos para la detección e identificación de
coliformes y presunto E. coli en los alimentos. Muchas de estas pruebas, como la película seca
rehidratablePetrifilm, la rejilla hidrofóbica de la membrana de filtro / método (HGMF / MUG) (MUG 13
), disco ColiComplete ( 16 ), Colilert (AOAC 991.15), han sido evaluadas por los estudios en
colaboración y adoptado de acción en primera o última como oficial por la AOAC. También hay muchas
modificaciones de los ensayos de filtración de membrana que se han desarrollado para la prueba de
coliformes, coliformes fecales y E. coli y algunos de éstos pueden ser útiles en la prueba de alimentos
tales como leche y bebidas, sino que se utilizan sobre todo para el agua, aguas ambientales, y el análisis
de las aguas de captura mariscos ( 5 , 7 , 20 , 22 , 23 , 31 ).
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