1. 20/08/2010
CARRERA DE ESPECIALISTA EN MEDICINA LEGAL
ASIGNATURA: GENÉTICA MÉDICO-LEGAL
20-21 de Agosto 2010
UNIVERSIDAD
NACIONAL
DEL COMAHUE
Ulises Toscanini
PRICAI-FUNDACIÓN FAVALORO
UNIVERSIDAD FAVALORO
1

2. 20/08/2010
OBJETIVOS GENERALES
Conocer:
•Tipos de estudios en Genética Forense
•Desarrollo de una pericia
• Solicitud
• Identificación de los involucrados / Evidencias
• Consentimiento informado
• Elaboración de informes
•Laboratorio
• Tipo de muestras
• Tipo de marcadores
• Metodología de Análisis
• Interpretación de resultados
•Valoración estadística de las pruebas
• Alcances del método
•Comunicación de resultados
Módulo 1 (20/08 – 15:00 a 17:30)
Introducción. Bases moleculares de la genética: estructura y replicación
del ADN. Localización celular del ADN. División celular: mitosis y
meiosis. Leyes de Mendel. Herencia mitocondrial. Herencia de
cromosomas sexuales. Función del ADN: el código genético. Fenotipo y
Genotipo. Mutaciones: definición y clasificaciones. Polimorfismos:
definición, tipos. Genética poblacional: frecuencias genótipicas y
frecuencias alélicas, equilibrio de Hardy-Weinberg. Resumen.
2

3. 20/08/2010
Genética
estudio de los caracteres heredados
biológicamente incluyendo aquéllos que son
influenciados por el medio ambiente.
Genética clásica
GENÉTICA
Genética molecular
FORENSE
Genética de poblaciones
Un poco de historia …
•1866. Mendel (reglas para la transmisión de caracteres)
•1869. Miescher (ácido nucleico)
•1870. Función de los núcleos celulares en la herencia.
•Cromosomas visible con microscopía óptica
•1920. DNA cromosomas. No role como material genético (
proteínas )
•1928. Griffith F. Transformación de cepas de S pneumoniae
•1944. Avery, McLeod, McCarty. El ADN es responsable de la
transformación del S pneumoniae.
•1952. Hershey & Chase.
•1953. Watson & Crick.
3

4. 20/08/2010
ADN. Composición química.
4

5. 20/08/2010
ADN. Replicación.
ADN. Replicación.
5

6. 20/08/2010
ADN. Localización celular.
El cariotpo humano.
6

7. 20/08/2010
ADN. Función.
ADN. Función: El código genético
PRIMERA BASE
U C A G
UUU CUU AUU GUU
phe
UUC CUC AUC ile GUC
U leu val
UUA CUA AUA GUA
S leu
UUG CUG AUG met GUG
E
G UCU CCU ACU GCU
U C UCC ser CCC pro ACC thr GCC ala
N UCA CCA ACA GCA
D UCG CCG ACG GCG
A UAU CAU AAU GAU
tyr his asn asp
A UAC CAC AAC GAC
B UAA stop CAA AAA GAA
A gln lys glu
UAG stop CAG AAG GAG
S
E UGU cys CGU AGU ser GGU
G UGC CGC arg AGC GGC gly
UGA stop CGA AGA GGA
arg
UGG trp CGG AGG GGG
7

8. 20/08/2010
División Celular. Mitosis.
Ciclo celular Mitosis
Células somáticas
Células hijas con número diploide de
cromosomas
Células hijas genéticamente idénticas
8

9. 20/08/2010
División Celular. Meiosis.
Meiosis
Células de la línea germinal
Células hijas con número haploide de
cromosomas
Células hijas genéticamente diferentes
División Celular. Meiosis.
9

10. 20/08/2010
10

11. 20/08/2010
θ=0,5 θ=0 0<θ<0,5
Desequilibrio de ligamiento
11

12. 20/08/2010
Leyes de Mendel.
Principio de segregación.
En la formación de las gametas los determinantes
hereditarios se separan (segregan) de forma tal que cada gameta
tiene la misma probabilidad de contener cualquier miembro del par.
Principio de distribución independiente.
La segregación de los miembros de cualquier par de alelos
es independiente de la segregación de otros pares en la formación
de las células reproductivas
12

13. 20/08/2010
GENES Y PEDIGREES
CARACTERES MENDELIANOS
•Caracteres cuya presencia ó ausencia depende del genotipo en
un locus en particular.
•No implica que ese caracter sea determinado únicamente por
ese locus.
•El genotipo de un locus es suficiente y necesario para la
expresión de un determinado carácter
•OMIM: 12.000 genes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)
ADN mitocondrial.
Uso Forense: Secuenciación de
la Región Control (HVI / HVII)
13

14. 20/08/2010
Genoma Nuclear vs Mitocondrial
NUCLEAR MITOCONDRIAL
3300 MB 16kb
23 /24 moléculas lineales diferentes 1 molécula circular
23 moléculas por cél hapl. y 46 por
cél. Diploides Múltiples copias por células
Menor tasa de mutación Mayor tasa de mutación
~3% codificante 97% codificante
Biparental para autosomas y cr X en Herencia materna
mujeres; paterna en Cr Y.
Herencia mitocondrial.
14

15. 20/08/2010
Cromosoma Y.
NO RECOMBINACION (!)
HERENCIA HAPLOTÍPICA
HERENCIA MASCULINA
Herencia Cromosoma Y.
15

16. 20/08/2010
Cromosoma X.
RECOMBINACIÓN EN MUJERES
IGUAL QUE HERENCIA AUTOSÓMICA EN
MUJERES
100% MATERNA EN VARONES
Organización del Genoma Humano
Genoma Humano
Genoma Nuclear Genoma Mitocondrial
3300Mb 16.6Kb
< 30.000 genes 99.25% 37 genes 0.75%
~25% ~75%
Genes y secuencias DNA 2 genes 22 genes de 13 genes
relacionadas extragénico rRNA tRNA polipeptídicos
Unica copia o
moderadamente
repetitivo
~10% ~90% ~60% ~40%
DNA DNA no Copia única ó bajo Moderado a
codificante codificante número de copias altamente repetitivo
Pseudogenes Intrones, secuencias no Secuencias Repeticiones
traducidas repetidas en tándem diseminadas
16

17. 20/08/2010
Algunos concepto más …
Locus (Def. & Nomenclatura)
Alelo
Polimorfismo
Marcador genético
Homocigosis / heterocigosis
Genotipo / Fenotipo
Polimorfismos.
De Longintud
DNA VNTRs
Satélites
Minisatélites (SLPs)
Microsatélites (STRs)
Otros
De Secuencia
DNA SNPs
17

18. 20/08/2010
POLIMORFISMOS DE LONGITUD
A B
5 Km Locus A- Individuo 1
500 pb
Cromosoma paterno
Cromosoma materno
2,5 Km
250 pb
A B
Muestra Poblacional (N=84)
600 (N=8)
500 (N=20)
400 (N=35)
300 (N=19)
250 (N=2)
POLIMORFISMOS DE SECUENCIA
A B
Locus B- Individuo 1
500 pb
Cromosoma paterno
Cromosoma materno
500 pb
A B
Locus C- Individuo 1
500 pb
Cromosoma paterno
Cromosoma materno
500 pb
A B
18

19. 20/08/2010
Mutaciones.
Mutaciones.
19

20. 20/08/2010
Genética Poblacional.
El estudio cuantitativo de la variación genética en las
poblaciones y la forma en que se establecen y modifican las
frecuencias alélicas y genotípicas como consecuencia de
factores genéticos, sociales y ambientales, se conoce como
genética poblacional.
Frecuencias alélicas
Frecuencias genotípicas
Frecuencias Alélicas y
Genotípicas
Muestra
N=118
Marcador Genético A
20

21. 20/08/2010
Frecuencias Alélicas
Frecs. Alélicas: 0,055 0,411 0,254 0,165 0,110 0,004 1,000
N ALELO 6 7 8 9 10 11
13 6 0
97 7 3 21
60 8 2 30 4
39 9 4 14 13 1
26 10 4 8 7 6 0
1 11 0 0 0 0 1 0
236
Frecuencias Genotípicas
Frecuencias Genotípicas
ALELO 6 7 8 9 10 11
6 0,000
7 0,025 0,178
8 0,017 0,254 0,034
9 0,034 0,119 0,110 0,008
10 0,034 0,068 0,059 0,051 0,000
11 0,000 0,000 0,000 0,000 0,008 0,000
N=118 Individuos
21

22. 20/08/2010
Equilibrio de Hardy-Weinberg
(HWE).
1. Las frecuencias genotípicas son iguales en hombres y en mujeres
2. La población es muy grande y los apareamientos en la población son al azar
2. No hay fenómenos migratorios
3. La tasa de mutación es nula
4. Todos los apareamientos producen en promedio idéntico número de descendientes
5. No hay superposición de generaciones
6. No hay selección a favor o en contra de un determinado genotipo.
Genotipo Frecuencia genotípica
esperada GH Hardy (1877-1947)
AA p2
Aa 2pq
W Weinberg (1862-1937)
aa q2
Deriva génica, flujos migratorios, selección, subestructuración, apareamiento selectivo,
consanguinidad
Genotipo Frecuencia genotípica esperada
LEY DE HARDY-WEINBERG
AA p2
Aa 2pq
Consejo genético aa q2
Un desorden autosómico recesivo afecta 1 de cada 10000 RN en una
población determinada. Cuál es la frecuencia de portadores en esa
población?
22

23. 20/08/2010
LEY DE HARDY-WEINBERG
Consejo genético
Fenotipo No afectado Afectado
Genotipo AA Aa aa
Frecuencia p2 2pq q2
q2 = 10-4 q= 10-2 p=1-q=0,99
Frecuencia de portadores (2pq) = 2*0,01*0,99= 0,02 (20%, 1/50)
HWE
23

24. 20/08/2010
HWE
… el mero hecho de que las frecuencias genotípicas cumplan con las
proporciones de HW no puede ser tomado como evidencia de que todas los
supuestos del model son válidos…
…a lo sumo podría concluirse es que, a pesar de cualesquiera desviaciones de
los supuestos que pudiesen existir, las mismas no son lo suficientemente
importantes para resultar en desviaciones del HWE detectables mediante
tests estadísticos convencionales…
HWE
Tests
24

25. 20/08/2010
HWE
Test (Chi Cuadrado)
… el valor de P es la probabilidad de que el azar solamente pueda producir una
desviación al menos tan grande como la observada realmente entre los valores
observados y esperados …
P es grande, solo el azar podría ocasionar la desviación aceptar
P es pequeño, no es probable que solo el azar ocasione la desviación rechazar
Cuál es el límite entre “grande” y “pequeño”
Usualmente: 0.05
HWE
Test exactos
… asumen que la hipótesis es cierta y calculan la probabilidad de un resultado tanto o
menos probable que el observado.
valores bajos de p sugieren que la hipótesis no es verdadera
Usualmente: 0.05
25

26. 20/08/2010
HWE
Test exacto
Fr.
2/6
4/6
Fr.
2/8
6/8
Fr.
2/10
8/10
26

27. 20/08/2010
SUBESTRUCTURACIÓN POBLACIONAL
27

28. 20/08/2010
Módulo 2 (20/08 – 18:00 a 21:00)
Genética forense. Evolución de las pruebas biológicas en identificación
humana. La actualidad: polimorfismos y metodologías de elección: STRs
autosómicos y de cromosomas sexuales, SNPs, ADN mitocondrial.
Nomenclatura. Parámetros forenses: probabilidad de coincidencia,
probabilidad de exclusión a priori, otros.
Laboratorio. Etapas del proceso: extracción de ADN. Cuantificación del
ADN. Análisis del ADN: PCR y detección. Obtención de resultados.
Infraestructura y equipamiento de los laboratorios. Acreditaciones.
Controles de Calidad Nacionales e Internacionales. Normas de trabajo de
los laboratorios forenses. Sociedad Internacional de Genética Forense
(ISFG) y sus grupos. Sociedad Argentina de Genética Forense (SAGF).
Evolución de las pruebas
genéticas.
HLA
ADN
Grupos
Sanguíneos
Proteínas
Plasmáticas
28

29. 20/08/2010
Era pre-ADN:
MARCADOR GENÉTICO Pr. de Exclusión
ABO 0.1342
GLÓBULOS
MNs 0.3095
ROJOS
Rh 0.2746
Kell 0.0354
Kidd 0.1869
Duffy 0.1844
Haptoglobina 0.1834
PROTEÍNAS
Gm 0.2275
SÉRICAS
Km 0.0601
Transferrina 0.0064
Gc 0.1661
C3 0.1523
Bf 0.1443
G.Fosf glu. Deshidrogenasa 0.0229
ENZIMAS
Fosfoglucomutasa 0.1457
Adenil quinasa 0.0428
Adenosina deaminasa 0.0452
Transaminasa G1 pirúvica 0.1875
Esterasa D. 0.0913
HLA
HLA 0.80
Era ADN:
Año Ciencia Forense y Aplicaciones
1985 Probes ML desarrolladas por Alec Jeffreys
1986 Test de ADN públicos en USA (Cellmark / Lifecodes)
1988 SLP (FBI) / Polymarker & DQα
1989 Detección de marcadores mediante tinción con plata
1991 Marcadores STRs fluorescentes
1992 Electroforesis capilar
1993 Primer kit comercial
. .
. .
1996 mtDNA test (FBI)
1997 Y-STR
. .
. .
2010 Bases de Datos de ADN
29

30. 20/08/2010
Jeffreys 1985-DNA Fingerprinting
-GGGCAGGAXG-
Multilocus VNTRs
Southern blot
Minisatélites
(RFLPs)
Microsatélites
(STRs)
PCR
Electroforesis Detección Detección
Capilar Automática Manual
Polimorfismos utilizados
actualmente en Genética F.
POLIMORFISMOS DE POLIMORFISMOS DE
LONGITUD SECUENCIA
30

31. 20/08/2010
POLIMORFISMOS DE
LONGITUD
VNTRs Indels (inserciones /
(Variable Number of Tandem Repeats) deleciones)
DNA
DNA Minisatélite
Microsatélite
En proceso de
STRs validación
Multilocus (Short Tandem
Repeats)
Single Locus Autosómicos
Cromosma Y
Cromosoma X
POLIMORFISMOS DE
SECUENCIA
SNPs Varios pares de
(Single Nucleotide Polimorphism) bases
Autosómicos HLA Autosómicos
CromosmaY ADN
mitocondrial
Cromosoma X
ADN
mitocondrial
31

32. 20/08/2010
Comparación de las tecnologías de
análisis
SNP multiplex
Fingerprinting
Jeffreys 1985-DNA Fingerprinting
-GGGCAGGAXG-
Gen de β-globina
Southern Blot
Enzimas de Restricción
Electroforesis
Transferencia a
membranas
Hibridación
Revelado
32

33. 20/08/2010
VNTRsA B
500 pb
250 pb
A B
VNTRs
Minisatélites
A B
5000 pb
3500 pb
A B
Enzimas de restricción
Southern Blot
Electroforesis
Transferencia
Hibridación
Revelado
33

34. 20/08/2010
VNTRs STRs
Microsatélites
A B
500 pb
250 pb
A B
Primers (PCR)
Electroforesis
Detección Manual (Tinción)
Detección Automática (Fluorescencia)
Ventajas principales de la
utilización de STRs
Mayor sensibilidad (PCR)
Mayor eficiencia en muestras de baja calidad
Standarización
Proficiency testing
Multiplexes
Menor tiempo de análisis
34

35. 20/08/2010
Distribución de los STRs
Autosomas
Cromosoma X
Cromosoma Y
STRs autosómicos más utilizados en la actualidad
en estudios de filiación y forenses
D3S1358 PENTA D
TH01 PENTA E
D21S11 D2S338
D18S51 D19S433
Vwa Amelogenina
D8S1179 LPL
FGA F13A01
D5S818 FESFPS
D13S317 HPRTB
D7S820 F13B
D16S539
CSF1PO
Amelogenina MUCHOS OTROS
CODIS
COMERCIALES (APPLIED BIOSYSTEMS – PROMEGA CORP.)
35

36. 20/08/2010
Utilización de marcadores del
Cromosma Y
LINAJE PATERNO (CASOS COMPLEJOS)
FORENSE (MULTIPLES CONTRIBUYENTES)
Utilización de marcadores del
Cromosoma X
CASOS ESPECIALES
TITULAR MUJER
MATERNIDADES
CASOS INCOMPLETOS
LINKAGE DESEQUILIBRIUM
VALORACIÓN
36

37. 20/08/2010
STRs de cromosomas sexuales utilizados en la
actualidad
DYS19 DXS8378
DYS385 DXS9898
DYS389I DXS7133
DYS389II GATA31E08
DYS390 GATA172D05
DYS391 DXS7423
DYS392 DXS6809
DYS393 DXS7132
DYS437 DXS9902
DYS438 DXS6789
DYS439
DYS448 GHEP-ISFG
DYS456
DYS458
DYS635
GATA H4
COMERCIALES (APPLIED BIOSYSTEMS – PROMEGA CORP.)
Parámetros de interés forense
para evaluar un marcador
genético
37

38. 20/08/2010
Parámetros de interés forense
para evaluar un marcador
genético
Locus: D3 TH D21 D18 PE PD VWA D8 TPOX FGA
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
Forense
Probabilidad de coincidencia 0,1021 0,0843 0,0539 0,0313 0,0167 0,0495 0,0824 0,0702 0,1575 0,0271 1,793E-18
Expresado como 1 en ... 9,7975 11,8567 18,5576 31,9779 59,8125 20,1996 12,1306 14,2482 6,3498 36,9683
Poder de discriminación 0,8979 0,9157 0,9461 0,9687 0,9833 0,9505 0,9176 0,9298 0,8425 0,9729
PIC 0,7121 0,7382 0,8089 0,8640 0,9043 0,8142 0,7494 0,7731 0,6269 0,8693
Paternidad
Probabilidad de exclusión 0,5681 0,5182 0,7130 0,7639 0,8619 0,6095 0,5429 0,6095 0,3840 0,7582 0,9999996
1-PE 0,4319 0,4818 0,2870 0,2361 0,1381 0,3905 0,4571 0,3905 0,6160 0,2418 0,000000
Indice de paternidad típico 2,3052 2,0402 3,5500 4,3293 7,3958 2,5725 2,1646 2,5725 1,5171 4,2262
Frecuencias alélicas
Frecuencias alélicas mínimas 0,0083 0,0082 0,0089 0,0092 0,0098 0,0085 0,0083 0,0085 0,0077 0,0091
Homocigotos 0,2169 0,2451 0,1408 0,1155 0,0676 0,1944 0,2310 0,1944 0,3296 0,1183
Heterocigotos 0,7831 0,7549 0,8592 0,8845 0,9324 0,8056 0,7690 0,8056 0,6704 0,8817
Alelos totales 710 710 710 710 710 710 710 710 710 710
ADN mitocondrial (ADNmt) en
forense
LINAJE MATERNO
FORENSE
MÁS SENSIBILIDAD
PELOS SIN BULBO
VALORACIÓN
ANTROPOLOGÍA MOLECULAR
38

39. 20/08/2010
OTROS TIPOS DE MARCADORES
SNPs
SNaPshot
IN/DELS
Análisis de fragmentos
BIALÉLICOS (MENOS PD)
Laboratorio de ADN
1. EXTRACCIÓN DE ADN
2. CUANTIFICACIÓN DEL ADN EXTRAÍDO:
1. AGAROSA + Bromuro de Etidio
2. ESPECTROFOTOMETRÍA
3. SONDAS ESPECÍFICAS
4. REAL TIME PCR (FORENSE)
3. PCR (SISTEMAS MULTIPLEX)
1. MARCADORES AUTOSÓMICOS
2. CROMOSOMA Y (SI APLICA)
3. CROMOSOMA X (SI APLICA)
4. ADN MITOCONDRIAL (SI APLICA)
5. RESULTADOS
1. DETECCIÓN / TRANSCRIPCIÓN / NOMENCLATURA
39

40. 20/08/2010
Extracción de ADN
Extracción de ADN diferencial
40

41. 20/08/2010
Cuantificación de ADN
1. AGAROSA + Bromuro de Etidio (Semicuantitativo)
2. ESPECTROFOTOMETRÍA
ADN
3. SONDAS ESPECÍFICAS
4. REAL TIME PCR (FORENSE)
Metodología de Análisis
RFLP + Southern Blot (Minisatélites)
PCR + detección manual o automática
STRs
MONOPLEX
MULTIPLEX
Secuenciación ADN mitocondrial
41

42. 20/08/2010
PCR: reacción de la
polimerasa en cadena
Amplificación enzimática del ADN
REACTIVOS:
H20dd
BUFFER DE REACCIÓN (+MgCl2)
dNTPs
PRIMERS (ADN sintético)
ENZIMA: ADN POLIMERASA
TARGET ADN
UTILIZACIÓN DE CONTROLES POSITIVOS Y NEGATIVOS
BLANCOS DE REACTIVOS
PCR
42

43. 20/08/2010
PCR
PCR
43

44. 20/08/2010
PCR
Análisis de STRs multiplexes
44

45. 20/08/2010
Detección de productos de PCR
multiplex
Asignación de variantes
Ladder
Std. Peso
Molecular
45

46. 20/08/2010
Lectura y escritura de Resultados
LOCUS TITULAR P. ALEG. LOCUS TITULAR P. ALEG.
D3S1358 15 16 Amilogenina X X
16 Y
THO1 7 7 vWA 14 14
9 9 17 18
D21S11 31 31 D8S1179 10 10
32.2 32.2 14 15
D18S51 12 13 TPOX 8 8
14 14 10 10
PENTA-E 7 7 FGA 19 19
11 15 25 25
LOCUS TITULAR P. ALEG.
D5S818 11 10
12 12
D13S317 9 9
11 11
D7S820 8 11
11 12
D16S539 9 9
12 12
CSFIPO 11 11
12 12
PENTA-D 14 12
15 15
Secuenciación del ADNmt
PCR
Purificación del producto de PCR
Reacción de secuencia
Cadenas Liviana y Pesada
Buffer de Reacción
dNPTs / ddNPTS marcados
Primer Forward o Reverse
Polimerasa
Producto de PCR purificado
Purificación de secuencia
Secuenciación en secuenciación automático
46

47. 20/08/2010
Secuenciación ADN mt
Secuenciación ADN mt
47

48. 20/08/2010
Reporte de resultados ADNmt
Reporte de resultados ADNmt
Nucleótidos 051 069 093 114 126 223
editados
A C T C T C
CRS
MUESTRA 1 15997-16401 - - C - - T
MUESTRA 2 15997-16374 G - - - - -
15997-16401 - T - - C -
MUESTRA 3
MUESTRA 4 15997-16401 - - - T C -
48

49. 20/08/2010
Laboratorios de ADN forenses:
Infraestructura y equipamiento
ÁREA COMÚN
ÁREA POST-PCR ÁREA PRE-PCR
Área sucia o caliente Área limpia o fría
Normas de laboratorio (Arg)
ACREDITACIÓN
PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE CALIDAD
CONTROLES DE CALIDAD
PROFICIENCY TESTINGS
INTERNOS
EXTERNOS
49

50. 20/08/2010
STR Internet Database
http://www.cstl.nist.gov/strbase/
International Society for
Forensic Genetics (ISFG)
www.isfg.org
50

51. 20/08/2010
International Society for
Forensic Genetics (ISFG)
Grupo de Habla Hispana y
Portuguesa de la ISFG (GHEP-ISFG)
www.gep-isfg.org
51

52. 20/08/2010
Sociedad Argentina de Genética
Forense (SAGF)
www.sagf.org.ar
52

53. 20/08/2010
Genética Animal.
y vegetal.
53

54. 20/08/2010
a descansar…
54