Articulo bueno en word.en.es

MICROSCOPIA ÓPTICA Davidson y Abramowitz
MICROSCOPIA ÓPTICA
Michael W. Davidson1
y Mortimer Abramowitz2
1Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético de la Universidad del Estado de Florida, 1800 E. Paul Dirac Dr., Tallahassee,
Florida 32306, davidson@magnet.fsu.edu, http://microscopy.fsu.edu
2
Olympus America,Inc., 2 Corporate CenterDr., Melville, Nueva York11747,abramm@olympus.com, http://www.olympus.com
palabras clave: microscopía, contraste de fases,contraste de interferencia diferencial, DIC, luz polarizada,
Hoffman contraste de modulación, fotomicrografía, microscopía de fluorescencia, apertura numérica, cámaras
electrónicas CCD, CMOS sensores activos de píxeles, la microscopía de campo oscuro,Rheinberg iluminación.
Introducción
La última década ha sido testigo de un enorme
crecimiento en la aplicación de la microscopía óptica para
investigaciones micras y de nivel de sub-micras en una
amplia variedad de disciplinas (revisado en las referencias
1-5). El rápido desarrollo de nuevos marcadores
fluorescentes se ha acelerado la expansión de la
microscopía de fluorescencia en aplicaciones de
laboratorio e investigación (6-8). Los avances en la
formación de imágenes y análisis digital han permitido
también a microscopistas para adquirir mediciones
cuantitativas forma rápida y eficiente en muestras que van
a partir de compuestos fotosensibles enjaulados y
superconductores cerámicos sintéticos a microscopía de
fluorescencia en tiempo real de células vivas en su medio
natural (2, 9). La microscopia óptica,con la ayuda de vídeo
digital, también se puede utilizar para obtenerimágenes de
secciones ópticas muy finas,
microscopistas primeros se vieron obstaculizadas por
la aberración óptica, imágenes borrosas,y el pobre diseño
de la lente, que forcejeó hasta el siglo XIX. Aberraciones
fueron parcialmente corregidos por el mediados del siglo
XIX con la introducción de Lister y Amici objetivos
acromáticos que redujeron la aberración cromática y se
criaron aperturas numéricas a alrededor de 0,65 para los
objetivos secos y hasta 1,25 para los objetivos de
inmersión homogéneos (13). En 1886, la obra de Ernst
Abbe con Carl Zeiss condujo a la producción de objetivos
basados apocromática por primera vez en los principios
ópticos de sonido y diseño de la lente (14). Estos objetivos
avanzadas proporcionan imágenes con reducción de la
aberración esférica y libre de distorsiones de color
(aberración cromática) a altas aperturas numéricas.
Varios años después, en 1893, el profesor August
Köhler reportó un método de iluminación, que desarrolló
para optimizar fotomicrografía, permitiendo
microscopistas a aprovechar al máximo el poder de
resolución de los objetivos de Abbe. La última década del
siglo XIX fue testigo de las innovaciones en la
microscopía óptica, incluyendo microscopios
metalográficos, photolenses anastigmática,
microscopios binoculares con prismas de imagen erigir, y
el primer microscopio estereoscópico (14).
A principios del siglo XX, los fabricantes de
microscopios comenzaron parfocalizing objetivos, lo que
permite que la imagen permanezca en el foco cuando el
microscopista intercambió objetivos de la boquilla giratoria.
En 1824, Zeiss introdujo un metalógrafo de estilo LeChatelier
con óptica al infinito con corrección, pero este método de
corrección no vería la aplicación generalizada por otros 60
años.
Poco antes de la Segunda Guerra Mundial, Zeiss creó
varios microscopios de contraste de fase de prototipo
basado en principios ópticos avanzados de Frits Zernike.
Varios años más tarde se modificaron los mismos
microscopios para producir la primera cinematografía de
lapso de tiempo de la división celular fotografiado con
óptica de contraste de fase (14). Esta técnica de mejora del
contraste no llegó a seruniversalmente reconocido hasta la
década de 1950 y sigue siendo un método de elección para
muchos biólogos celulares hoy en día.
El físico Georges Nomarski introducido mejoras en el
diseño de prisma de Wollaston para otro potente teoría
microscopía generadora de contraste en 1955
(15) . Esta técnica se conoce comúnmente como científicos
Nomarski interferencia o contraste de interferencia
diferencialmicroscopía (DIC) y,junto con contrastede fases,
ha permitido explorar muchos nuevos campos de la biología
utilizando células vivas o tejidos sin teñir. Robert Hoffman
(16) introdujo otro método de aumentar el contraste en
material vivo mediante el aprovechamiento de los gradientes
de fase cerca de las membranas celulares. Esta técnica se
denomina ahora Hoffman Modulation Contrast, y está
disponible como equipamiento opcionalen la mayoría de los
microscopios modernos.
La mayoría de los microscopios fabricados en todo el
mundo había fijado longitudes de tubo mecánicos (que van
desde 160 a 210 milímetros) hasta finales de 1980, cuando
los fabricantes migraron en gran parte a la óptica al
infinito-corregido. trayectorias de los rayos a través de
tanto la longitud del tubo y el infinito con corrección de
microscopios finitos se ilustran en la figura

1. La porción superiorde la figura contiene los elementos
ópticos y trazas de rayos que definen el tren óptico esencial
1

de un microscopio de longitud del tubo finito convencional
(17). Un objeto (O) de la altura h se está formando la
imagen en la retina del ojo en O”. La lente del objetivo
(Ltransmisión exterior) Proyecta una imagen real e invertida
de O magnificada con el tamaño O' en el plano de imagen
intermedio del microscopio. Esto ocurre en la membrana
ocular, a la distancia fb fijo + z' detrás delobjetivo. En este
diagrama, fb representa la longitud focal posterior del
objetivo y z' es la longitud del tubo óptico delmicroscopio.
La imagen intermedia aérea en O' se magnifica aún más
por el ocular del microscopio (Ley) Y produce una imagen
erecta del objeto en O”en la retina, que aparece invertida a
la microscopista. El factor de ampliación del objeto se
calcula considerando la distancia (a) entre el objeto (O) y
el objetivo (Ltransmisión exterior), Y la longitud focal delante
de la lente objetivo (f). El objeto se coloca a corta distancia
(z) fuera de la longitud focal frontal del objetivo (f), de
manera que z + f = a. La imagen intermedia del objeto, O
'se encuentra a una distancia b, que es igual a la longitud
de espalda focal del objetivo (fb) más (z'), la longitud del
tubo óptico del microscopio. Magnificación del objeto en
el plano de imagen intermedia es igual a h'. La altura de la
imagen en esta posición se obtiene multiplicando la
longitud del tubo microscopio (b) por la altura del objeto
(h), y dividiendo esta por la distancia del objeto desde el
objetivo: h'= (HXB) / a. De este argumento, podemos
concluir que el aumento lateral o transversal del objetivo
es igual a un factor de b / a (también igual a f / z y z '/ fb),
la distancia focal posterior del objetivo dividido por la
distancia del objeto desde el objetivo. La imagen en el
plano intermedio (h') se magnifica adicionalmente por un
factor de 25 centímetros (llamada la distancia de cerca al
ojo) dividida por la longitud focal del ocular. Por lo tanto,
el aumento total del microscopio es igual a la ampliación
por los tiempos objetivos que del ocular. La imagen visual
(virtual) aparece para el observador como si se tratara de
10 pulgadas de distancia del ojo.
La mayoría de los objetivos se corrigen para trabajar
dentro de un estrecho rango de distancias de imagen, y
muchos están diseñados para funcionar sistemas ópticos
sólo en concreto corregidos con oculares juego. La
ampliación inscrito en el cañón objetivo se define para la
longitud del tubo del microscopio para la que fue diseñado
el objetivo.
La parte inferiorde la figura 1ilustra eltren óptico usando
trazas de rayos de un sistema de microscopio infinito-
corregido.Los componentesde este sistema estánetiquetados
de manera similar al sistema de longitud finita de tubo para
facilitar la comparación.Aquí,el aumento del objetivo es la
relación h '/ h, que se determina por la lente del tubo (Ltb).
Tenga en cuenta elespacio infinito quesedefine porlos rayos
de luz paralelos en cada acimut entre elobjetivo y la lente de
tubo. Este es el espacio utilizado por los fabricantes de
microscopios para agregar accesorios como iluminadores
verticales,DIC
Figura 1. trenes ópticos de los sistemas de microscopio infinito-
corregido finito-tubo y. (Superior) Ray traza del tren óptico que
representa un microscopio longitud finita de tubo teórico. El objeto
(O) es una distancia (a) desde el objetivo (LOB) y proyecta una
imagen intermedia (O ') en la longitud del tubo finito (b), que está
reforzado por el ocular (Ley) y después se proyecta sobre la retina en
O ''. (Baja) Ray traza del tren óptico que representa un sistema de
microscopio infinito-corregido teórico.
prismas, polarizadores, placas de retardo, etc., con diseños
mucho más simple y con poca distorsión de la imagen
(18). El aumento del objetivo en el sistema infinito
corregida es igual a la longitud focal de la lente del tubo
dividido por la distancia focal del objetivo.
Fundamentos de Formaciónde la
imagen
En el microscopio óptico, cuando la luz de la lámpara
microscopio pasa a través delcondensadory luego a través
de la muestra (suponiendo que el espécimen es un
absorbente de la luz de la muestra), parte de la luz pasa
tanto alrededor ya través de la muestra no perturbadas en
su camino. Dicha luz se llama la luz directa o luz no
desviada. La luz de fondo (a menudo llamada la
envolvente) que pasa alrededor de la muestra es también
la luz no desviada.
Algunos de la luz que pasa a través del espécimen se
desvía cuando se encuentra con partes de la muestra. Tal
luz desviada (como se puede aprender posteriormente,
llamada luz difractada) está dictada longitud de onda de la
mitad o 180

grados fuera de la etapa (más comúnmente, fuera de fase)
con la luz directa que ha pasado a través de no desviada.
La media longitud de onda fuera de fase, causada por el
espécimen mismo, permite que esta luz para causar
interferencia destructiva con la luz directa cuando ambos
llegan al plano de la imagen intermedia situada en el
diafragma fijo del ocular. El lente del ojo del ocular
aumenta aún más esta imagen que finalmente se proyecta
sobre la retina, el plano de la película de una cámara, o la
superficie de un chip de ordenadorsensible a la luz.
Lo que ha sucedido es que la luz directa o desviada es
proyectada por el objetivo y se extendió uniformemente a
través de todo el plano de la imagen en el diafragma del
ocular.La luz difractada porla muestra se llevó a centrarse en
varios lugares localizados en el mismo plano de la imagen,
donde la luz difractada provoca interferencia destructiva y
reduce la intensidad que resulta en más o menos zonas
oscuras. Estos patrones de luz y oscuridad son lo que
reconocemos como una imagen de la muestra. Debido a que
nuestros ojos son sensibles a las variaciones en el brillo, la
imagen se convierte en una reconstrucción más o menos fiel
de la muestra original.
Para ayudar a entender los principios básicos, se sugiere
que los lectorestratan elsiguiente ejercicio y eluso como una
muestra de un objeto de estructura conocida, como por
ejemplo un micrómetro de platina o de rejilla similar de líneas
oscuras muy próximas entre sí. Para continuar, colocar la
rejilla finamente pronunciadosobre la platina delmicroscopio
y lo pongo en primer enfoque utilizando un 10x y luego el
objetivo de 40x(18). Retire el oculary,en su lugar,inserte un
telescopio fase de modo se puede observar el plano focal
posterior del objetivo. Si el diafragma de apertura del
condensadorestácerradala mayorparte delcamino,un punto
central de blanco brillante de luz aparecerá en la parte
posterior del objetivo, que es la imagen del diafragma de
apertura.A la derecha e izquierda delpunto central,una serie
de espectros (también imágenes del diafragma de apertura)
estará presente, cada color azul en la parte más cercana al
punto central y de color rojo en la parte de la más lejana
espectrodesde elpuntobrillante central(como se ilustra en la
Figura 2). La intensidad de estosespectrosde colordisminuye
de acuerdo con lo lejos que el espectro es desde el punto
central(17,18).
Esos espectros más cerca de la periferia del objetivo son
más débiles que aquellos más cerca del punto central. Los
espectros de difracción ilustranen la Figura 2 utilizando tres
diferentes aumentos. En la Figura 2 (b), el patrón de
difracción visible en el plano focal posterior del objetivo de
10X contiene dos espectros de difracción. Si la rejilla se
elimina de la etapa, como se ilustra en la Figura 2 (a), estos
espectros desaparecen y sólo la imagen central de la
membrana apertura permanece. Si se vuelve a insertar la
rejilla, los espectros vuelven a aparecer una vez más. Tenga
en cuenta que los espacios entre los espectros de colores se
ven oscuras.Sólo unúnicopardeespectrossepuedeobservar
si la rejilla se examinó con el objetivo de 10x. En este caso,
un punto de difracción parece

la izquierda y uno aparece a la derecha de la abertura central
de apertura.Sila retícula de líneas se examina con unobjetivo
de 40x (como se muestra en la Figura 2 (c)), varios espectros
de difracción aparecen a la izquierda y derecha de la abertura
central. Cuando la ampliación se aumenta a 60x (y
suponiendo que tiene una abertura superior numérico que el
objetivo de 40x), espectrosadicional(Figura 2 (d)) aparecerá
a la derecha y la izquierda que son visiblescon elobjetivode
40x en su lugar.
Debido a que los espectros de colores desaparecen
cuando se retira la rejilla, se puede suponer que es el
espécimen mismo que está afectando a la luz que pasa a
través, produciendo de este modo el espectro de color.
Además, si el diafragma de apertura está cerrada hacia
abajo, observaremos que los objetivos de mayor apertura
numérica comprender más de estos espectros de color de
hacer objetivos de baja apertura numérica. La importancia
crucial de estas dos afirmaciones para la comprensión de
la formación de imágenes se pondrá de manifiesto en los
párrafos siguientes.
Figura 2. espectros dedifracción visto en el plano focal posterior
del objetivo a través de un telescopio de enfoque cuando la
imagen de una retícula de líneas estrechamente espaciadas. (A)
Imagen de la diafragma de apertura del condensador con una
etapa de vacío. (B) dos espectros de difracción a partir de un
objetivo de 10x cuando una línea finamente gobernado rejilla se
coloca sobrela platinadel microscopio. (C) Difracción espectros
de la retícula de líneas a partir de un objetivo de 40x. (D) los
espectros de difracción de la retícula de líneas a partir de un
objetivo 60x.
El punto central de la luz (imagen del diafragma de
apertura del condensador) representa la luz directa o
desviada pasa a través de la muestra o alrededor de la
muestra no perturbadas (ilustrado en la Figura 3 (b)). Se
llama el orden 0 o cero. Las imágenes más débiles del
diafragma de apertura a cada lado de la orden cero se
denominan el primero, segundo, tercero, cuarto, etc.
órdenes respectivamente, como se representa por el
diagrama de difracción simulada en la Figura 3 (a) que se
observaría en la parte trasera plano focal de un objetivo de
40x. Todas las órdenes capturados representan, en este
caso, el patrón de difracción de la retícula de líneas como
se ve en el plano focal posterior del objetivo (18).
Las imágenes más débil difractados del diafragma de
apertura son causados por la luz desviada o difractada, se
extienden en forma de abanico,en cada una de las aberturas
de la retícula de líneas (Figura 3 (b)). Las longitudesde onda
azules se difractan en un ángulo menorque las longitudesde
onda verdes,que sondifractados en un ángulo menorque las
longitudes de onda roja.
3

En el plano focal posterior del objetivo, las longitudes
de onda azules de cada rendija interfieren
constructivamente para producir el área azul de la imagen
difractada de cada espectro o la orden; de manera similar
para las áreas roja y verde (Figura 3 (a)). Cuando las
longitudes de onda difractados son media onda fuera de
paso para cada uno de estos colores,las ondas destructiva
interfieren. Por tanto,las áreas oscuras entre los espectros
o pedidos. En la posición de la orden cero, todas las
longitudes de onda de cada rendija añaden constructiva.
Esto produce la luz blanca brillante que se ve como el de
orden cero en el centro del plano focal posterior del
objetivo (Figuras 2, 3 y 4).
Figura 3. espectros de difracción generado en el plano focal
posterior del objetivo por la luz no desviada y difractada. (A)
espectros visible a través de un telescopio de enfoque en el plano
focal trasero de un objetivo de 40x. (B) Diagrama esquemático
de la luz tanto difractada y desviada por una retícula de líneas en
la platinadel microscopio.
Cuanto más cerca de la separación de una retícula de
líneas, menos los espectros que será capturado por un
objetivo dado,como se ilustra en la Figura 4 (ac). El patrón
de difracción ilustrada en la figura 4 (a) fue capturado por
un 40x de imagen objetivo la porción inferior de la retícula
de líneas en la Figura 4 (b), donde las ranuras están más
juntas (17, 18). En la Figura 4 (c), el objetivo se centra en
la porción superior de la retícula de líneas (Figura 4 (b)),
donde las ranuras están más separadas, y más espectros
son capturados por el objetivo. La luz directa y la luz de
los órdenes difractados continúan en,estarenfocado por el
objetivo, para el plano de imagen intermedio en el
diafragma fijo del ocular. Aquílos rayos de luz difractados
directos e interfieren y por lo tanto se reconstituyen en la
imagen real, invertida que es visto por la lente del ojo del
ocular y amplía aún más. Esto se ilustra en la Figura 4 (dg)
con dos tipos de rejillas de difracción. La rejilla cuadrada
ilustra en la Figura 4 (d) representa la imagen ortoscópica
de la rejilla (la imagen muestra usual IE) como se ve a
través de la abertura total del objetivo. El patrón de
difracción derivado de esta rejilla se muestra como una
imagen conoscópica que sería visto
Figura 4. Los patrones de difracción generados por rendijas
estrechas y anchas y por las redes complejas. (A) Imagen
conoscópica de la rejilla visto en el plano focal posterior del objetivo
cuando se centra en el patrón de ranura ancha en (b). (B) imagen
ortoscópica de la rejilla con una mayor anchura de la ranura en la
parte superior y menor anchura en la parte inferior. imagen (c)
conoscópica de la parte de anchura estrecha de la rejilla (parte
inferior de (b)). (D) y (f) imágenes ortoscópica de líneas de rejilla
dispuestas en un patrón cuadrado (d) y un modelo hexagonal (f). (E)
y (g) imágenes conoscópica de patrones en (d) y (f), respectivamente.
en el plano focal posterior del objetivo (Figura 4 (e). Del
mismo modo, la imagen ortoscópica de una rejilla
hexagonal dispuesto (Figura 4 (f)) produce una
correspondiente imagen conoscópica dispuestos
hexagonalmente de los patrones de primeros difracción
orden (Figura 4 (g) ).
especímenes de microscopio se pueden considerar
como rejillas de complejos con los detalles y las aberturas
de diversos tamaños. Este concepto de formación de la
imagen se ha desarrollado en gran medida por Ernst Abbe,
el famoso alemán microscopista y la óptica teórico del
siglo 19. De acuerdo con el abate (sus teorías son
ampliamente aceptadas en la actualidad), los detalles de un
espécimen se resolverán si el objetivo capta la orden 0 de
la luz y por lo menos la primera orden (o cualquiera de los
dos órdenes,para el caso).Cuanto mayor sea el número de
órdenes difractados que ser admitido en el objetivo, el más
exactitud la imagen representará el objeto original (2, 14,
17, 18).
Además, si un medio de mayor índice de refracción que
el aire (tales como aceite de inmersión)se utiliza en elespacio
entre la lente frontaldelobjetivo y la parte superiorde la hoja
de la cubierta (como se muestra en la Figura 5 (a)), el ángulo
de los órdenes difractados se reduce y se comprimen los fans
de la luz difractada. Como resultado de ello, un objetivo de
inmersión en aceite puede capturarórdenes más difractadosy
produciruna mejorresolución que un objetivoseco (Figura 5
(b)). Además,dado que la luz azul es difractada en un ángulo
menor que la luz verde o luz roja, una lente de una abertura
dada puede capturarmás órdenes deluzcuandolas longitudes

de onda están en la región azul del espectro de luz visible.
Estos dosprincipiosexplican
4

la ecuación clásica de Rayleigh a menudo citado para la
resolución de (2, 18-20):
d = 1.22 (l / 2NA) (1)
Donde d es el espacio entre dos partículas adyacentes (aún
permitiendo que las partículas a ser percibidos como algo
separado), L es la longitud de onda de la iluminación, y
NA es la apertura numérica del objetivo.
del objetivo puede tener un efecto significativo sobre la
imagen eventualproducida (18).Para pequeños detalles enun
espécimen (en lugarde una rejilla),el objetivo proyectala luz
directa y difractada sobre el plano de imagen del diafragma
ocularen forma de discos dedifracción pequeños y circulares
conocidos como discos deAiry (ilustrado enla Figura 6).Los
objetivos de alta apertura numérica capturar más de las
órdenes difractados y producen discos de tamaño más
pequeñoquehacerobjetivos de baja apertura numérica.En la
Figura 6, el tamaño del disco Airy se muestra de manera
constante la disminución de la Figura 6 (a)
Figura 5. Efecto de la formación de imágenes de índice de refracción
medio en órdenes difractados capturadas por el objetivo. (A) Imagen
conoscópica de espectros de difracción de último plano focal objetivo
cuando el aire es el medio entrela hojade la cubierta y la lente delantera
del objetivo. (B) los espectros de difracción cuando se utiliza aceite de
inmersión de índice de refracción similaral vidrio en el espacioentre la
hoja de la cubierta y la lente delantera del objetivo.
Cuanto mayor sea el número de órdenes difractados
mayores admitidos en el objetivo, el más pequeño de los
detalles de la muestra que puede ser claramente separados
(resuelto). Por lo tanto el valor de la utilización de alta
apertura numérica de dichos especímenes. Del mismo
modo, más corta es la longitud de onda de la luz visible
usada,mejor es la resolución. Estas ideas explican por qué
de alta apertura numérica, lentes apocromática pueden
separar extremadamente pequeños detalles en azul claro.
La colocación de una máscara opaca en la parte trasera
de los bloques de objetivos, las órdenes difractados más
externa. Esta bien reduce la resolución de las líneas de
rejilla, o cualquier otro detalles del objeto, o destruye la
resolución del todo de modo que el espécimen no es
visible. De ahí la cautela habitual no cerrar el diafragma
de apertura del condensador por debajo de la 2/3 a 9/10
sugerido de apertura del objetivo.
El incumplimiento del objetivo de comprender
cualquiera de los resultados órdenes difractados en una
imagen sin resolver. En una muestra con detalles muy
minuciosos, los seguidores de difracción se extienden en
un ángulo muy grande, lo que requiere una alta apertura
numérica objetiva para capturarlos. Del mismo modo,
debido a que los ventiladores de difracción se comprimen
en aceite de inmersión o en agua, objetivos diseñados para
tal uso puede darmejor resolución que los objetivos secos.
Si las órdenes difractados alternos se bloquean (aún
suponiendoquela rejilla como nuestro espécimen),aparecerá
duplicado el número de líneas en la rejilla (resolución
espuria). La advertencia importante es que las acciones
introducidas en la parte trasera

La Figura 6. Disco de Airy y resolución. (Ac) Airy tamaño del
disco y perfilde intensidad relacionada (función de dispersión de
punto) como relacionada a la aperturanumérica objetivo, lo que
disminuye a partir de (a) a (c) a medida que aumenta apertura
numérica. (E) Dos discos de Airy tan juntos que sus puntos
centrales se superponen. discos (d) Airy en el límite de
resolución.
5

a través de la figura 6 (c). Los tamaños de disco más
grandes en las Figuras 6 (a) y (b) son producidos por
objetivos con menor apertura numérica, mientras que el
disco de Airy muy agudo en la Figura 6 (c) es producido
por un objetivo de muy alta apertura numérica (2, 18) .
La imagen resultante a nivel ocular diafragma es en
realidad un mosaico de discos de Airy que se perciben
como regiones claras y oscuras de la muestra. Cuando dos
discos son tan juntos que sus puntos negros centrales se
superponen considerablemente, los dos detalles
representados por estos discos superpuestos no se
resuelven o separados y de este modo aparecen como una
(ilustrado en la Figura 6 (d)). Los discos de Airy
mostrados en la Figura 6 (e) son sólo lo suficientemente
separados para ser resueltos.
El principio básico para ser recordado es que la
combinación de la luz directa y difractada (o la
manipulación de la luz directa o difractada) es
críticamente importante en la formación de la imagen. Los
lugares clave para dicha manipulación son el plano focal
posterior del objetivo y el plano focal frontal de la lente
condensadora. Este principio es fundamental para la
mayoría de los métodos de mejora de contraste en
microscopía óptica (18, y ver la sección sobre Técnicas
Mejora del contraste); es de particular importancia en la
alta ampliación de pequeños detalles cerrar en tamaño a la
longitud de onda de la luz. Abbe fue pionera en el
desarrollo de estos conceptos para explicar la formación
de imágenes de muestras absorbente de luz o de amplitud
(2, 18-20).
imperfecciones en las superficies de vidrio del condensador.
El tamaño de la abertura del diafragma de apertura del
condensador,junto conla abertura delobjetivo,determina la
apertura numérica dado cuenta del sistema de microscopio.
Como se abre eldiafragma condensador,la apertura numérica
de trabajo delmicroscopio aumenta,resultando enuna mayor
transmitancia de luz y poder de resolución. rayos de luz
paralelos que pasan a través e iluminan la muestra son
presentadas a centrarse en el plano focal posterior del
objetivo, donde la imagen de la variable de diafragma de
apertura delcondensadory la fuente de luz se observan en el
enfoque de forma simultánea.
La iluminación Köhler
iluminación adecuada de la muestra es decisiva para
lograr imágenes de alta calidad en la microscopía y
microfotografía crítico. Un procedimiento avanzado para
la iluminación de microscopio se introdujo por primera
vez en 1893 por August Köhler, de la empresa Carl Zeiss,
como un método para proporcionar una iluminación
óptima de la muestra. Todos los fabricantes de
microscopios de laboratorio modernos recomiendan esta
técnica, ya que produce una iluminación ejemplar que es
uniformemente brillante y libre de deslumbramiento, lo
que permite al usuario realizar el pleno potencial del
microscopio.
La mayoría de los microscopios modernos están
diseñados para que la lente colector y otros componentes
ópticos integrado en la base se proyectar una imagen
ampliada y enfocada del filamento de la lámpara sobre el
plano del diafragma de apertura de un condensador de
platina inferior correctamente posicionado. Cerrando o
abriendo el diafragma condensador controla el ángulo de
los rayos de luz emergentes del condensadory que llegan
a la muestra de todos los acimutes. Debido a que la fuente
de luz no se centra en el nivel de la muestra, la iluminación
a nivel espécimen es esencialmente grainless y ampliado,
y no sufre deterioro del polvo y
La Figura 7. senderos de luz en la iluminación Köhler. Las
trayectorias de los rayos de iluminación se ilustran en el lado
izquierdo y las trayectorias de los rayos de formación de
imágenes a la derecha. La luz emitida desde la lámpara pasa a
través de una lente colector y luego a través del diafragma de
campo. El diafragma de aperturaen el condensador determina el
tamaño y la forma del cono de iluminación en el plano de la
muestra. Después depasar a través de la muestra, la luz se enfoca
en el plano focal posterior del objetivo y luego procede a y se
magnifica por el ocular antes de pasar en el ojo.
vías de luzilustrados en la Figura 7sonesquemáticamente
desenvainadapara representarvías separadas tomadasporlos
rayos de luz de muestras-iluminando y los rayos de luz que
forma la imagen
(17) . Esto no es una verdadera representación de cualquier
segregación real de estas vías, sino una representación
esquemática presentado con fines de visualización y
discusión. El diagrama de la izquierda en la Figura 7
demuestra que las trayectorias de los rayos de luz de

iluminación producen una imagen enfocada delfilamento de
la lámpara en el plano
6

del diafragma condensadorde platina inferior de apertura,
el plano focal posterior del objetivo y el punto de mira
(también llamado el disco Ramsden) por encima del
ocular. Estas áreas de enfoque común se refieren a menudo
como planos conjugados,un principio que es fundamental
para entender el concepto de iluminación Köhler (2, 17-
21). Por definición, un objeto que está enfocado en un
plano es también un foco en otros planos conjugados de
que la trayectoria de la luz. En cada vía de luz (formación
de la imagen y la iluminación), hay cuatro planos
separados que juntos componen un conjunto plano
conjugado.
planos conjugados en la trayectoria de los rayos de luz
que iluminan en iluminación Köhler (diagrama de la
izquierda en la figura
7) incluir el filamento de la lámpara, el diafragma de
apertura del condensador (en el plano focal frontal del
condensador), el plano focal posterior del objetivo y el
punto de mira del ocular. El punto de mira está situado a
aproximadamente una pulgada y media (un centímetro)
por encima de la lente superior del ocular, en el punto
donde el observador coloca el frente del ojo durante la
observación.
Asimismo,los planos conjugados en la trayectoria de la
luz de formación de imágenes en iluminación Köhler
(diagrama de la derecha en la Figura 7) incluyen el
diafragma de campo,el espécimen enfocadas,elplano de
imagen intermedio (es decir,el plano deldiafragma fijo del
ocular)y la retina del ojo o el plano de la película de la
cámara. La presencia de planosfocalesconjugados es a
menudo útilen la solución de problemas de un microscopio
de contaminarel polvo,fibras,y las imperfecciones en los
elementos ópticos.Cuandotalesartefactosson en un
enfoque nítido,se deduce que deben residiren o cerca de
una superficie que es parte delconjuntode la formación de
imágenes de planosconjugados.Los miembros de este
grupo incluyen elelemento de vidrio en elpuerto luz del
microscopio,la muestra,y la retícula (si los hay)en el
ocular.Alternativamente, siestoscontaminantes estánfuera
de foco,a continuación,se producen cerca delaparato de
alumbramiento de los elementos que comparten planos
conjugados.Sospechososen esta categoría sonla lente
condensadorsuperior(donde elpolvo y la suciedad se
acumulan con frecuencia),elelemento de lente ocular
expuesta (contaminantesde las pestañas),y la lente
delantera delobjetivo (generalmente manchasde huellas
dactilares).
En iluminación Köhler, la luz emitida por el filamento
de la lámpara de tungsteno-haluro pasa primero a través
de una lente colectora situada cerca de la carcasa de la
lámpara, y luego a través de una lente de campo que se
encuentra cerca del diafragma de campo. Un filtro de
vidrio sinterizado o esmerilado a menudo se coloca entre
la lámpara y la lente colector para difundir la luz y
garantizar una intensidad uniforme de iluminación. En
este caso,la imagen del filamento de la lámpara se
enfoca sobre el plano focal frontal del condensador
mientras que el vidrio difusor se retira temporalmente de
la trayectoria de la luz. La longitud focal de la lente
colector debe correspondercuidadosamente a las
dimensiones del filamento de la lámpara para asegurar
que una imagen de filamentos del tamaño apropiado se
proyecta en el condensador

abertura. Para un correcto iluminación Köhler, la imagen
del filamento debe llenar completamente la apertura del
condensador.
La lente de campo es responsable de traer la imagen del
filamento en el foco en elplano deldiafragma de apertura del
condensador subetapa. Un primer espejo de superficie
(colocada en un ángulo de 45 grados con respecto a la
trayectoria de la luz) refleja luz enfocada dejando la lente de
campo a través deldiafragma de campo y en el condensador
de platina inferior. La apertura deldiafragma de campo sirve
como una fuente de luz virtual para el microscopio, y su
imagen es enfocada por el condensador (levantada o bajada)
en el plano de la muestra. diseños ópticos para el arreglo de
estos elementos pueden variar según el fabricante
microscopio, pero el diafragma de campo deben ser
posicionado a una distancia suficiente de la lente de campo
para eliminar el polvo y la lente imperfecciones de ser
reflejado en el plano de la muestra.
El diafragma de campo en la base del microscopio
sólo controla la anchura del haz de rayos de luz que
llegan al condensadorde que no afecta a la resolución
óptica, apertura numérica, o la intensidad de la
iluminación. El ajuste correcto de la diafragma de campo
(es decir, centrado mediante el ajuste de la altura del
condensadory centrada en la trayectoria óptica, a
continuación, se abrió con el fin de se encuentran justo
fuera del campo de visión) es importante para prevenir el
deslumbramiento, que puede reducir el contraste en la
imagen observada.La eliminación de la luz no deseada es
particularmente importante cuando se trata de muestras
de imagen con inherentemente bajo contraste.Cuando el
diafragma de campo se abre demasiado lejos, dispersa luz
procedente de la muestra y la luz reflejada en ángulos
oblicuos de las superficies ópticas pueden actuar para
degradar la calidad de imagen.
El condensador de platina inferior está típicamente
montado directamente debajo de la platina del microscopio
en un soporte que se puede subir o bajar de forma
independiente de la etapa. Control del tamaño de abertura
de la abertura del diafragma se produce ya sea con un
brazo oscilante, una palanca, o mediante la rotación de un
collar en la carcasa del condensador.El aspecto más crítico
de lograr adecuada iluminación Köhler es correcto ajuste
de la condensador de platina inferior. desalineación
condensador y un diafragma de apertura del condensador
mal ajustada son las principales fuentes de degradación de
la imagen y la mala calidad fotomicrografía (19).
Cuando se ajusta adecuadamente, la luz procedente del
condensadorse llenará elplano focalposteriordelobjetivo y
proyectarun hazde luz en el campo de visión. El diafragma
de apertura del condensador es responsable de controlar el
ángulo delcono de luzde iluminación y, en consecuencia,la
apertura numérica de trabajo delcondensador.Es importante
tener en cuenta, con respecto al tamaño y la forma de conos
de luz condensador, que la reducción del tamaño del
diafragma de campo sólo sirve para disminuirligeramente el
tamaño de las porciones inferiores delcono de luz.El ángulo
y la apertura numérica de
7

el cono de luz permanece esencialmente sin cambios con
reducción en el tamaño del diafragma de campo (21).
Intensidad de iluminación no debe sercontrolado a través
de la apertura y el cierre de la abertura del diafragma
condensador,o desplazando el condensadorarriba y abajo
o axialmente con respecto al centro óptico del
microscopio. Sólo debe ser controlada mediante el uso de
filtros de densidad neutra colocados en la trayectoria de la
luz o mediante la reducción de la tensión a la lámpara
(aunque no se recomienda generalmente este último,
especialmente para fotomicrografía). Para garantizar el
máximo rendimiento de la lámpara de tungsteno-haluro,
consulte el manual de instrumentos del fabricante para
determinar la tensión de la lámpara óptima (generalmente
5-10 voltios) y el uso de esa configuración. Adición o
eliminación de filtros de densidad neutra entonces puede
controlar fácilmente el brillo de la iluminación sin afectar
a la temperatura de color.
El tamaño del condensadorde platina inferior abertura
abertura del diafragma no sólo debe coincidir con la
abertura numérica deseada, sino también la calidad de la
imagen resultante debe ser considerado. En general, el
diafragma debe establecerse en una posición que permita
02/03 a 09/10 (de 60 a 90 por ciento) de todo el tamaño del
disco de luz (visible en el plano focal posteriordel objetivo
después de la eliminación del ocular o con una lente de
Bertrand). Estos valores pueden variar con los extremos en
contraste espécimen.
El diafragma de apertura del condensador debe
ajustarse a un tamaño de abertura que proporcionará un
compromiso de la resolución y el contraste que depende,
en gran medida, de las características de absorción, la
difracción y refracción de la muestra. Este ajuste debe
llevarse a cabo sin sobrecargar la imagen con artefactos
que oscurecen detalle y el presente de mejora errónea de
contraste. La cantidad de detalles de la imagen y el
contraste necesario para producir la mejor fotomicrografía
depende también de índice de refracción, características
ópticas,y otros parámetros espécimen-dependientes.
Cuando el diafragma de apertura está cerrado
erróneamente demasiado lejos, artefactos de difracción
resultante causan franjas visibles, Franja, y / o la formación
de patrones en las microfotografías. Otros problemas, tales
como los fenómenos de refracción,también pueden producir
estructuras aparentes en la imagen que no son reales (21).
Alternativamente,la apertura de la apertura delcondensador
demasiado ancha provoca reflejos no deseados y dispersión
de la luz de la muestra y las superficies ópticas dentro del
microscopio, que conduce a una pérdida significativa de
contraste y el lavado de detalles de la imagen. El ajuste
correcto variará de muestra a la muestra, y el microscopista
experimentado pronto aprenderá a ajustar con precisión el
diafragma de apertura del condensador (y apertura numérica
del sistema) mediante la observación de la imagen sin
necesidad de tener que ver el diafragma en el plano focal
posteriorde la objetivo.De hecho,
sistema de microscopio para optimizar la calidad de
imagen es el paso más importante en la microfotografía.
El sistema de iluminación del microscopio, cuando se
ajusta por adecuada iluminación Köhler, debe satisfacer
varios requisitos.El área iluminada del plano de la muestra
debe no más grande que el campo de visión para cualquier
combinación objetivo / ocular dado. También, la luz debe
ser de intensidad uniforme y la apertura numérica puede
variar de un máximo (igual a la del objetivo) a un valor
menor que dependerá de las características ópticas de la
muestra. La Tabla 1 contiene una lista de aperturas
numéricas objetivas frente al campo de visión de diámetro
(para un ocular de número de campo 22 sin lente del tubo
presente - ver la discusión sobre el número de campo) para
cada objetivo, que van desde muy baja a muy alta
aumentos.
Muchos microscopios están equipados con
condensadores substage especializados que tienen una lente
superiorabatible hacia afuera,que pueden serretirados de la
trayectoria ópticapara usocon un menor
tabla 1 Viewfield diámetros (FN 22)
(SWF 10x Ocular)
Objetivo Diámetro
Aumento (Mm)
1 / 2x 44.0
1x 22.0
2x 11.0
4x 5.5
10x 2.2
20x 1.1
40x 0.55
50x 0.44
60x 0.37
100x 0.22
150x 0.15
250x 0,088
una Fuente: Nikon
objetivos de potencia (2x través 5x). Esta acción cambia el
rendimiento de los componentes restantes de la trayectoria
de la luz, y algún tipo de ajuste es necesario para lograr las
mejores condiciones de iluminación. El diafragma de
campo ya no se puede utilizar para la alineación y el
centrado del condensador subetapa y ahora es ineficaz en
la limitación del área de la muestra bajo iluminación.
Además, gran parte de la reflejos no deseados una vez
eliminado por el diafragma de campo se reduce porque la
lente superiordel condensadorproduce un cono de luz que
tiene una apertura numérica mucho menor, lo que permite
los rayos de luz pasen a través de la muestra en ángulo
mucho más bajos. , las condiciones ópticas más
importantes para

La iluminación Köhler ya no se aplican.
Para objetivos de baja potencia (2xa 5x), la alineación de
los componentesópticosdelmicroscopio y elestablecimiento
de condicionesde iluminación Köhler siempre debe llevarse
a cabo en un (10x) mayoraumento antesde retirarla lente de
condensador extraíble para el trabajo a menor (5x y por
debajo ) aumentos. La altura del condensador no debe
entonces ser cambiado. rendimiento del condensador se
cambia radicalmente cuando la lente swing-out se retira (18,
21). La imagen del filamento de la lámpara ya no se forma en
el diafragma de apertura, que deja de controlar la abertura
numérica del condensador y el sistema de iluminación. De
hecho, el diafragma de apertura se debe abrir por completo
para evitarelviñeteado,undesvanecimiento gradualde la luz
en los bordes de la viewfield.
El ajuste de contraste en bajo microscopía de aumento
se consigue entonces mediante el ajuste del diafragma de
campo (18, 19, 21). Cuando el diafragma de campo está
muy abierta (mayor que 80 por ciento), los detalles de
muestra son lavados y una cantidad significativa de
dispersión y el deslumbramiento está presente. Cerrando
el diafragma de campo a una posición entre el 50 y el 80
por ciento va a dar el mejor compromiso en contraste
espécimen y profundidad de campo. Este ajuste es ahora
visible en el plano focal posterior del objetivo cuando el
ocular se quita o una lente de Bertrand se inserta en el tubo
de ojo. Objetivos diseñados para bajos aumentos son
significativamente más simple en el diseño que sus
contrapartes de mayor aumento. Esto es debido a los
ángulos más pequeños de iluminar conos de luz
producidos por condensadores de bajo aumento, que
requieren objetivos de baja apertura numérica.
retículas de medición, que deben estar en un enfoque
nítido y, simultáneamente, superpuesta a la imagen de
muestras en,se puedeninsertarencualquiera devarios planos
conjugadosenla ruta de formaciónde imágenes.Las retículas
ocularmás común (ocular)de medición y fotomicrografía se
colocan en el plano de imagen intermedio, que se coloca en
el diafragma fijo dentro del ocular. En teoría, es posible
también colocar retículas en cualquier plano conjugado de
formación de imágenes o en el plano del diafragma campo
iluminado. micrómetros etapa son retículas especializados
colocadosenmicro-portaobjetos,que seutilizan para calibrar
retículas oculary para realizar mediciones de muestras.
filtros de color y densidad neutral se colocan a menudo
en la vía óptica para reducir la intensidad de la luz o alterar
las características de color de la iluminación. Hay varios
lugares dentrodelestativodelmicroscopio donde estos filtros
se colocan generalmente. Algunos microscopios de
laboratorio modernos tienen un soporte de filtro intercalado
entre la carcasa de la lámpara y lentes colectoras, que sirve
como un lugar ideal para estos filtros. A menudo, los filtros
de densidad neutra junto con filtros de corrección de colory
un filtro de difusión esmerilado se colocan juntos en este
soportedelfiltro. otro microscopio
diseños proporcionan un conjunto de filtros integrados
internamente en el cuerpo, que pueden activarse en la
trayectoria de la luz por medio de palancas. Una tercera
ubicación común para los filtros es un soporte montado en
la parte inferior del condensador de platina inferior, por
debajo del diafragma de apertura, que aceptará filtros de
gelatina o de vidrio.
Es importante no colocar filtros en o cerca de
cualquiera de los planos conjugados de formación de
imágenes para evitar la suciedad o de superficie
imperfecciones en los filtros que se obtuvieron imágenes
junto con la muestra (22). Algunos microscopios tienen un
archivo adjunto para la colocación de filtros cerca del
puerto de luz en la base (cerca del diafragma de campo).
Esta colocación es probablemente demasiado cerca del
diafragma de campo, y contaminación de la superficie
puede ser o bien en un enfoque nítido o aparecer como
artefactos borrosas superpuestos en la imagen. Tampoco
es aconsejable colocar filtros directamente en la platina del
microscopio por las mismas razones.
Microscopio Objetivos, Oculares,
condensadores y las aberraciones
ópticas
objetivos de microscopio finitos están diseñados para
proyectar
a limitado por difracción de imagen en un plano fijo (el
plano de imagen intermedia) que está dictada por la
longitud del tubo microscopio y situado a una distancia
pre-especificada desde el plano focal posterior del
objetivo. Las muestras se obtuvieron imágenes a muy corta
distancia más allá del plano focal frontal del objetivo a
través de un medio de índice de refracción se define, por
lo general aire, agua, glicerina, o aceites de inmersión
especializados. fabricantes de microscopios ofrecen una
amplia gama de diseños para cumplir con el objetivo
necesidades de rendimiento de métodos especializados de
imagen (2, 6, 9, 18-21, y ver la sección de Técnicas de
Mejora del contraste), para compensar las variaciones de
espesorde vidrio de cubierta, y para aumentar la distancia
de trabajo eficaz del objetivo.
Todos los principales fabricantes de microscopios
ahora han cambiado su diseño para objetivos infinity -
corregido. Tales objetivos del proyecto rayos emergentes
en haces paralelos de cada acimut hasta el infinito.
Requieren una lente de tubo en la trayectoria de la luz para
llevar la imagen en foco en el plano de la imagen
intermedia.
El menos caro (y más común)objetivos son los objetivos
acromáticos,que se corrigen la aberración cromática axial en
dos longitudes deonda (rojo y azul)que se ponenen elmismo
enfoque. Además, se corrigen la aberración esférica en el
color verde, como se describe en la Tabla 2. La corrección
limitado de objetivos acromáticos conduce a problemas con

la microscopía de colory fotomicrografía.Cuando seelige el
foco en la región del rojo-azul del espectro, las imágenes
tendrán unhalo verde (colorresiduala menudosedenomina).
Acromático
9

Tabla 2 Tipos de lente objetivo y correcciones una
Las correcciones de aberraciones
Llanura
Tipo Esférico Cromático Corrección
achromat * segundo 2 do No
plan de Achromat * segundo 2 do Sí
Fluorita 3 re <3 re No
plan de fluorita 3 re <3 re Sí
plan de
Apocromático 4 mi > 4 mi
Sí
a
Fuente: Grupo Instrumental de Nikon
b
Corregido para dos longitudes de onda en dos ángulos de abertura
específicos.
c
Corregido para el azul y el rojo - ampliagama del espectrovisible.
d
Corregido para el azul, el verde y el rojo - toda la gama del espectro
visible.
e
Corregido para azul marino,azul, verde y rojo.
objetivos ceden sus mejores resultados con la luz pasa a
través de un filtro verde (a menudo un filtro de
interferencia) y usando una película en blanco y negro
cuando se emplean estos objetivos para fotomicrografía.
La falta de corrección para el plano del campo (o curvatura
de campo) dificulta aún más achromat objetivos. En los
últimos años,la mayoría de los fabricantes han comenzado
a proporcionar correcciones de campo planas para
objetivos acromáticos y han dado estos objetivos
corregidos el nombre de acromáticas plano.
El siguiente nivel de corrección y el coste se encuentra
en objetivos llamados fluoritas o semi-apocromáticos
ilustradas por el objetivo centro en la figura 8. Esta figura
representa tres clases principales de objetivos: Los
acromáticas con la menor cantidad de la corrección, como
se discutió anteriormente; las fluoritas (o semi-
apocromáticos) que tienen correcciones esféricas
adicionales; y, los apocromáticos que son los objetivos
más altamente disponibles corregidos. objetivos de
fluorita se producen a partir de formulaciones de vidrio
avanzadas que contienen materiales tales como sustitutos
sintéticos de fluorita o más nuevos (5). Estas nuevas
formulaciones permiten mejorado en gran medida de
corrección de la aberración óptica. Al igual que en los
acromáticos, los objetivos de fluorita también se corrigen
cromáticamente para la luz roja y azul. Además, los
Fluoritas también se corrigen de forma esférica de dos
colores. La corrección superior de los objetivos de fluorita
en comparación con lentes acromáticas permite que estos
objetivos se hacen con una apertura numérica más alta, lo
que resulta en imágenes más brillantes. objetivos de
fluorita también tienen un mejor poder de resolución que
acromáticos y proporcionan un mayor grado de contraste,
haciéndolos más adecuados que acromáticas para
fotomicrografía de color en la luz blanca.
El más alto nivel de corrección (y gastos),se encuentra
en apocromática objetivos, que son corregidas
cromáticamente durante tres colores (rojo, verde y azul),

casi eliminar la aberración cromática y esférica son
corregidas por dos colores. apocromática objetivos son la
mejor opción para fotomicrografía de color en la luz
blanca. Debido a su alto nivel de corrección, objetivos
apocromáticos suelen tener, obteniendo una ampliación
dada, aperturas numéricas más altas que hacen
acromáticos o Fluoritas. Muchos de los nuevos objetivos
de fluorita y apocromáticos de gama alta son corregidos
por cuatro colores y cuatro colores cromáticamente
esféricamente.
Los tres tipos de objetivos sufren de imágenes
curvatura de campo y de proyecto pronunciados que se
curvan en lugar de plana. Para superar esta condición
inherente, los diseñadores han producido lentes objetivos
corregidos-campo plano que producen imágenes planas.
Tales lentes se llaman acromáticos del plan, Fluoritas del
plan o apocromáticos plan, y aunque este grado de
corrección es caro, estos objetivos están ahora en uso
rutinario debido a su valor en la microfotografía.
Figura 8. Los niveles de corrección óptica para aberración en
objetivos comerciales. (A) Objetivos acromáticos, el nivel más
bajo de la corrección, contener dos dobletes y una sola lente
frontal; (B) Fluoritas o objetivos semi-apocromáticos, un nivel
medio de corrección, contienen tres dobletes, una lente de
menisco, y un solo lente frontal; y (c) objetivos apocromáticos,
el más alto nivel de corrección, contienen un triplete, dos
dobletes, una lente de menisco, y una sola lente frontal
semiesférica.
sin corregir la curvatura de campo es la aberración más
grave en los objetivos de fluorita podery apocromáticosmás
altas, y se tolera como un artefacto ineludible para muchos
años. Durante el uso rutinario, el viewfield tendría que ser
reorientado de manera continua entre el centro y los bordes
para capturartodos los detalles de muestras.La introducción
de la corrección de campo plano (plano) a objetivos
perfeccionó su uso para fotomicrografía y microscopía de
vídeo, y hoy en día estas correcciones son estándar tanto en
el uso generaly los objetivos de alto rendimiento.Corrección
para el campo
10

curvatura añade un considerable número de elementos de
la lente al objetivo, en muchos casos hasta cuatro lentes
adicionales. Este aumento significativo en el número de
elementos de lente para la corrección plan también se
produce en los objetivos de fluorita y apocromáticos ya
superpobladas, con frecuencia resulta en un ajuste
apretado de elementos de lente dentro delcilindro objetivo
(4, 5, 18).
Antes de la transición a la óptica al infinito-corregido,
la mayoría de los objetivos se han diseñado
específicamente para ser utilizado con un conjunto de
oculares denominados oculares compensadores. Un
ejemplo es el uso anterior de compensar los oculares con
los objetivos de apertura numérica altamente alto
corregidos para ayudar a eliminar la aberración cromática
lateral.
Hay una gran cantidad de información inscrita en el
cañón de cada objetivo, que se puede dividir en varias
categorías (ilustrados en la Figura 9). Estos incluyen la
ampliación lineal, el valor de apertura numérica,
correcciones ópticas, longitud del tubo cuerpo del
microscopio, el tipo de medio el objetivo está diseñado
para, y otros factores críticos en la decisión de si el
objetivo llevará a cabo según sea necesario. Información
adicional se describe a continuación (17):
Ultrafluar (Objetivo de fluorita con el vidrio que es
transparente a 250 nanómetros), y CF y CFI (sin cromo;
libre de cromo infinito).
· Apertura numérica: Este es un valorcrítico que indica
el ángulo de aceptación de luz, que a su vez determina la
potencia de luz de reunión, el poder de resolución, y la
profundidad de campo del objetivo. Algunos objetivos
diseñados específicamente para fluorescencia de luz
transmitida y la imagen de campo oscuro estánequipadoscon
un diafragma de iris interna que permite el ajuste de la
efectiva
apertura numérica. abreviaturas de designación para estos
objetivos incluyen I, Iris, W / Iris.
· Mecánica Longitud del tubo: Esta es la longitud del
tubo de cuerpo del microscopio entre la abertura de pieza
de nariz, donde está montado el objetivo, y el borde
superior de los tubos de observación donde se insertan los
oculares (oculares). La longitud del tubo es generalmente
inscrito en el objetivo
como el tamaño en número de milímetros (160, 170, 210,
etc.) para longitudes fijas, o el símbolo infinito ( ) Para
longitudes de tubo infinito-corregido.
La Figura 9. Especificaciones grabado en el cañón de un objetivo
típico microscopio. Estos incluyen el fabricante, los niveles de
corrección, ampliación, apertura numérica, los requisitos de
inmersión, longitud del tubo, la distancia de trabajo, y las
propiedades ópticas especializadas.
· Las correcciones ópticas: Estos son generalmente
abrevian como Achro (achromat), Apo (Apocromático), y
Fl, Fluar, Fluor, Neofluar, o Fluotar (fluorita) para una
mejor correcciones esféricas y cromáticas, y como Plan,
Pl, EF, Acroplan, Plan de Apo o Plano para las
correcciones curvatura del campo. Otras abreviaturas
comunes son: ICS (corregidos al infinito del sistema) y
UIS (sistema infinito universal), N y NPL (campo normal
de plan de vista),

La Figura 10. Objetivo con tres grupos de lentes y corrección
de cuello para variar los espesores de vidrio cubierta. (A) grupo
de lentes 2 girar a la posición hacia delante dentro del objetivo.
Esta posición se utiliza para la cubierta se desliza más delgadas.
(B) grupo de lentes 2 girar a la posición hacia atrás dentro del
objetivo. Esta posición se utiliza para los cubreobjetos más
gruesa.
· Cubierta de vidrio Espesor: objetivos de
transmisión de luz más están diseñados para especímenes
de imagen que están cubiertos por una tapa de vidrio (o
hoja de la cubierta). El espesor de estas pequeñas placas
de vidrio está estandarizada a 0,17 mm para la mayoría de
aplicaciones, aunque hay alguna variación en el espesor
dentro de un lote de cubreobjetos.Por esta razón, algunos
de los objetivos en seco de alta apertura numérica tienen
un ajuste del collar de corrección de los elementos de
lentes internas para compensar esta variación (Figura 10).
Las abreviaturas para el ajuste collar de corrección
incluyen Corr, w / Corr, y CR, aunque la presencia de un
collar movible, con estrías y escala graduada es también
una
11

MICROSCOPIA ÓPTICA
Davidson y Abramowitz
Indicador de esta característica. Tabla 3 anillos con codificación por colores en el
microscopio Objetivos
· Distancia de trabajo: Esta es la distancia entre el
lente delantera del objetivo y la parte superior de la cubierta
de vidrio cuando
código de color de inmersión
una tipo de inmersión
la muestra quede enfocada. En la mayoría de los casos,el
trabajo
distancia de un objetivo disminuye a medida que
magnificación Negro de inmersión en aceite
aumenta. valores de distancia de trabajo no se incluyen en naranja la inmersión de glicerol
todos los objetivos y su presencia varía dependiendo Blanco La inmersión en agua
el fabricante. Las abreviaturas comunes son:L, LL, LD, rojo Especial
y LWD (larga distancia de trabajo); ELWD (extralargo código de color de ampliación
segundo Aumento
distancia de trabajo); SLWD (súper larga distancia de
trabajo),
y ULWD (distancia de trabajo ultra-largo). Negro 1x, 1,25x
· Roscas de tornillo Objetivo: Las roscas de montaje marrón 2x, 2.5x
en casi todos los objetivos están dimensionados para las
normas de la Real rojo 4x, 5x
Sociedad microscópica (RMS) para compatibilidad
universal. Amarillo 10x
Esta norma especifica roscas de montaje que son 20,32 Verde 16x, 20x
mm de diámetro con un paso de 0,706, que es actualmente Azulturquesa 25x, 32x
utilizado en la producción de los objetivos infinito-corregido Azulclaro 40x, 50x
por los fabricantes de Olympus y Zeiss. Leica y Nikon Cobalto (oscura) azul 60x, 63x
han roto de la norma con la introducción de Crema blanca) 100x
nuevos objetivos de borde infinito con corrección que tienen
una más amplia
una Estrecho anillo de color situado cerca del extremo del
espécimen
tamaño de la rosca de montaje, por lo que los objetivos Leica
y Nikon
objetivo.
utilizable sólo en sus propios microscopios. abreviaturas
segundo bandaestrecha situado más cerca de la rosca de montaje
de la
comúnmente utilizados son: RMS (Royal Society
microscópico código de inmersión.
hilo objetivo), M25 (métrico 25-mm hilo objetivo),
y M32 (métrica de 32 mm hilo objetivo).
· Inmersión Medio: La mayoría de los objetivos se han
diseñado
con un anillo blanco y objetivos altamente especializados
para
a la imagen especímenes con aire como el medio entre el
medios de inmersión inusual menudo están grabados con
un rojo
objetiva y la cubierta de vidrio. Para alcanzar la más alta de
trabajo
anillo. La Tabla 3 enumera magnificación y la imagen
actual
aperturas numéricas, muchos objetivos están diseñados para
códigos de color de medios de comunicación en uso por
la mayoría de fabricantes.
imagen de la muestra a través de otro medio que reduce · Propiedades ópticas especializadas: Microscopio
las diferencias de índice de refracción entre el vidrio y la
formación de imágenes
objetivos a menudo tienen parámetros de diseño que
optimizan
medio. objetivos apocromáticos plan de alta resolución
pueden rendimiento bajo ciertas condiciones. Por ejemplo, hay
lograr aperturas numéricas hasta 1,40 cuando la
son objetivos especiales diseñados para la iluminación
polarizada
medio de inmersión es aceite especial con un índice de
refracción (Representado por las siglas P, PO, Pol, o SF, y / o
de 1,51. Otros medios de inmersión comunes son agua y
que tiene todos los grabados barril pintados de rojo),
contraste de fase
glicerina. Objetivos para inmersión especial (PH, y / o grabados barril verde), diferencial
los medios de comunicación por lo general tienen un anillo
de un código de colores inscrita en torno
de contraste de interferencia (DIC ), y muchas otras
abreviaturas

la circunferencia del cilindro objetivo que se enumeran en la
Tabla
para aplicaciones
adicionales. El objetivo apocromático
3 y se describe a continuación. se ilustra en la Figura 9 está optimizado para DIC
· Código de colores: etiqueta de muchos fabricantes de
microscopios fotomicrografía y esto se indica en el barril. los
sus objetivos con códigos de colores para ayudar en la rápidaH mayúscula al lado de la marca DIC indica que la
identificación de la ampliación. El color azul oscuro objetivo debe serutilizado con un prisma DIC específica
código en el objetivo se ilustra en la Figura 9 indica la optimizado para aplicaciones de gran aumento.
ampliación lineal es 60x. Esto es muy útil cuando Hay algunas aplicaciones que no requieren
usted tiene una torreta pieza nasal que contiene 5 ó 6
objetivos
objetivos diseñados para ser corregidos para la cubierta
de vidrio
y debe seleccionar rápidamente una ampliación específica. espesor.Estos incluyen objetivos utilizados para observar
Algunos objetivos especializados tienen un código de color
adicional especímenes descubiertos en metalúrgica luz reflejada
que indica el tipo de medio de inmersión necesario especímenes, la inspección del circuito integrado, micro
para lograr la apertura numérica óptima. Inmersión maquinaria, manchas biológicas, y otras aplicaciones que
lentes para uso con aceite tienen un anillo de color negro,
requerir la observación de los objetos descubiertos.otro
común
mientras que los destinados para su uso con glicerina tienen
una naranja
abreviaturas que se emplean en barriles objetivo de
microscopio,
anillo. Objetivos diseñados para los organismos vivos en
imagen
que son útiles en la identificación de propiedades
específicas, son
medios acuosos se designan objetivos de inmersión en agua
enumerados en la Tabla 4
(17).
12

Tabla 4 Designaciones Objetivo especializados
Abreviatura Tipo
Fase, FACO, PC, Ph 1,2, 3, etc.. De contrastede fase, condensador de anillo usando la fase 1, 2, 3, etc.
DL, DM, PLL, PL, PM, PH, NL, NM, NHEl contraste de fases: oscuro medio-bajo, oscuro, bajo positivo bajo, positivo, positivo
medio, positivas de alto contraste(regiones con mayor índice de refracción
aparecen
más oscuro); bajos negativo, medio negativo, de alto contrastenegativo (regiones
con
más alto índice de refracción aparecerá más claro)
P, Po, Pol, SF Sin tensiones, birrefringencia baja, para que la luz polarizada
T, UV, Universal transmisión UV (hasta aprox. 340 nm), por epifluorescencia UV-excitado
METRO Metalográfico (sin cubreobjetos)
NC, NCG sin cubreobjetos
EPI
La iluminación de superficie (muestra iluminados a través de la lente objetiva), en
contraste con
dia- o transiluminación
TL Luz transmitida
BBD, HD, B D Para su uso en campo claro u oscuro (el infierno, Dunkel)
re Campo oscuro
H Diseñado principalmente para la etapade calentamiento
T, UT
Diseñado para ser utilizado con la etapauniversales (ampliación / NA aplica para
el uso
con hemisferio de vidrio; adivinar ambos valores por 1,51 cuando no se utiliza
hemisferio)
DI; MI; TI Michelson interferometría; sin contacto; haz múltiple (Tolanski)
a
Muchos de los códigos de designación son específicos del fabricante.
Las aberracionesópticas
errores lente o aberraciones en microscopia óptica son
causadas porartefactos que surgen de la interacción de la
luz con lentes de vidrio (2-5, 19-24). Hay dos causas
principales de aberración: (i) las aberraciones geométricas
o esféricas están relacionados con la naturaleza esférica de
la lente y aproximaciones utilizado para obtener la
ecuación de la lente de Gauss; y (ii) las aberraciones
cromáticas que surgen de las variaciones en los índices de
refracción de la amplia gama de frecuencias que se
encuentran en la luz visible.
En general, los efectos de las aberraciones ópticas son
para inducirdefectosen las característicasde una imagen que
se observarona travésde un microscopio.Estosartefactos se
trataron por primera vez en el siglo XVIII, cuando el físico
John Dollond descubrió que la aberración cromática se
reduciría o corregirse mediante elusode una combinaciónde
dos tipos diferentes de vidrio (Flint y corona) en la
fabricación de lentes(13).Más tarde,duranteelsiglo XIX,se
desarrollaron los objetivos acromáticos con alta apertura
numérica, aunque todavía había problemas geométricos con
las lentes.formulacionesde vidrio modernos,asociados a las
técnicas de molienda y fabricación avanzadoshaneliminado
la mayoría de las aberraciones de objetivos de microscopio
de hoy en día,aunquetodavía debeprestarsemucha atención
a estos efectos,especialmentecuando serealizan cuantitativa
de gran aumento microscopía de vídeo y microfotografía
(23).
Aberración esférica: Estos artefactos se producen
cuando

ondas deluzque pasan a travésde la periferia de una lente no
se ponen en foco idénticos a los que pasa más cerca del
centro. Waves que pasan cerca del centro de la lente se
refractan sólo ligeramente,mientras que las ondas quepasan
cerca de la periferia se refractan en un mayor grado que
resulta en la producción de diferentes puntos focales a lo
largo del eje óptico.Este es uno de los artefactos más graves
de resolución porque la imagen de la muestra se extiende
hacia fuera en lugar de estar en un enfoque nítido.
aberracionesesféricasson muy importantesen términos de la
resolución de la lente, ya que afectan la imagen coincidente
de puntosa lo largo deleje óptico y degradan elrendimiento
de la lente,lo que afectará seriamente la nitidez y la claridad
de muestras.Estosdefectosde la lente pueden serreducidos
mediante la limitación de los bordes exteriores de la lente de
la exposición a la utilización de diafragmas ligeros y también
mediante la utilización de superficies de las lentes asféricas
dentro del sistema. Los objetivos de microscopio modernas
de mayor calidad frente a las aberraciones esféricas en un
número de maneras,incluyendo técnicas especiales de lentes-
en grano, elementos de lentes adicionales de diferentes
curvaturas, formulaciones mejoradas de vidrio, y un mejor
controlde las vías ópticas.
Aberración cromática: Este tipo de defecto óptico es
un resultado del hecho de que la luz blanca se compone de
numerosas longitudes de onda.Cuando la luz blanca pasa
a través de una lente convexa, las longitudes de onda
componentes se refractan según su frecuencia. La luz azul
se refracta en la mayor medida seguido por la luz verde y
roja, un fenómeno comúnmente se conoce como
dispersión.La incapacidad de la lente para llevar todos los
colores en una
13

resultados de enfoque comunes en un tamaño de la imagen
ligeramente diferente y un punto focal para cada grupo de
longitud de onda predominante. Esto lleva a franjas de
color que rodean la imagen.
corrección óptica se intentaron por primera vez en la
última parte del siglo 18, cuando Dollond, Lister y otros
idearon maneras de reducir la aberración cromática
longitudinal (13). Mediante la combinación de vidrio
corona y vidrio flint (cada tipo tiene una dispersión
diferente de índice de refracción), tuvieron éxito en llevar
a los rayos azules y los rayos rojos a un foco común, cerca,
pero no idénticos a los rayos verdes. Esta combinación se
denomina un doblete de lentes donde cada lente tiene un
índice de refracción diferente y las propiedades
dispersivas. dobletes lente también se conocen como
lentes o acromáticas acromáticos para abreviar, derivados
de los términos griegos un significado sin y significado
chroma color. Esta sencilla forma de corrección permite
que los puntos de imagen de 486 nanómetros en la región
azul y 656 nanómetros de la región roja ahora coinciden.
Esta es la lente objetivo más utilizado y se encuentra
comúnmente en los microscopios de laboratorio.
Objetivos que no llevan una inscripción especial que diga
lo contrario es probable que sean acromáticos.
Acromáticos son objetivos satisfactorios para el uso
rutinario de laboratorio, sino porque no se corrigen para
todos los colores, un detalle espécimen incoloro es
probable que muestran, a la luz blanca, de un color verde
pálido en el mejor enfoque (el llamado espectro
secundario).
Una combinación adecuada de espesor de la lente, la
curvatura, índice de refracción y la dispersión permite que
el doblete para reducir la aberración cromática por la unión
de dos de los grupos de longitud de onda en un plano focal
común. Si el espato flúor se introduce en la formulación
de vidrio utilizado para fabricar la lente, a continuación,
los tres colores rojo, verde, y azul se puede poner en un
único punto focal que resulta en una cantidad
insignificante de aberración cromática (23). Estas lentes
son conocidos como lentes apocromática y se utilizan para
construir objetivos de microscopio libre de aberraciones
cromáticas muy alta calidad. microscopios modernos
utilizan este concepto y hoy en día es común encontrar
trillizos de lentes ópticas hechas con tres elementos de
lente cementada juntos, sobre todo en objetivos de mayor
calidad. Para la corrección de la aberración cromática, un
típico objetivo de microscopio 10x achromat está
construido con dos dobletes de lentes (Figura 8 (a)).
objetivos apocromáticos por lo general contienen dos
dobletes de lentes y un triplete de lentes (Figura 8 (c)) para
la corrección avanzada de ambos aberraciones cromáticas
y esféricas.
A pesarlongitudinal(o axial) cromática corrección de la
aberración, objetivos apocromáticos también exhiben otro
defecto cromática.Inclusocuandolos trescolores principales
son llevados a planos focales idénticos axialmente, las
imágenes de punto de datos cerca de la periferia del campo
de visión,no son delmismo tamaño; porejemplo,la imagen
azul de un detalle es ligeramente mayorque la imagen verde
o la imagen roja en luz blanca, lo que causa timbre de color
de los detalles de muestras en elexterior

regiones del campo de visión (23). Este defecto se conoce
como la aberración cromática lateral o diferencia
cromática de aumento. Es el ocular de compensación, con
diferencia cromática de aumento justo lo contrario de la
del objetivo, que se utiliza para corregir la aberración
cromática lateral. Debido a este defecto también se
encuentra en acromáticas mayor aumento, los oculares
compensadores se utilizan con frecuencia para tales
objetivos,también. De hecho,muchos fabricantes diseñan
sus acromáticas con un error estándar cromática lateral y
el uso de los oculares de compensación para todos sus
objetivos.Tales oculares a menudo llevan la inscripción K
o C o Compens. Como resultado, los oculares
compensadores construir-en el error cromática lateral y no
son,en sí mismos, perfectamente corregida.
Corrección cubreobjetos: Es posible para el usuario
para introducir inadvertidamente aberración esférica en un
sistema bien corregida (2, 23). Por ejemplo, cuando se
utiliza la alta ampliación y objetivos en seco de alta
apertura numérica (NA = 0,85-0,95), el espesor correcto
de la cubierta de vidrio (sugirió 0,17 mm) es crítica; por lo
tanto, la inclusión de un collar de corrección en tales
objetivos para permitir el ajuste de espesor de vidrio de
cubierta incorrecta. Del mismo modo, la inserción de los
accesorios en la trayectoria de luz de los objetivos de la
longitud del tubo finitos puede introducir aberraciones,
evidente cuando el espécimen es reorientado, a menos que
tales accesorios se han diseñado correctamente con óptica
adicionales. La Figura 10 ilustra cómo interna lentes
operan en un objetivo diseñado para la corrección de
cubreobjetos.
Otras aberraciones geométricas: Estos incluyen una
variedad de efectos que incluyen el astigmatismo,
curvatura de campo, y las aberraciones de coma, que se
corrigen con la fabricación de la lente adecuada.
Curvatura de campo en la imagen es una aberración
que es familiar para la mayoría de los microscopistas
experimentados. Este artefacto es el resultado natural de
utilizar lentes que han curvadas superficies. Cuando la luz
visible se enfoca a través de una lente curvada, se curva el
plano de la imagen producida por la lente. Cuando la
imagen se ve en las mirillas (oculares) de un microscopio,
tampoco aparece nítida y clara en el centro o en los bordes
de la viewfield pero no ambos. Normalmente, esto no es
un problema grave cuando el microscopista está
escaneando rutinariamente muestras para observar sus
diversas características. Es una simple cuestión de utilizar
el botón de enfoque fino para corregir pequeñas
deficiencias en el enfoque de la muestra. Sin embargo,
para fotomicrografía, curvatura de campo puede ser un
problema grave, especialmente cuando una parte de la
microfotografía es fuera de foco.
microscopios modernos se ocupan de la curvatura de
campo mediante la corrección de esta aberración usando
los objetivos de campo plano especialmente diseñados.
Estos objetivos especialmente corregidos han sido
nombrados plan o plano y son el tipo más común de
objetivo en uso hoy en día. objetivos del Plan también se
corrigen para otros artefactos ópticos tales como esférica
y
14

aberraciones cromáticas. En el caso de un objetivo delplan
que también se ha corregido la mayoría de la aberración
cromática, el objetivo es referido como un acromático
plano. Este es también el caso de los objetivos de fluorita
y apocromática, que tienen los nombres modificados: la
fluorita y el plan apocromático plano.
La adición de corrección óptica curvatura del campo
de un objetivo que ya ha sido corregida para las
aberraciones ópticas a menudo puede añadir un número
significativo de elementos de lente al objetivo. Por
ejemplo, el objetivo típico achromat tiene dos dobletes de
lentes y una lente hemisférica, haciendo de total de cinco
elementos de lente. Por el contrario, un objetivo achromat
plan de comparable tiene tres dobletes y tres lentes
individuales para un total de nueve elementos de lente, lo
que es considerablemente más difícil de fabricar. Como
hemos visto, el número de elementos de lente aumenta a
medida que las lentes se corrigen los errores esféricas, así
como las aberraciones cromáticas de curvatura y de
campo. Por desgracia, como el número de elementos de
lente aumenta también lo hace el costo del objetivo.
objetivos apocromáticos sofisticado plan que se
corrigen para esféricas, y las aberraciones cromáticas
campo de curvatura pueden contener hasta dieciocho y
veintiún elementos de lentes separadas, haciendo que
estos objetivos el más caro y difícil de fabricar. Planificar
objetivos apocromática puede costar más de $ 3,000 a $
5,000 cada una de las unidades de gran aumento que
también tienen una alta apertura numérica. Para la mayoría
de las aplicaciones fotomicrografía, sin embargo, no es
absolutamente necesario contar con la mejor corrección,
aunque esto depende en gran medida de la finalidad, la
muestra, y el rango de tamaño deseado. Cuando el costo
es importante (cuando no es así?), A menudo es
aconsejable seleccionar los objetivos del plan de fluorita
precio más modestamente que tienen un alto grado de
corrección, especialmente las versiones más modernas.
La curvatura de campo es muy rara vez se elimina
totalmente, pero a menudo es difícil de detectar la
curvatura del borde con la mayoría de los objetivos del
plan-corregido y que no se muestra en las microfotografías
(19, 23). Este artefacto es más grave en aumentos bajos y
puede ser un problema con los microscopios estéreos.Los
fabricantes han luchado durante años para eliminar la
curvatura de campo en los grandes objetivos que se
encuentran en los microscopios estéreos. En los últimos
diez años, empresas como Leica, Nikon, Olympus, y
Zeiss,han hecho grandes avances en la calidad de la óptica
utilizados para construirmicroscopios estéreos y,mientras
que los artefactos y aberraciones no se han eliminado
totalmente, los modelos de gama alta son ahora capaz de
producir fotomicrografías excelentes.
aberraciones de coma son similares a aberraciones
esféricas,pero se encuentran principalmente confuera de eje
objetos y son más graves cuando el microscopio está fuera
de alineación (23). En este caso,la imagen de un punto es
asimétrico, lo que resulta en un (por lo tanto, el término
coma) forma de cometa. La forma de cometa puede tener
su cola apuntando hacia el centro del campo de vista o de
distancia dependiendo de si la aberración de coma tiene un
valor positivo o negativo. Coma puede producirse cerca de
la zona axial de la trayectoria de la luz, y / o la zona más
periférica. Estas aberraciones se corrigen generalmente
junto con aberraciones esféricas mediante el diseño de
elementos de lentes de varias formas para eliminar este
error. Objetivos que están diseñados para producir
imágenes excelentes para amplio campo de visión
oculares, tienen que ser corregidos para el coma y
astigmatismo utilizando una óptica de múltiples elementos
de diseño especial en la lente del tubo para evitar estos
artefactos en la periferia del campo de visión.
aberraciones de astigmatismo son similares a las
aberraciones de coma, sin embargo estos artefactos
dependen más fuertemente de la oblicuidad del haz de luz
(23). Este defecto se encuentra en las porciones exteriores
de la campo de visión de lentes sin corregir. La imagen
fuera del eje de un punto de la muestra aparece como una
línea en lugar de un punto. Lo que es más, dependiendo
del ángulo de los rayos fuera del eje que entran en la lente,
la imagen de líneas puede estarorientada en cualquiera de
dos direcciones diferentes, tangencial o radialmente.
errores de astigmatismo son generalmente corregidos por
el diseño de los objetivos para proporcionar el
espaciamiento preciso de elementos de lente individuales,
así como formas de lentes apropiadas y los índices de
refracción. La corrección del astigmatismo se logra a
menudo en conjunción con la corrección de aberraciones
de campo curvatura.
Oculares (oculares)
Oculares trabajan en combinación con objetivos de
microscopio para ampliar aún más la imagen intermedia
de modo que los detalles de muestras pueden ser
observados. Ocular es un nombre alternativo para los
oculares que ha sido ampliamente utilizados en la
literatura, sino para mantener la consistencia durante esta
discusión nos referiremos a todos los oculares como
oculares. Los mejores resultados en la microscopía
requieren que los objetivos pueden utilizar en combinación
con los oculares que son apropiados para la corrección y el
tipo de objetivo. Las inscripciones en el lado del ocular
describen sus características y la función particulares.
El ocular se ilustra en la Figura 11 está inscrita con UW
(no ilustrado), que es una abreviatura para el viewfield ultra
ancha. A menudo oculares también tendrán una designación
H, dependiendodelfabricante,para indicar
a punto focal de alto punto de mira que permite a los
microscopistas

usar gafas durante la visualización de muestras. Otras
inscripciones comunes a menudo se encuentran en los
oculares incluyen WF para el campo de ancho; UWF para
el campo ultra ancha; SW y SWF para
15

campo super amplio; HE para alta punto de mira; y CF
para oculares destinados para su uso con CF corrigió
objetivos (2, 3, 5, 19, 23, 24). Como se discutió
anteriormente, los oculares de compensación a menudo se
inscriben con K, C, Comp, o Compens, así como la
ampliación. Oculares utilizados con objetivos de campo
plana a veces son etiquetados Plan-Comp. factores de
aumento de los oculares comunes van de 5x a 25x, y por
lo general contienen una inscripción, tales como A / 24,
que indica el número de campo es 24, en referencia al
diámetro (en milímetros) del diafragma fijo en el ocular.
Muchos oculares también tienen un ajuste de enfoque y un
tornillo que permite su posición para ser fijado. Fabrica
ahora a menudo producen oculares que tienen de goma
oculares tazas que sirven tanto para situar los ojos, la
distancia adecuada de la lente frontal,
La Figura 11. diagrama seccionado de un ocular típica periplan.
El diafragma de apertura fijo está posicionado entre el grupo 1 y
de la lente de la lente grupo 2, donde se forma la imagen
intermedia. El ocular tiene una ojera protectoraque hace que la
visualización de la muestra más cómodo para el microscopista.
Hay dos tipos principales de oculares que se agrupan de
acuerdo con la lente y disposición de diafragma:los oculares
negativas con un diafragma interno entre las lentes, y los
oculares positivos que tienen un diafragma pordebajo de las
lentes delocular.ocularesnegativostienendoslentes:la lente
superior,que está más cerca delojo delobservador,se llama
el ojo-lente y la lente inferior (debajo del diafragma) a
menudo se denomina la lente de campo. En su forma más
simple, las dos lentesson plano-convexa,con lados convexos
hacia el espécimen.Aproximadamente a mediados
camino entre estas lentes hay una abertura circular fija o
diafragma interna que, por su tamaño, define el campo
circular de vista que se observa en que mira en el
microscopio. El tipo más simple de ocular negativo, u
ocular de Huygens, se encuentra en la mayoría de los
microscopios de rutina equipados con objetivos
acromáticos. Aunque las lentes de los ojos y de campo
Huygens no están bien corregidos, sus aberraciones
tienden a anularse entre sí. Más altamente oculares
negativos corregidos tienen dos o tres elementos de lente
cementada y se combinan juntos para hacerla lente del ojo.
Si un ocular desconocido lleva sólo el aumento inscrito en
la carcasa, es más probable que sea un ocular de Huygens,
el más adecuado para su uso con objetivos acromáticos de
5 aumentos-40x.
El otro tipo principal de ocular es el ocular positiva con
un diafragma por debajo de sus lentes, conocido
comúnmente como el ocular Ramsden. Este ocular tiene
una lente de la lente de ojo y el campo que también son
plano-convexa, pero la lente de campo se monta con la
superficie curvada orientada hacia la lente delojo. El plano
focal delante de este ocular se encuentra justo por debajo
de la lente de campo, en el nivel del ocular fijo diafragma,
haciendo de este ocular fácilmente adaptable para retículas
de montaje. Para proporcionar una mejor corrección, las
dos lentes del ocular de Ramsden pueden pegarse.
oculares simples tales como la Huygens y Ramsden y
sus homólogos acromatizada no corregirá para la
diferencia cromática residual de aumento en la imagen
intermedia, especialmente cuando se utiliza en
combinación con objetivos acromáticos de gran aumento,
así como objetivos de fluorita o apocromáticos. Para
remediar esto en sistemas de microscopía finitos, los
fabricantes producen compensar oculares que introducen
un error igual, pero opuesta, cromática en los elementos
de lente. oculares de compensación pueden ser o bien del
tipo positivo o negativo, y ha de ser utilizada en todas las
magnificaciones con fluorita, apocromático y todas las
variaciones de los objetivos del plan (que también se
pueden utilizar ventajosamente con objetivos acromáticos
de 40x y superior).
En los últimos años, objetivos de microscopios
modernos tienen su corrección para la diferencia cromática
de aumento, ya sea integrado en los propios objetivos
(Olympus y Nikon) o corregidos en el lente del tubo (Leica
y Zeiss), eliminando así la necesidad de corregir la
compensación de los oculares.
Los oculares de compensación juegan un papel crucial
para ayudar a eliminar las aberraciones cromáticas
laterales residuales inherentes en el diseño de objetivos
altamente corregidos. Por lo tanto, es preferible que el
microscopista utiliza los oculares compensadores
diseñados por un fabricante en particular para acompañar
objetivos corregidos superior de ese fabricante. El uso de
un ocular incorrecta con un objetivo apocromático
diseñado para un finito (160 o

170 milímetros) microscopio longitud del tubo resulta en
un aumento de forma espectacular contraste con las
franjas de color rojo en los diámetros exteriores y flecos
azules en los diámetros interiores de detalle espécimen.
surgen problemas adicionales de una planitud limitada del
viewfield en oculares simples, incluso aquellos corregido
con dobletes ojo-lente.
diseños del ocular más avanzados resultaron en el
ocular Periplan (Figura 11), que contiene siete elementos
de lente que se cementan en un doblete, un triplete, y dos
lentes individuales. Mejoras en el diseño de los oculares
periplan conducen a una mejor corrección de la aberración
cromática lateral residual, aumento de la planitud de
campo, y un mejor rendimiento general en general cuando
se utiliza con objetivos de potencia más altos.
microscopios modernos ofrecen una mejora
enormemente los objetivos del plan corregido en el que la
imagen principal tiene mucho menos curvatura de campo
de objetivos mayores. Además, la mayoría de los
microscopios ahora cuentan con tubos cuerpo mucho más
amplias que han alojados en gran medida el aumento del
tamaño de las imágenes intermedias. Para hacer frente a
estas nuevas características, los fabricantes ahora
producen oculares de gran eyefield que aumentan el área
visible de la muestra portanto como 40 porciento. Debido
a que las estrategias de técnicas de corrección del ocular-
objetivo varían de un fabricante a otro, es muy importante
(como se indica más arriba) para utilizar sólo oculares
recomendados porun fabricante específico para su uso con
sus objetivos.
Nuestra recomendación es elegir cuidadosamente el
objetivo primero, y luego comprar un ocular que está
diseñado para trabajaren conjunto con elobjetivo.Alelegir
oculares, es relativamente fácil de diferenciar entre los
oculares simples y más altamente compensación. oculares
simples tales como elRamsdeny Huygens(y suscontrapartes
más altamente corregidos) se parecen tener un anillo azul
alrededor del borde de la membrana ocular cuando se ve a
través del microscopio o mantenido a una fuente de luz. En
contraste, más altamente corregido compensar oculares con
tener un anillo de color amarillo-rojo-naranja alrededor del
diafragma en las mismas circunstancias. oculares no
compensar modernos están totalmente corregidos y no
muestran ningún color. La mayoría de los microscopios
modernos tienen todaslas correccioneshechasen los mismos
objetivos o teneruna corrección finalde la lente deltubo.
Las propiedades de varios oculares disponibles
comercialmente comunes se enumeran según el tipo en la
Tabla 5 (19, 23). Los tres principales tipos de oculares
enumerados en la Tabla 5 son buscador,de gran campo,y el
campo de superamplio. La terminología utilizada por varios
fabricantes puede sermuy confusoy cuidado se debe prestar
atención a sus folletos de ventas y manuales de microscopio
para asegurarse de que los oculares correctas están siendo
utilizados con un objetivo específico. En la Tabla 5, las
abreviaturasque designan amplia
campo y los oculares de campo amplio súper están
acoplados a su diseño para punto de mira alto, y son WH
y SWH, respectivamente. Los aumentos son o 10x o 15x y
los números de campo varían desde 14 hasta 26,5,
dependiendo de la aplicación. El ajuste de dioptrías es
aproximadamente la misma para todos los oculares y
muchos también contener una fotomáscara o micrómetro
retícula.
Los rayos de luz que emanan del ocular se cortan en la
pupila de salida o punto de mira (disco Ramsden) donde la
parte frontal del ojo del microscopista debe ser colocado
con el fin de ver todo el campo de visión (generalmente 8-
10 mm por encima de la lente del ojo). Al aumentar la
magnificación del ocular, el punto de mira se dibuja más
cerca de la superficie superior de la lente del ojo, lo que es
mucho más difícil para los microscopistas de usar,
especialmente si él o ella usa gafas.oculares punto de mira
alto especialmente diseñados han sido manufacturados que
las distancias de visión característica eyepoint aproximan
20-25 mm por encima de la superficie de la lente del ojo.
Estos oculares mejoradas tienen lentes de ojo de diámetro
más grandes que contienen más elementos ópticos y por lo
general cuentan con una mejor planeidad de campo. Tales
oculares a menudo se designan con la inscripción “H” en
algún lugar en la carcasa del ocular, ya sea solo o en
combinación con otras abreviaturas, como se discutió
anteriormente. Cabe mencionar que de alto punto de mira
oculares son especialmente útiles para microscopistas que
usan gafas para corregir la miopía cerca o lejos, pero no lo
hacen correcta para algunos otros defectos visuales, como
el astigmatismo. Hoy en día, los oculares punto de mira
alto son muy populares, incluso con personas que no usan
anteojos, debido a la holgura del ojo grande reduce la
fatiga y hace que la visualización de imágenes a través del
microscopio mucho más cómodo.
En un tiempo, los oculares estaban disponibles en una
amplia gama de aumentos que se extienden desde 6,3x a
30x y, a veces incluso más alto para aplicaciones
especiales. Estos oculares son muy útiles para la
observación y la fotomicrografía con los objetivos de baja
potencia. Por desgracia, con los objetivos de mayor
potencia, el problema de la ampliación vacía (sin
magnificación mayor claridad) se vuelve importante
cuando se utilizan oculares muy alta magnificación y estos
deben ser evitados. Hoy en día la mayoría de los
fabricantes restringen su oferta de los oculares a los de los
10x a 20x rangos.El diámetro de la viewfield en un ocular
se expresa como un campo de número de vista o campo de
número (FN), como se discutió anteriormente.
Información sobre elnúmero de campo de un ocular puede
dar el diámetro real de la viewfield objeto utilizando la
fórmula (23):
Viewfield Diámetro = FN / (MO x MT) (2)

Donde FN es el número de campo en milímetros, HO es el
aumento del objetivo, y MT es la lente del tubo
17

Tabla 5 Propiedades de oculares comerciales
Tipo ocular Oculares Finder Súper Gran Campo Oculares de campo amplio
oculares
Descriptivo PSWH PCH 35 SWH SWH CROSSWH WH WH
Abreviatura 10x 10x 10x 10x H 10x H 15x 10x H
Número de campo 26.5 22 26.5 26.5 22 14 22
Dioptría
Ajuste -8 ~ 2 -8 ~ 2 -8 ~ 2 -8 ~ 2 -8 ~ 2 -8 ~ 2 -8 ~ 2
31/4 x “41/4” 31/4 x “41/4” 35mm dioptría dioptría dioptría
observaciones foto foto foto corrección corrección corrección
máscar
a máscara máscara línea de cruce
Diametro de
Micrómetro - - - - - 24 24
retícula
factor de aumento (si existe). La aplicación de esta
fórmula a la super gran ocular campo enumerados en la
Tabla 5, se llega a la siguiente para un objetivo de 40x con
un aumento de la lente del tubo de 1,25:
Viewfield Diámetro = 26,5 / 40 x 1,25 = 0,53 mm (3)
Tabla 1 se enumeran los diámetros viewfield más de la
gama común de objetivos que se producirían utilizando
este ocular.
Tabla 6 Rango de aumento útil (500-
1000 x NA del objetivo)
Objetivo oculares
(N / A) 10x 12,5x 15x 20x 25x
2.5x - - - X X
(0,08)
4x - - X X X
(0,12)
10x - X X X X
(0,35)
25x X X X X -
(0,55)
40x X X X - -
(0,70)
60x X X X - -
(0,95)
100x X X - - -
(1,42)
Se debe tener cuidado en la elección de los oculares
combinaciones / objetivas para asegurar la ampliación
óptima de
espécimen detalle sin la adición de artefactos innecesarios.
Por ejemplo, para lograr un aumento de 250x, el
microscopista podría elegir un ocular 25x acoplado a un
objetivo de 10x. Una opción alternativa para la misma
ampliación sería un ocular de 10x con un objetivo de 25x.
Debido a que el objetivo de 25x tiene una apertura
numérica más alta (aproximadamente 0,65) que lo hace el
objetivo de 10x (aproximadamente 0,25), y teniendo en
cuenta que los valores de apertura numéricos definen
poder de resolución de un objetivo, es evidente que esta
última opción sería la mejor. Si fotomicrografías de la
misma viewfield se hicieron con cada combinación
objetivo / ocular descrito anteriormente, sería evidente que
el ocular de 10x / 25x dúo objetivo sería producir
fotomicrografías que se destacaron en detalle espécimen y
la claridad en comparación con la combinación alternativa.
La apertura numérica del sistema de objetivo /
condensador define la gama de aumento útil para una
combinación objetivo / ocular (19, 22-24). Hay un aumento
mínimo necesario para eldetalle presente enuna imagen para
ser resuelto, y este valor es por lo general más bien
arbitrariamente establecido como 500 veces la apertura
numérica (500 x NA). En el otro extremo del espectro, el
aumento máximo útil de una imagen se ajusta usualmente a
1000 veces la apertura numérica (1000 x NA). Ampliaciones
superiores a este valor cederán ninguna información útil
adicionalo resolución más fina de detalles dela imagen,y por
lo general llevar a la degradación de la imagen. Exceder el
límite de aumento útilhace que la imagen a sufrirelfenómeno
de aumento vacío (19),

más ampliada sin un aumento correspondiente en la
resolución de detalles. Tabla 6 enumera las combinaciones
de objetivo / ocular comunes que entran en la gama de
aumento útil.
Oculares pueden adaptarse para fines de medición
mediante la adición de una pequeña retícula de vidrio en
forma de disco circular en el plano del diafragma de
abertura fija del ocular. Graticules generalmente tienen
marcas, tales como una regla de medición o de rejilla,
grabado al agua fuerte sobre la superficie. Debido a que la
retícula se encuentra en el mismo plano conjugado tal
como el diafragma ocular fija, aparece en un enfoque
nítido superpuesta a la imagen de la muestra. Oculares
utilizando retículas normalmente contienen un mecanismo
de enfoque (tornillo helicoidal o corredera) que permite
que la imagen de la retícula a ser llevado en el foco. Se
necesita un micrómetro de platina para calibrar la escala
ocular para cada objetivo.
enfoque sea ajustado para la iluminación adecuada de la
muestra. La colocación correcta del condensador con
relación al cono de iluminación y el enfoque sobre la
muestra es crítica para la microscopía cuantitativa y
fotomicrografía óptima. Se debe tener cuidado para
garantizar que la apertura del condensador se abre a la
posición correcta con respecto a la apertura numérica
objetiva. Cuando la abertura se abre demasiado, la luz
parásita generada por la refracción de los rayos de luz
oblicuas de la muestra puede causar deslumbramiento y
bajar el contraste general.Por otro lado, cuando la abertura
se cierra demasiado lejos, el cono de iluminación es
insuficiente para proporcionar una resolución adecuada y
la imagen se distorsiona debido a la refracción y la
difracción de la muestra.
Sistemas de condensador
El condensador subetapa recoge la luz de la fuente de
luz del microscopio y la concentra en un cono de luz que
ilumina la muestra con rayos paralelos de intensidad
uniforme de todos los acimutes largo de todo el viewfield.
Es crítico que el cono de luz de condensador se puede
modificar adecuadamente para optimizar la intensidad y el
ángulo de luz que entra en la lente delantera del objetivo.
Cada vez que se cambia un objetivo, un ajuste
correspondiente se debe realizar en el condensador
subetapa diafragma de apertura para proporcionar el cono
de luz adecuada para la apertura numérica del nuevo
objetivo.
Un simple condensador Abbe de dos lentes se ilustra
en la Figura 12. En esta figura, la luz de la fuente de
iluminación del microscopio pasa a través de la abertura o
de condensador de diafragma, situado en la base del
condensador, y se concentra por elementos de lentes
internas, que luego de proyectos luz a través de la muestra
en haces paralelos de cada acimut. El tamaño y la apertura
numérica del cono de luz se determina mediante el ajuste
del diafragma de apertura. Después de pasara través de la
muestra (en el portaobjetos de microscopio), la luz diverge
a un cono invertido con el ángulo apropiado (2q en la
Figura 12) para llenar la lente frontal del objetivo (2, 18-
24).
ajuste de aperturay enfoque correctodelcondensadorson
de importancia crítica en la realización de todo el potencial
delobjetivo.Específicamente,elusoapropiadodeldiafragma
de apertura regulable (incorporado en elcondensadoro justo
debajo de él) es más importante en la obtención de
iluminación correcta,elcontraste yprofundidaddecampo.La
apertura y cierre de este diafragma iris controla el ángulo de
los rayos de iluminación (y porlo tanto la abertura)que pasan
a través delcondensador,a través de la muestra y luego en el
objetivo. la altura del condensador es controlado por un
sistema de engranajes de piñóny cremallera que permite que
el condensador

La Figura 12. Condensador / configuración objetiva para
microscopía óptica. Un condensador de dos lentes Abbe se
ilustra mostrando trazas de rayos a través del tren óptico del
microscopio. El diafragma de aperturarestringe luz que entra en
el condensador antes de que se refracta por el sistema de lente
condensadora en el espécimen. Aceite de inmersión se utiliza en
el contacto debajo de laparte inferior de la corredera y la lente
de la parte superior del condensador, y también entre el
deslizamiento objetivo y la tapa. La abertura angular objetivo ()
controla la cantidad de luz que entra en el objetivo.
El más simple y menos corregida (también el menos
caro) condensador es el condensador de Abbe que, en su
forma más simple, tiene dos elementos de lentes ópticas
que producen una imagen del diafragma de campo
iluminado que
19

No es aguda y está rodeado por el color azul y rojo en los
bordes. Como resultado de poco corrección óptica, el
condensador Abbe es adecuado principalmente para la
observación de rutina con objetivos de modesta apertura
numérica y magnificación. Las principales ventajas del
condensadorAbbe son la gran cono de iluminación que el
condensadores capaz de producir, así como su capacidad
de trabajar con objetivos de larga distancia de trabajo. Los
fabricantes suministran la mayoría de los microscopios
con un condensadorde Abbe como predeterminada y estos
condensadores son caballos de batalla reales para el uso
rutinario de laboratorio.
Tabla 7 Las correcciones de aberración de condensador
Condensador aberraciones
Tipo corregido
Esférico Cromático
Abate - -
Aplanético X -
Acromático - X
Aplanético- X X
acromático
El siguiente nivel más alto de corrección condensador
se divide entre los condensadores aplanáticos y
acromáticos que se corrigen exclusivamente para ya sea
esférica (aplanático) o cromáticas (acromáticos)
aberraciones ópticas.
condensadores acromáticos contener típicamente
cuatro elementos de lente y tienen una apertura numérica
de 0.95, el más alto nivel posible sin necesidad de aceite
de inmersión (5). Este condensador es útil tanto para el
análisis de laboratorio de rutina y crítico con objetivos
secos y también para blanco y negro o en color
fotomicrografía.
Un factor crítico en la elección de condensadores
substage es el rendimiento apertura numérica, que será
necesario proporcionar un cono de iluminación adecuado
para los objetivos. La capacidad de apertura numérica del
condensadordebe serigual o ligeramente menor que la de
la más alta apertura numérica objetiva. Por lo tanto, si el
mayor objetivo de ampliación es un objetivo de inmersión
en aceite con una apertura numérica de 1,40, entonces el
condensador de platina inferior también debe tener una
apertura numérica equivalente a mantener la resolución
del sistema más alta. En este caso, aceite de inmersión
tendría que ser aplicada entre la lente superior del
condensador en contacto con la cara inferior del
portaobjetos de microscopio para lograr la abertura
destinada numérico (1,40) y la resolución. Si no se utiliza
aceite de restringirá la más alta apertura numérica del
sistema a 1,0,
condensadores aplanático son bien corregidos para
esférica

Articulo bueno en word.en.es

Recomendados

Recomendados

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

La actualidad más candente (20)

Similar a Articulo bueno en word.en.es

Similar a Articulo bueno en word.en.es (20)

Último

Último (20)

Articulo bueno en word.en.es