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COLEGIO MEXICO SECUNDARIA11REPRODUCCIÓNCarlos Daniel Vega Hernandez                                                            Alfonso Luna Castro                                                                       Ramon Aguilar Velasco                                                                        Jared Alfonso Arce Rodriguez                                                     Alan Escamilla Castro<br />Experimentos<br />Objetivo: Conocer y observar de que trata la ductibilidad al elaborar un similar de piedra colisa. Conocer y comprender la tensión superficial que existe en diferentes líquidos de acuerdo con su densidad.<br />Hipótesis: ¿Aprenderé las características del similar de piedra colisa?, ¿Podrá observarse claramente la tensión superficial que se crea entre líquidos con diferente densidad?<br />Material para el similar de piedra caliza (1):° Maizena° Agua° Colorante vegetal° Recipiente mediano° Una espátula<br />Material para la tensión superficial (2):° 3 frascos transparentes° Un agitador° Agua ° Alcohol° Aceite<br />Procedimiento (1):<br />1.-En el recipiente debemos poner 500 ml de agua 2.-Agregar 11/2 kg de maizena y mezclarlo muy bien con la espátula3.-Poner un poco de colorante vegetal.<br />Procedimiento (2):<br />1.- Poner en un frasco agua, aceite y alcohol2.- En el segundo frasco los mismos ingredientes, pero ahora agitados.3.- Y por ultimo en un frasco detergente.<br />Observaciones: <br />81915191770<br />Piedra caliza<br />http://www.youtube.com/watch?v=QGz7V59JBeg&feature=related<br />http://www.youtube.com/watch?v=4KzuezE82js&feature=related <br />-4191093345<br />      Tensión superficial<br />http://www.youtube.com/watch?v=yiz_NRO0lP0 <br />PRÁCTICA # 8<br />“TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y <br />ESTUDIO DE BACTERIAS” <br />INTRODUCCIÓN <br />Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad. <br />La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio. <br />OBJETIVOS: <br />Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones.<br />Organizar el material para su fácil manejo e identificación.<br />Manipular adecuadamente los cultivos puros.<br />Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos.<br />Identificar y describir correctamente las características culturales y microscópicas de algunas bacterias.Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscópico y microscópico de bacterias.<br />MARCO TEÓRICO: <br />Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro oaxénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. <br />Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Unclon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. <br />Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar. <br />      PROCEDIMIENTO:<br />Primero dejar encendido el mechero de bunsen para esterilizar el asa<br />Esterilizar el asa después tomar una muestra del microorganismo <br />Cerrar la caja petri para evitar otra contaminación y final mente repetir procedimiento<br />  El siguiente video nos muestra el procedimiento del sembrado…………<br />                             http://www.youtube.com/watch?v=1Zu6HHcEXSA&feature=related<br />ESQUEMAS Y OBSERVACIONES: (a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con sólo unos pocos <br />cientos de bacterias <br />(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una placa Petri. <br />(c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su superficie (más <br />grandes). <br />Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo axénico: <br />(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y<br />(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas. <br />(e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, <br />repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa. <br />El crecimiento de los cultivos axénicos <br />Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, líquido o sólido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos se hacen generalmente, añadiendo agar a los líquidos. <br />Tipos de medios de cultivo <br />El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está cultivando y el porqué de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos-diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composición y uso. <br />Medios definidos <br />Un medio definido es aquel del cual conocemos su composición química exacta, porque ha sido preparado a <br />partir de compuestos químicos puros. Echerichia coli es capaz de crecer en un medio químicamente definido, de <br />4 <br />composición bastante sencilla. Este microorganismo requiere una fuente de carbono orgánica (por ejemplo, glucosa), pero puede obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de sales minerales. En cambio, otros organismos, denominadosexigentes, requieren medios químicamente muy complejos. Por ejemplo, la bacteria <br />Leuconostoc citrovorum es extraordinariamente exigente ya que requiere un medio con muchos ingredientes. Los <br />medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse. <br />Medios complejos <br />Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo. Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, caseína (la proteína de la leche), levaduras o soja. Un medio líquido complejo se denominacaldo. La caseína u otras proteínas que se añaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio ácido, para hacerlas más solubles y, por tanto, más fáciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrólisis parcial rompe las proteínas en péptidos. Una hidrólisis total las degrada hasta aminoácidos. A las proteínas parcialmente hidrolizadas se les denominapeptonas. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosa-peptona, la triptona y la triptosa. A la caseína totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de caseína. <br />Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. También existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos específicos. Uno de estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que más se utiliza. Cuando este medio se solidifica con agar, se denomina agar nutritivo. Generalmente se prefiere la utilización de los medios complejos, ya que son fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos. <br />Medios selectivos <br />Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de <br />Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco <br />común. <br />Medios diferenciales <br />Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemólisis (muerte y lisis de los hematíes). Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. <br />Medios selectivos-diferenciales <br />Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas deSalmonella yShigella, bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas(Salmonella yShigella son Gram negativas). A partir de aquí, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante.Salmonella yShigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterías sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias serán rojas, mientras que las restantes no lo serán. <br />Medios de enriquecimiento <br />5 <br />Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una población mixta de gran tamaño. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirán el tratamiento y podrán crecer. Las bacterias lijadoras de nitrógeno pueden seleccionarse cultivando el inóculo de suelo en un medio libre de nitrógeno, donde sólo ellas podrán crecer porque obtienen el nitrógeno de la atmósfera. Los ecólogos microbianos usan frecuentemente medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto químico tóxico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la única fuente de carbono sea dicho compuesto. El microorganismo que prospere en él podrá ser utilizado en biorremediación. <br />Condiciones ambientales idóneas para el cultivo en el laboratorio <br />Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, también es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, según el caso, será aportado o eliminado. <br />Temperatura <br />Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento óptimo. Pero, en general, los microorganismos crecen más rápidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se dañan las proteínas. Así pues, para favorecer un crecimiento rápido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura más alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural. Escherichia coli la bacteria que más frecuentemente se utiliza en investigación, se encuentra en el intestino humano y de otros mamíferos. Este microorganismo crece óptimamente a 37ºC, la temperatura del cuerpo humano. <br />Los cultivos se mantienen a temperatura constante enincubadores o en baños de agua, <br />ambos controlados termostáticamente. Los incubadores, o estufas, son cámaras con aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos sólidos como líquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas Petri, tubos de ensayo, o matraces. Los medios líquidos, distribuidos en tubos o matraces, también pueden ser incubados en baños de agua caliente. Estos baños resultan cómodos para incubar los cultivos que tienen que manipularse con frecuencia, en la misma mesa de trabajo. <br />pH <br />El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH próximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a 7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0. <br />Aunque el pH de un medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente algún componente ácido o básico del medio; o bien, porque algún producto de su metabolismo es un ácido o una base. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones. En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales naturales actúan como tampones débiles. Los tampones más eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato cálcico. Ambos se añaden normalmente como nutrientes (fuente de fósforo y calcio); pero si se desea que actúen como tampones se precisarán cantidades mayores. <br />Oxígeno <br />La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para el crecimiento bacteriano. Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos, no pueden vivir sin oxígeno porque lo necesitan para obtener energía. Otros microorganismos, llamados anaerobios estrictos, no pueden vivir en presencia de oxígeno, para ellos es un agente tóxico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los <br />anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su ausencia. Los anaerobios <br />facultativos utilizan el oxígeno si disponen de él, pero también pueden crecer sin él. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxígeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismosmicroaerófilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno; las altas tensiones, como las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendrá que suministrar, restringir o eliminar el oxígeno. <br />Suministrar oxígeno a las bacterias que lo necesitan para crecer, o que crecen más rápidamente en su presencia, representa una dificultad técnica. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de oxígeno de la atmósfera, aunque el interior de toda colonia es completamente <br />6 <br />anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios líquidos es más difícil, porque no existe demasiado oxígeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rápidamente. Todos los cultivos líquidos con más de uno o dos centímetros de profundidad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a través del cultivo o agitándolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de microbiología existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotación o a una agitación de vaivén, que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxígeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se utilizan para producir antibióticos, es un desafió para la ingeniería. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a través de ellos enormes cantidades de aire. <br />La exclusión del oxígeno del ambiente de los anaerobios también plantea problemas técnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxígeno, sí el medio contiene un compuesto químico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato, <br />que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxígeno. Los anaerobios también pueden cultivarse en placas Petri, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se haya eliminado totalmente el oxígeno y se haya reemplazado por un gas inerte como nitrógeno o argón. También se puede llevar a cabo una eliminación química del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrógeno cuando se les añade agua; el hidrógeno reacciona con el oxígeno en presencia de un catalizador; la reacción consume el oxígeno produciendo agua. Un método muy sencillo para disminuir la concentración de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhídrido carbónico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo herméticamente; la vela consumirá oxígeno hasta que se extinga. Esta técnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del ácido láctico. También ha sido utilizada para microacrófilos, especialmente cuando el dióxido de carbono les favorece. <br />Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposición al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal herméticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para añadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrógeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren técnicas más elaboradas. Es frecuente el uso de cámaras libres de oxígeno, <br />en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas. Algunos laboratorios tienen habitaciones libres de oxígeno, donde los técnicos trabajan con máscaras de oxígeno. <br />Conservación de los cultivos axénicos <br />Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con él o intercambiarlo con otros científicos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro también puede mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de colección. <br />Muchos laboratorios poseen una colección de cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un número enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbiólogos. Existen muchas técnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecación (eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura. <br />Los cultivos generalmente se desecan porliofili zación (congelación y desecación). El método consiste en lo siguiente: el cultivo líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada para proteger las células durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vació para su sublimación (eliminación del agua congelada). Durante el proceso de sublimación las células permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras aún se mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente. <br />Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrógeno líquido o en unultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas. <br />Observación de las bacterias: <br />a) Observación macroscópica: El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias <br />que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de características que nos ayudan a su identificación. A nivel morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio líquido las bacterias producen modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc. <br />7 <br />b) Observación microscópica: Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son incoloras, la única forma de <br />observarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teñido con colorantes o mediante la disposición de una óptica especial de contraste, generalmente de fases, en el microscopio. <br />Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su fijación. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando en una gota de agua una porción de células crecidas en sólido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijación por calor se procede a la tinción. <br />CUADRO DE CARÁCTERÍSTICAS DE BACTERIAS PATÓGENAS: <br />GÉNERO Y <br />ESPECIE <br />MACROSCÓPICAS <br />MICROSCÓPICAS <br />TINTORIALES <br />Micrococcus <br />luteus <br />Aerobio <br />estricto, <br />coagulasa negativa, forma colonias amarillo brillantes en agar nutritivo <br />cocos <br />Gram + <br />Escherichia Coli <br />Móviles, aerobias, anaerobias facultativas, mesòfilas, pH 6-8, indol, lactosa y glucosa positivo <br />Bacilos, <br />capsula <br />o <br />microcápsula, <br />flagelos <br />perìtricos <br />Gram - <br />Pseudomona <br />aeruginosa <br />Móviles, colonias gris con brillo metálico, aroma semejante a uva fermentada <br />Bacilos, un flagelo polar o un mechón de 2 a 3 flagelos, pillis <br />Gram - <br />Staphylococcus <br />aureus <br />Inmóviles, colonias pequeñas, <br />circulares, <br />borde <br />continuo, cremosas, anaerobios facultativos, fermentadores de maltosa, lactosa, glucosa, manitol, producción de ácido láctico, catalasa <br />Cocos, racimos o cadenas <br />cortas, 0.7 a 1.2 micras <br />Gram + <br />Streptococcus spInmóviles, colonias elevadas, lisas, <br />circulares, aerobio y anaerobio <br />facultativo <br />Cocos <br />en <br />racimos, <br />capsuladas <br />Gram + <br />Bacillus anthracisMóviles o inmóviles, esporulados, <br />aerobios <br />bacilos <br />Gram+ <br />Bacillus cereus <br />Aerobio o anaerobio facultativo, móvil, hidroliza la lecitina de huevo y no fermenta el manitol <br />Bacilos esporulado <br />Gram + <br />Bacillus subtilis <br />Catalasa +, aerobio <br />Bacilos que esporulan <br />Gram + <br />Yersinia pestis <br />inmóviles, aerobios, anaerobios facultativos, fermentadores, ureasa y catalasa+, en ocasiones prod gas <br />Bacilos con extremos <br />redondeados, <br />flagelos perìtricos o anfitricos, pillis, cápsula de poco espesor <br />Gram - <br />Mycobacterium <br />leprae <br />No se puede cultivar in Vitro, <br />inmóvil <br />Bacilo delgado recto, en <br />empalizada o haces <br />Ácido alcohol resistente <br />Gram.+ <br />Kleibsella <br />pneumoniae <br />Inmóviles, aerobios, anaerobios <br />facultativos, <br />fermentadores <br />y <br />catalasa+, prod. gas <br />Bacilos capsulados <br />Gram - <br />Clostridium tetaniMóviles, <br />colonias <br />brillantes, traslucidas, gris amarillas borde irregular <br />rizoide, <br />anaerobios estrictos, pH 7.2-7.6 T 37ºC, prod gas y olor desagradable <br />Bacilos solos en cadena o pares, flagelos perìtricos, prod esporas redondas terminales <br />Gram + <br />Clostridium <br />botullinum <br />Colonias pequeñas, traslucidas, borde filamentoso, centro opaco, blanco <br />grisáceo, <br />anaerobios <br />estrictos <br />Bacilos <br />aislados <br />en parejas o cadenas cortas, flagelos perìtricos <br />Gram + <br />Mycobacterium <br />Forman un pigmento amarillo en bacilo delgado, extremos Acido-alcohol resistente, <br />8 <br />tuberculosis <br />incubación, aerobios estrictos <br />redondeados <br />Gram.+ <br />Nocardia <br />Microaerofìlicos, <br />anaerobios, <br />fermentadores + <br />Bacilos y cocobacilos <br />Gram +; débilmente <br />acido-alcohol resistentes <br />Salmonella TyphiMóviles, colonias grandes de 2 a <br />4mm rugosas o lisas, aerobios, anaerobios facultativos, mesòfilos, fermentadores, prod. H2SO4 <br />Bacilos, flagelos perìtricos <br />no esporulados <br />Gram - <br />Shigella <br />dysenteriae <br />Inmóvil, colonias redondas 2mm, convexas, transparentes, aerobios, anaerobios facultativos, glucosa + indol+ o - <br />bacilos <br />Gram - <br />Chlamydia <br />trachomatis <br />Inmóviles, filtrables <br />cocoides <br />Gram - ; tinción con giemsa, castañeda o machiavello <br />Brucella sp <br />Inmóviles, <br />aerobio, <br />catalasa, <br />oxidasa y ureasa positivos <br />Bacilos <br />cortos; <br />cocobacilos <br />Gram - <br />Neisseria <br />gonnorrhoeae <br />Inmóviles, aerobios, anaerobios facultativos, pH de 6 a 8, oxidasa y glucosa positiva <br />Cocos <br />en <br />pares, capsulados de 0.6 a 1micra <br />Gram - <br />Streptococcus <br />pyogenes <br />Inmóviles, colonias en forma de disco, mucosas, mate, lisas o rugosas con hemólisis alrededor, anaerobios facultativos, producen ácido láctico <br />Cocos en cadena, 0.5 a <br />2mm <br />Gram+ <br />Rickettsia <br />pallidum <br />Inmóviles, intracelulares obligados <br />Bacilos o cocobacilos, pared formada por 3 capas a manera de cápsula, <br />cubierta <br />mucilaginosa <br />Gram - ; tinción con Giemsa, Machiavello o Jiménez <br />Vibrio Cholerae <br />Móvil, <br />aerobio, <br />anaerobio facultativo, sensible a la acidez, catalasa, indol, oxidasa, rojo de metilo, sacarosa y fermentador + <br />Bacilo curvo, un flagelo <br />polar <br />Gram - <br />Corynebacterium <br />diphtheriae <br />Aerobio <br />y <br />microaerofìlico, <br />inmóviles, <br />catalasa <br />+ <br />fermentadores + T 35ºC pH 7.6 <br />Bacilo en forma de basto con uno de sus extremos más angosto, agrupación en empalizadas. <br />Gram +; la tinción no es uniforme debido a los gránulos que contiene en su citoplasma, que se tiñen más intensamente <br />MATERIAL: <br />Pipeta <br />pasteur <br />estéril <br />4 tubos con <br />caldo <br />4 tubos con medio SIM <br />2 mecheros <br />Asa y portasa <br />Etiquetas o marcador <br />∗Cultivos de las siguientes bacterias: <br />ξEscherichia coli <br />ξBacillus Subtillis <br />ξStaphylococcus Aureus <br />ξStreptococcus <br />Faecallis <br />ξPseudomona <br />Aureginosa <br />ξStaphylococcus <br />Epidermis <br />MÉTODOLOGÍA: <br />o <br />Limpiar y esterilizar el área de trabajo <br />o <br />Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que esta presente un cono azul bien marcado. <br />o <br />Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo. <br />o <br />Marcar los tubos con iniciales de la cepa a sembrar y fecha. <br />a) Siembra en medio líquido: <br />Transferir asépticamente, con el asa de siembra, una <br />pequeña muestra de los microorganismos, desde el tubo <br />9<br />CITRICOVERDURA<br />TORTILLA<br />
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REPRODUCCIÓN 2

  • 1. COLEGIO MEXICO SECUNDARIA11REPRODUCCIÓNCarlos Daniel Vega Hernandez Alfonso Luna Castro Ramon Aguilar Velasco Jared Alfonso Arce Rodriguez Alan Escamilla Castro<br />Experimentos<br />Objetivo: Conocer y observar de que trata la ductibilidad al elaborar un similar de piedra colisa. Conocer y comprender la tensión superficial que existe en diferentes líquidos de acuerdo con su densidad.<br />Hipótesis: ¿Aprenderé las características del similar de piedra colisa?, ¿Podrá observarse claramente la tensión superficial que se crea entre líquidos con diferente densidad?<br />Material para el similar de piedra caliza (1):° Maizena° Agua° Colorante vegetal° Recipiente mediano° Una espátula<br />Material para la tensión superficial (2):° 3 frascos transparentes° Un agitador° Agua ° Alcohol° Aceite<br />Procedimiento (1):<br />1.-En el recipiente debemos poner 500 ml de agua 2.-Agregar 11/2 kg de maizena y mezclarlo muy bien con la espátula3.-Poner un poco de colorante vegetal.<br />Procedimiento (2):<br />1.- Poner en un frasco agua, aceite y alcohol2.- En el segundo frasco los mismos ingredientes, pero ahora agitados.3.- Y por ultimo en un frasco detergente.<br />Observaciones: <br />81915191770<br />Piedra caliza<br />http://www.youtube.com/watch?v=QGz7V59JBeg&feature=related<br />http://www.youtube.com/watch?v=4KzuezE82js&feature=related <br />-4191093345<br /> Tensión superficial<br />http://www.youtube.com/watch?v=yiz_NRO0lP0 <br />PRÁCTICA # 8<br />“TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y <br />ESTUDIO DE BACTERIAS” <br />INTRODUCCIÓN <br />Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad. <br />La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio. <br />OBJETIVOS: <br />Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones.<br />Organizar el material para su fácil manejo e identificación.<br />Manipular adecuadamente los cultivos puros.<br />Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos.<br />Identificar y describir correctamente las características culturales y microscópicas de algunas bacterias.Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscópico y microscópico de bacterias.<br />MARCO TEÓRICO: <br />Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro oaxénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. <br />Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Unclon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. <br />Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar. <br /> PROCEDIMIENTO:<br />Primero dejar encendido el mechero de bunsen para esterilizar el asa<br />Esterilizar el asa después tomar una muestra del microorganismo <br />Cerrar la caja petri para evitar otra contaminación y final mente repetir procedimiento<br /> El siguiente video nos muestra el procedimiento del sembrado…………<br /> http://www.youtube.com/watch?v=1Zu6HHcEXSA&feature=related<br />ESQUEMAS Y OBSERVACIONES: (a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con sólo unos pocos <br />cientos de bacterias <br />(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una placa Petri. <br />(c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su superficie (más <br />grandes). <br />Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo axénico: <br />(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y<br />(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas. <br />(e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, <br />repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa. <br />El crecimiento de los cultivos axénicos <br />Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, líquido o sólido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos se hacen generalmente, añadiendo agar a los líquidos. <br />Tipos de medios de cultivo <br />El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está cultivando y el porqué de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos-diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composición y uso. <br />Medios definidos <br />Un medio definido es aquel del cual conocemos su composición química exacta, porque ha sido preparado a <br />partir de compuestos químicos puros. Echerichia coli es capaz de crecer en un medio químicamente definido, de <br />4 <br />composición bastante sencilla. Este microorganismo requiere una fuente de carbono orgánica (por ejemplo, glucosa), pero puede obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de sales minerales. En cambio, otros organismos, denominadosexigentes, requieren medios químicamente muy complejos. Por ejemplo, la bacteria <br />Leuconostoc citrovorum es extraordinariamente exigente ya que requiere un medio con muchos ingredientes. Los <br />medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse. <br />Medios complejos <br />Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo. Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, caseína (la proteína de la leche), levaduras o soja. Un medio líquido complejo se denominacaldo. La caseína u otras proteínas que se añaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio ácido, para hacerlas más solubles y, por tanto, más fáciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrólisis parcial rompe las proteínas en péptidos. Una hidrólisis total las degrada hasta aminoácidos. A las proteínas parcialmente hidrolizadas se les denominapeptonas. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosa-peptona, la triptona y la triptosa. A la caseína totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de caseína. <br />Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. También existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos específicos. Uno de estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que más se utiliza. Cuando este medio se solidifica con agar, se denomina agar nutritivo. Generalmente se prefiere la utilización de los medios complejos, ya que son fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos. <br />Medios selectivos <br />Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de <br />Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco <br />común. <br />Medios diferenciales <br />Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemólisis (muerte y lisis de los hematíes). Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. <br />Medios selectivos-diferenciales <br />Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas deSalmonella yShigella, bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas(Salmonella yShigella son Gram negativas). A partir de aquí, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante.Salmonella yShigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterías sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias serán rojas, mientras que las restantes no lo serán. <br />Medios de enriquecimiento <br />5 <br />Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una población mixta de gran tamaño. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirán el tratamiento y podrán crecer. Las bacterias lijadoras de nitrógeno pueden seleccionarse cultivando el inóculo de suelo en un medio libre de nitrógeno, donde sólo ellas podrán crecer porque obtienen el nitrógeno de la atmósfera. Los ecólogos microbianos usan frecuentemente medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto químico tóxico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la única fuente de carbono sea dicho compuesto. El microorganismo que prospere en él podrá ser utilizado en biorremediación. <br />Condiciones ambientales idóneas para el cultivo en el laboratorio <br />Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, también es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, según el caso, será aportado o eliminado. <br />Temperatura <br />Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento óptimo. Pero, en general, los microorganismos crecen más rápidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se dañan las proteínas. Así pues, para favorecer un crecimiento rápido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura más alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural. Escherichia coli la bacteria que más frecuentemente se utiliza en investigación, se encuentra en el intestino humano y de otros mamíferos. Este microorganismo crece óptimamente a 37ºC, la temperatura del cuerpo humano. <br />Los cultivos se mantienen a temperatura constante enincubadores o en baños de agua, <br />ambos controlados termostáticamente. Los incubadores, o estufas, son cámaras con aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos sólidos como líquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas Petri, tubos de ensayo, o matraces. Los medios líquidos, distribuidos en tubos o matraces, también pueden ser incubados en baños de agua caliente. Estos baños resultan cómodos para incubar los cultivos que tienen que manipularse con frecuencia, en la misma mesa de trabajo. <br />pH <br />El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH próximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a 7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0. <br />Aunque el pH de un medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente algún componente ácido o básico del medio; o bien, porque algún producto de su metabolismo es un ácido o una base. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones. En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales naturales actúan como tampones débiles. Los tampones más eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato cálcico. Ambos se añaden normalmente como nutrientes (fuente de fósforo y calcio); pero si se desea que actúen como tampones se precisarán cantidades mayores. <br />Oxígeno <br />La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para el crecimiento bacteriano. Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos, no pueden vivir sin oxígeno porque lo necesitan para obtener energía. Otros microorganismos, llamados anaerobios estrictos, no pueden vivir en presencia de oxígeno, para ellos es un agente tóxico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los <br />anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su ausencia. Los anaerobios <br />facultativos utilizan el oxígeno si disponen de él, pero también pueden crecer sin él. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxígeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismosmicroaerófilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno; las altas tensiones, como las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendrá que suministrar, restringir o eliminar el oxígeno. <br />Suministrar oxígeno a las bacterias que lo necesitan para crecer, o que crecen más rápidamente en su presencia, representa una dificultad técnica. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de oxígeno de la atmósfera, aunque el interior de toda colonia es completamente <br />6 <br />anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios líquidos es más difícil, porque no existe demasiado oxígeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rápidamente. Todos los cultivos líquidos con más de uno o dos centímetros de profundidad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a través del cultivo o agitándolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de microbiología existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotación o a una agitación de vaivén, que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxígeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se utilizan para producir antibióticos, es un desafió para la ingeniería. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a través de ellos enormes cantidades de aire. <br />La exclusión del oxígeno del ambiente de los anaerobios también plantea problemas técnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxígeno, sí el medio contiene un compuesto químico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato, <br />que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxígeno. Los anaerobios también pueden cultivarse en placas Petri, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se haya eliminado totalmente el oxígeno y se haya reemplazado por un gas inerte como nitrógeno o argón. También se puede llevar a cabo una eliminación química del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrógeno cuando se les añade agua; el hidrógeno reacciona con el oxígeno en presencia de un catalizador; la reacción consume el oxígeno produciendo agua. Un método muy sencillo para disminuir la concentración de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhídrido carbónico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo herméticamente; la vela consumirá oxígeno hasta que se extinga. Esta técnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del ácido láctico. También ha sido utilizada para microacrófilos, especialmente cuando el dióxido de carbono les favorece. <br />Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposición al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal herméticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para añadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrógeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren técnicas más elaboradas. Es frecuente el uso de cámaras libres de oxígeno, <br />en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas. Algunos laboratorios tienen habitaciones libres de oxígeno, donde los técnicos trabajan con máscaras de oxígeno. <br />Conservación de los cultivos axénicos <br />Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con él o intercambiarlo con otros científicos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro también puede mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de colección. <br />Muchos laboratorios poseen una colección de cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un número enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbiólogos. Existen muchas técnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecación (eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura. <br />Los cultivos generalmente se desecan porliofili zación (congelación y desecación). El método consiste en lo siguiente: el cultivo líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada para proteger las células durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vació para su sublimación (eliminación del agua congelada). Durante el proceso de sublimación las células permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras aún se mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente. <br />Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrógeno líquido o en unultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas. <br />Observación de las bacterias: <br />a) Observación macroscópica: El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias <br />que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de características que nos ayudan a su identificación. A nivel morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio líquido las bacterias producen modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc. <br />7 <br />b) Observación microscópica: Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son incoloras, la única forma de <br />observarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teñido con colorantes o mediante la disposición de una óptica especial de contraste, generalmente de fases, en el microscopio. <br />Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su fijación. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando en una gota de agua una porción de células crecidas en sólido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijación por calor se procede a la tinción. <br />CUADRO DE CARÁCTERÍSTICAS DE BACTERIAS PATÓGENAS: <br />GÉNERO Y <br />ESPECIE <br />MACROSCÓPICAS <br />MICROSCÓPICAS <br />TINTORIALES <br />Micrococcus <br />luteus <br />Aerobio <br />estricto, <br />coagulasa negativa, forma colonias amarillo brillantes en agar nutritivo <br />cocos <br />Gram + <br />Escherichia Coli <br />Móviles, aerobias, anaerobias facultativas, mesòfilas, pH 6-8, indol, lactosa y glucosa positivo <br />Bacilos, <br />capsula <br />o <br />microcápsula, <br />flagelos <br />perìtricos <br />Gram - <br />Pseudomona <br />aeruginosa <br />Móviles, colonias gris con brillo metálico, aroma semejante a uva fermentada <br />Bacilos, un flagelo polar o un mechón de 2 a 3 flagelos, pillis <br />Gram - <br />Staphylococcus <br />aureus <br />Inmóviles, colonias pequeñas, <br />circulares, <br />borde <br />continuo, cremosas, anaerobios facultativos, fermentadores de maltosa, lactosa, glucosa, manitol, producción de ácido láctico, catalasa <br />Cocos, racimos o cadenas <br />cortas, 0.7 a 1.2 micras <br />Gram + <br />Streptococcus spInmóviles, colonias elevadas, lisas, <br />circulares, aerobio y anaerobio <br />facultativo <br />Cocos <br />en <br />racimos, <br />capsuladas <br />Gram + <br />Bacillus anthracisMóviles o inmóviles, esporulados, <br />aerobios <br />bacilos <br />Gram+ <br />Bacillus cereus <br />Aerobio o anaerobio facultativo, móvil, hidroliza la lecitina de huevo y no fermenta el manitol <br />Bacilos esporulado <br />Gram + <br />Bacillus subtilis <br />Catalasa +, aerobio <br />Bacilos que esporulan <br />Gram + <br />Yersinia pestis <br />inmóviles, aerobios, anaerobios facultativos, fermentadores, ureasa y catalasa+, en ocasiones prod gas <br />Bacilos con extremos <br />redondeados, <br />flagelos perìtricos o anfitricos, pillis, cápsula de poco espesor <br />Gram - <br />Mycobacterium <br />leprae <br />No se puede cultivar in Vitro, <br />inmóvil <br />Bacilo delgado recto, en <br />empalizada o haces <br />Ácido alcohol resistente <br />Gram.+ <br />Kleibsella <br />pneumoniae <br />Inmóviles, aerobios, anaerobios <br />facultativos, <br />fermentadores <br />y <br />catalasa+, prod. gas <br />Bacilos capsulados <br />Gram - <br />Clostridium tetaniMóviles, <br />colonias <br />brillantes, traslucidas, gris amarillas borde irregular <br />rizoide, <br />anaerobios estrictos, pH 7.2-7.6 T 37ºC, prod gas y olor desagradable <br />Bacilos solos en cadena o pares, flagelos perìtricos, prod esporas redondas terminales <br />Gram + <br />Clostridium <br />botullinum <br />Colonias pequeñas, traslucidas, borde filamentoso, centro opaco, blanco <br />grisáceo, <br />anaerobios <br />estrictos <br />Bacilos <br />aislados <br />en parejas o cadenas cortas, flagelos perìtricos <br />Gram + <br />Mycobacterium <br />Forman un pigmento amarillo en bacilo delgado, extremos Acido-alcohol resistente, <br />8 <br />tuberculosis <br />incubación, aerobios estrictos <br />redondeados <br />Gram.+ <br />Nocardia <br />Microaerofìlicos, <br />anaerobios, <br />fermentadores + <br />Bacilos y cocobacilos <br />Gram +; débilmente <br />acido-alcohol resistentes <br />Salmonella TyphiMóviles, colonias grandes de 2 a <br />4mm rugosas o lisas, aerobios, anaerobios facultativos, mesòfilos, fermentadores, prod. H2SO4 <br />Bacilos, flagelos perìtricos <br />no esporulados <br />Gram - <br />Shigella <br />dysenteriae <br />Inmóvil, colonias redondas 2mm, convexas, transparentes, aerobios, anaerobios facultativos, glucosa + indol+ o - <br />bacilos <br />Gram - <br />Chlamydia <br />trachomatis <br />Inmóviles, filtrables <br />cocoides <br />Gram - ; tinción con giemsa, castañeda o machiavello <br />Brucella sp <br />Inmóviles, <br />aerobio, <br />catalasa, <br />oxidasa y ureasa positivos <br />Bacilos <br />cortos; <br />cocobacilos <br />Gram - <br />Neisseria <br />gonnorrhoeae <br />Inmóviles, aerobios, anaerobios facultativos, pH de 6 a 8, oxidasa y glucosa positiva <br />Cocos <br />en <br />pares, capsulados de 0.6 a 1micra <br />Gram - <br />Streptococcus <br />pyogenes <br />Inmóviles, colonias en forma de disco, mucosas, mate, lisas o rugosas con hemólisis alrededor, anaerobios facultativos, producen ácido láctico <br />Cocos en cadena, 0.5 a <br />2mm <br />Gram+ <br />Rickettsia <br />pallidum <br />Inmóviles, intracelulares obligados <br />Bacilos o cocobacilos, pared formada por 3 capas a manera de cápsula, <br />cubierta <br />mucilaginosa <br />Gram - ; tinción con Giemsa, Machiavello o Jiménez <br />Vibrio Cholerae <br />Móvil, <br />aerobio, <br />anaerobio facultativo, sensible a la acidez, catalasa, indol, oxidasa, rojo de metilo, sacarosa y fermentador + <br />Bacilo curvo, un flagelo <br />polar <br />Gram - <br />Corynebacterium <br />diphtheriae <br />Aerobio <br />y <br />microaerofìlico, <br />inmóviles, <br />catalasa <br />+ <br />fermentadores + T 35ºC pH 7.6 <br />Bacilo en forma de basto con uno de sus extremos más angosto, agrupación en empalizadas. <br />Gram +; la tinción no es uniforme debido a los gránulos que contiene en su citoplasma, que se tiñen más intensamente <br />MATERIAL: <br />Pipeta <br />pasteur <br />estéril <br />4 tubos con <br />caldo <br />4 tubos con medio SIM <br />2 mecheros <br />Asa y portasa <br />Etiquetas o marcador <br />∗Cultivos de las siguientes bacterias: <br />ξEscherichia coli <br />ξBacillus Subtillis <br />ξStaphylococcus Aureus <br />ξStreptococcus <br />Faecallis <br />ξPseudomona <br />Aureginosa <br />ξStaphylococcus <br />Epidermis <br />MÉTODOLOGÍA: <br />o <br />Limpiar y esterilizar el área de trabajo <br />o <br />Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que esta presente un cono azul bien marcado. <br />o <br />Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo. <br />o <br />Marcar los tubos con iniciales de la cepa a sembrar y fecha. <br />a) Siembra en medio líquido: <br />Transferir asépticamente, con el asa de siembra, una <br />pequeña muestra de los microorganismos, desde el tubo <br />9<br />CITRICOVERDURA<br />TORTILLA<br />