AISLAMIENTO Y RECUENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS

1. AISLAMIENTO Y RECUENTO DE
BACTERIAS ANAEROBIAS
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL
MICROBIOLOGÍA GENERAL

2. INTRODUCCIÓN
Capacidad de los microorganismos para crecer en presencia o
ausencia de oxigeno esta relacionada con su metabolismo.
Entre ellas están las bacterias aerobias y anaerobias.

3. BACTERIAS ANAEROBIAS CLASIFICACIÓN EN
BASE A LOS REQUERIMIENTOS Y TOLERANCIA
DE OXÍGENO
ANAEROBIOS
RELACIÓN
CON EL O2
TIPO DE METABOLISMO
Obligados Dañino o letal
Fermentación o respiración
anaerobia
Aerotolerantes No necesario Fermentación
Facultativos Indistinto Fermentación

4. FORMAS TÓXICAS DEL OXÍGENO
El O2 es un agente oxidante fuerte capaz de generar:
Singlete de Oxígeno 1O2
Superóxido O2
-
Peróxido O2
-2
Hidroxilo OH.
Los organismos que toleran el oxígeno tienen mecanismos protectores
(enzimas como la catalasa, peroxidasa y superóxido dismutasa)

5. CONSIDERACIONES DE PROCEDIMIENTOS
UTILIZADOS PARA EL AISLAMIENTO Y CULTIVO DE
ANAEROBIOS ESTRICTOS
• Adición de sustancias reductoras ( cisteína y tioglicolato de sodio)
• Uso de tapones de rosca, sellos de aceite mineral
• Calentamiento del medio de cultivo
• Sistema Gas Pak, Anaerogen
• Desplazamiento de 𝑂2 por otro gas (𝐻2, 𝑁2, 𝐶𝑂2).
• Uso de tubos de 150 mm de altura, conteniendo el medio hasta ¾ partes.

6. SISTEMAS GENERADORES DE ATMÓSFERAS
ANAEROBIAS

7. OBJETIVOS
• Conocer algunas técnicas y medios de cultivo para el aislamiento, recuento de
bacterias anaerobias.
• Observar el efecto de los diferentes potenciales oxidorreducción de los medios de
cultivo sobre el crecimiento de microorganismos aerobios.
• Estimar la población de microorganismos anaerobios estrictos por el método del
NMP.

8. AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS DE
MATERIA FECAL
Adicionar 1g de
muestra a tubo de
ensaye con 9ml de
agua destilada
Homogeneizar y
dejar sedimentar
Sembrar por
estría cruzada en
agar tioglicolato
Calentar el tubo
de muestra por
5min.
Dejar enfriar y
sedimentar
Sembrar una
placa de agar
tioglicolato
Colocar las placas
en una jarra de
anaerobiosis
Incubar a 37°C
48hrs.

9. AGAR TIOGLICOLATO
COMPONENTES g/L
Extracto de
levadura
5.0
Tripteina 15.0
Dextrosa 5.0
Cloruro de sodio 2.5
L-cisteína 0.5
Tioglicolato de
Sodio
0.3
Resazurina 0.001
Agar 0.75
Peptona es fuente de carbono y Nitrógeno

10. El propósito de calentar por 5 minutos los tubos que contenían la materia
fecal, era presenciar el crecimiento de esporas y poder observar en el
microscopio, eliminar todas las células vegetativas
TRATAMIENTO DE MUESTRA CON CALOR

11. CARACTERÍSTICA COLONIA 1 COLONIA 2 Clostridium sp.
Medio de cultivo Agar tioglicolato Agar tioglicolato Gelosa Sangre
Forma Circular Circular Irregular
Tamaño 5 mm 5 mm 9 mm
Color Blanco Blanco Grisáceo
Borde Lisa Lisa Irregular
Superficie Lisa Lisa Lisa
Elevación Convexa Convexa Plana
Luz trasmitida Traslucida Traslucida Opaca
Luz reflejada Brillante Brillante Mate
Aspecto Húmedo Húmedo Seco
Consistencia Suave Suave butirosa Butirosa
Acción sobre el medio ______ ______ β Hemolisis
MORFOLOGÍA COLONIAL

12. MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
Colonia 1. AT 1000. Bacilos Gram Positivo
Colonia 2 AT 1000X Bacilos Gram
positivo

13. MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
CARACTERÍSTIC
A
COLONIA 1 COLONIA 2 Clostridium
sp.
Forma Bacilos largos Bacilos largos Bacilos
Agrupación Aislado Empalizada Aislado
Tinción de Gram Positivo Positivo positivo
Presencia de
endosporas
No No No

14. CULTIVO EN LA JARRA DE ANAEROBIOSIS (SISTEMA
GAS PAK®)
Colocar 1 gota de
cultivo Clostridium
sp. en dos placas
GS
Y dos de agar
tioglicolato
Aislar por método
de estría cruzada
Colocar una placa
de GS y una de
tioglicolato en jarra
y aislar por estría
cruzada
Colocar dentro el
agente desecante,
y el indicador redox
Catalizador
Cerrar
inmediatamente
Incubar en
condiciones
aeróbicas las otras
2 placas como
testigos
Hacer frotis y teñir
por Gram

15. SISTEMA GAS-PAK
Genera H2 y CO2, con ayuda de unos sustratos que se encuentran en un
sobre agregando agua desencadenando la reacción.
NaBH4 + H2O  𝑁𝑎𝐵4 𝑂2 + 4 H2
C6H8O7 (aq) + 3NaHCO3 (s)  C6H5O7Na + 3 H2O + 3 CO2
2H2 + O2 Pd 2H2O

16. • La combinación de H2 y O2 para formar agua, genera la anaerobiosis
• Esta reacción se cataliza usando granallas de Zinc recubiertas de
Paladio.
• Una tira con indicador azul de metileno nos indica, azul en presencia
de O2, incoloro en ausencia.

18. ANAEROGEN
• El sistema generador de la anaerobiosis contiene
como componente activo el ácido ascórbico.
• Esta reacción con el oxígeno es exotérmica (65º C)

19. • MORFOLOGÍA COLONIAL DE
Clostridium sp EN AGAR
GELOSA SANGRE
Hemolisis Beta.
Las bacterias que tiene este
comportamiento producen estreptolisina
O y S y lisan todos los eritrocitos.
Figura. Medio de cultivo GS
Clostridium sp.

20. Figura. AT: 1000x Gram positivo. Clostridium sp.
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA DE
Clostridium sp.

21. ESTIMACIÓN DE CLOSTIDIUM SP. EN UNA MUESTRA
DE MATERIA FECAL POR NÚMERO MÁS PROBABLE.
Hacer diluciones decimales
hasta 10-³
Sembrar por triplicado 1ml de
c/dilución en tubos con 10ml de
leche-fierro c/sello de aceite
mineral
Incubar a 43°C 18 a 24hrs
Estimar NMP/g en la muestra
original usando tabla

22. LECHE HIERRO
• Leche descremada en polvo (2.5%)
• Caldo nutritivo 0.8%
• Sello con aceite mineral
• Hierro( tachuela)

23. FUNDAMENTO
• La presencia de caseína y lactosa, permite que en condiciones
anaeróbicas el microorganismo realice la fermentación, usando como
receptor final de electrones al Fe3+ reduciéndolo a Fe2+.
• Siendo que en condiciones acidas la caseína se precipite en forma de
coágulos por la desnaturalización a pH acido 4.6- 4.7

24. NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
• La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia, en
replicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de
microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes.
• El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de
ocurrencia de este atributo en diluciones seriadas y el uso de una
tabla probabilística.

26. CRECIMIENTO DE Clostridium sp. EN MEDIOS
LÍQUIDOS CON DIFERENTE POTENCIAL REDOX.

27. EQUIPO
L-3
NÚMERO
CARACTERÍSTICO
NMP/g ORIGEN DE
MATERIA FECAL
1 000 < 3 Vaca
2 320 93 Caballo
3 323 290 Llama
4 320 93 Borrego
5 200 9.1 Caballo
6 300 23 Caballo
EQUIPO
L-4
NÚMERO
CARACTERÍSTICO
NMP/g ORIGEN DE
MATERIA FECAL
1 211 20 Borrego
2 320 93 Caballo
3 000 < 3 Vaca
4 333  1100 Llama
5 000 < 3 Vaca
6 110 7.3 Vaca
ESTIMACIÓN DE Clostridium sp EN MATERIA FECAL
POR EL NMP

28. COMPARACIÓN DEL CRECIMIENTO EN MEDIOS
LÍQUIDOS DE DIFERENTE POTENCIAL REDOX DE;
CLOSTRIDIUM SP, ESCHERICHIA COLI Y BACILLUS
SUBTILIS
Se inoculo cada cepa
en el agar; caldo
nutritivo, caldo
tioglicolato y caldo
carne.
Se incubo a 37°C
durante 48hrs
Se observo el
crecimiento
1 2 3

29. CALDO NUTRITIVO
• No selectivo.
• Heterotróficos no exigentes.
COMPOSICIÓN g/L
Extracto de
carne
deshidratado
3
Peptona 5
pH 6.8

30. CALDO TIOGLICOLATO
• Microorganismos
anaerobios estrictos y
facultativos.
• Microaerofilicos
• Pruebas de esterilidad
COMPOSICIÓN g/L
Extracto de
levadura
5
Casitona 15
Dextrosa 5
Cloruro de sodio 2.5
L-cisteína 0.5
Ácido tioglicólico 0.3
Resazurina 0.001
pH 7.1

31. CALDO CARNE
• Bacterias anaerobias
COMPOSICIÓN g/L
Corazón de bovino 30
Proteosa peptona 20
Dextrosa 2
Cloruro de sodio 5
pH 7.2

32. Bacillus subtilis
• Gram positivo
• Catalasa-positiva
• Aerobio estricto
• Comúnmente encontrada en suelo
http://www.pure4green.com/en/about_pure/5/news/54/april_2011_bacillus_subtilis_in_fertiliser_sport_golf.aspx
Figura. Bacillus subtilis. InternetFigura. Crecimiento de Bacillus subtilis
Caldo: nutritivo, tioglicolato y carne

33. Clostridium sp. • Bacteria Gram positiva
• Anaerobia estricta
Figura. Crecimiento de Clostridium sp.
Caldo: nutritivo, tioglicolato y carne
Figura. Clostridium sp. Internet
https://www.slideshare.net/antares2000a/clostridium-y-bacillus-sp-micro

34. Escherichia coli
Figura. Crecimiento de Escherichia coli
Caldo: nutritivo, tioglicolato y carne
• Bacilo Gram negativo
• Anaerobia facultativa
• Enterobacteria (Tracto gastrointestinal)
Figura. Escherichia coli. Internet
bacteriainphotos.com/Escherichia%20coli%20light%20microscopy.html

35. RESULTADOS
BACTERIA/
CALDO
NUTRITIVO CARNE TIOGLICOLATO
Clostridium sp. - + +
Escherichia coli. + + +
Bacillus subtilis + - -
Crecimiento Positivo + Crecimiento Negativo -
Tabla. Comparación del crecimiento en medios líquidos de diferente potencial
oxidorreducción de Clostridium sp, Escherichia coli y Bacillus subtilis

36. CONCLUSIONES
El sistema Gas Pak nos permite mantener condiciones
anaeróbicas, para el cultivo y asilamiento de bacterias
anaerobias.

37. BIBLIOGRAFÍA
• Brock, Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap, David P. Clark; Biología de los
microorganismos; 12º Edición. Ed PEARSON Addison Wesley. 2009. págs. 187,188,482-
485,1009,1010.
• McFaddin. 1985. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria,
vol.1. Baltimore. pp.1568,1895-1897
• http://www.fmed.uba.ar/depto/microbiologia/catedra2/14_anaerobios_e_intraabdominales.pdf
(15/04/17)
• Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA,Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology,
EighthEdition. American Society for Microbiology,Washington, D.C.; 2003. pp.987-991