“Hidroxilamina como agente mutagénico para Neurospora crassa” “Inducción de mutantes en Escherichia coli”

1. Mutagénesis
“Hidroxilamina como agente mutagénico para
Neurospora crassa”
“Inducción de mutantes en Escherichia coli”
INSTITUTO POLITÉCNICO
NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LABORATORIO DE GENÉTICA MICROBIANA

2. Gen: Unidad fundamental de
la herencia que ocupa un
locus en un cromosoma
concreto. Secuencia de DNA
que codifica para un
polipéptido.
Cromosoma: molécula de
DNA o RNA que constituye el
genoma. Almacenan la
información genética.
Locus: lugar de un cromosoma
en donde se localiza un gen
Alelo: Formas alternativas de
un gen. Figura 1.Gen Eucariótico

3. Genoma: Conjunto de genes contenidos en los
cromosomas . Totalidad de la información genética.
Genotipo: Constitución genética de un organismo.
Fenotipo: Propiedades observables de un
organismo controladas genéticamente.
Haploide: Célula u organismo que tiene una sola
dotación de cromosomas .
Diploide: Célula u organismo con dos complementos
cromosómicos.
Merodiploide: Organismo haploide que incorpora
un segmento de DNA del exterior, de manera que
ahora posee dos copias de ese gen.

4. Mutación
 Cambio de la secuencia
nucleotídica de una molécula
de DNA que es heredable y
NO se reproduce por
recombinación.
Figura 4. Ejemplo de una mutación.
IMPORTANCIA
Fuente primaria
de la variabilidad
genética.
Materia prima de
la evolución
Análisis genético

5. Frecuencia de mutación
 Es el número de mutaciones que aparecen por división celular en
bacterias y organismos unicelulares
 Ejemplo:
Los genes víricos y bacterianos padecen un promedio de mutaciones
espontaneas en 1 de cada 100 millones (10-8) de divisiones celulares
aproximadamente.
 La frecuencia de mutaciones espontáneas es de 10-7 a 10-10 . Sin
embargo, en las mutaciones inducidas aumenta a una frecuencia de
10-4 a 10-7 .

6. Polimorfismo genético
 Variaciones en una posición o
región específica en la
secuencia de ADN que se
presentan en al menos un 1%
de la población.
Figura 2. Ejemplo de polimorfismo
genético.
MARCADOR GENÉTICO
 Segmento de ADN con una
ubicación física identificable
(locus) en un cromosoma y
cuya herencia genética se
puede rastrear.
Figura 3. Mapa genético de tomate
basado en marcadores morfológicos

7. Nomenclatura de genes
En genotipo se escriben las tres iniciales del factor de
crecimiento o enzima de la que se trate con letras minúsculas e
italizadas his+ o his -Antibióticos
Enzima conocida
mutaciones
Delección
Insersión
Plásmido
Fenotipo
strs o strr
hisG+ o hisG-
his G 47
D lac pro
lac::amps
his -, arg -/F, lac+
His + o His -

8. Clasificación
Grado de
lesión
• Espontáneas
• Inducidas
Orígen
• Macrolesiones
• Microlesiones
Efecto
sobre el
fenotipo
• Silenciosas
• Sentido equivocado
• Sin sentido

9. MUTACIONES ESPONTÁNEAS
 Son cambios en la secuencia nucleotídica de los genes y no
parecen tener causa conocida. Frecuencia de 10^-7 a 10^10
(1 en 10 millones)
Errores por tautomerismo.
Daños oxidativos
TAUTOMÉRISMO
 Los cambios tautoméricos pueden resultar en cambios en
el emparejamiento de bases, o mutaciones.
 Ceto-enol en la Timina y Guanina
 Amino-imino en la Citosina y Adenina

10. Figura 5. Formas normales y tautoméricas de las bases del DNA. La Adenina y
la Citosina pueden existir en la forma amino o en la rara forma imino; la
guanina y la timina pueden presentarse en la forma ceto o en la mas rara enol.

11. Figura 6. Comparación de las relaciones de emparejamiento de bases normales
con las disposiciones producidas como resultado de cambios tautomericos. Las
puntas de flecha señalan los sitios de unión del azúcar pentosido.

12. Mutaciones por Radicales libres
 Las formas activas de los radicales del oxigeno, como el
peróxido de hidrógeno (H2O2) y los superóxidos (O2)
generan rupturas en el enlace glicosídico por la oxidación
del azúcar generando sitios apurínicos o apirimidínicos .
Figura 7.efecto de radicales en bases nitrogenadas.

13. MUTACIONES INDUCIDAS
 Mutágeno:
agente externo, puede ser físico o
químico, que interactúa con el
DNA causando mutaciones.
 Mutagénesis:
Proceso de formación de un
organismo mutante.
Figura 8. Mutación inducida
por radiación UV

14. Agentes
mutagénicos.
Físicos
Rayos UV, X
Humedad
Temperatura
extrema
pH
Biológicos.
Químicos.

15. Rayos X y radiaciones
ionizantes:
o Tienen mayor poder de
penetración que los rayos UV
o Difícil manejo, por lo que se
emplean poco en bacterias
o Producen radicales libres de
hidroxilo hiperreactivos,
responsables de la abertura de
un anillo de una base, o
fracturas monocatenarias o
bicatenarias en el ADN, esto
puede ocasionar mutaciones
por deleción .
LUZ UV
 Causa la unión o
dimerización de pirimidinas
adyacentes en el DNA.
Siendo los dimeros de timina
los de mayor incidencia.
Figura 9. Dímeros de timina
por radiación UV

16. Curva de sobrevivencia de una
bacteria después de la exposición a la
radiación ultravioleta

17.  La exposición del material genético a temperaturas superiores
a 37ºC produce mutaciones puntuales en el ADN. Ejemplos
de esas mutaciones son la pérdida de bases púricas, proceso
que se denomina despurinización, o bien desaminaciones,
que consisten en la pérdida de grupos aminos de las bases.
TEMPERATURA
Figura 11. mutaciones inducidas por una alta temperatura
como despurinización (izquierda) y desaminación (derecha)

18. Biológicos.
Transposones:
Los transposones son segmentos móviles de DNA.
 Los transposones contienen cortas repeticiones invertidas
terminales que son esenciales para el mecanismo de
inserción y que se utilizan para definir los límites del
transposón.
 Todos los transposones activos contienen al menos un gen
que codifica una TRANSPOSASA, una enzima necesaria para
que se produzca el salto o transposición

19. Figura 12. Esquema de acción de los transposones

21. Despurinización
 Pérdida de purina en una molécula de doble cadena de DNA,
se produce por rompimiento del enlace glucosídico que une al
carbono 1 de la desoxirribosa a la posición 9 del anillo de
purina
Figura 13. Pérdida de una purina en un desoxinucleótido.

22. Rotura del enlace glicosídico entre la base nitrogenada y el
azúcar al que esta unida con pérdida de una A o una G.
Figura 14. Despurinización por pérdida de una guanina.

23. DESAMINACIÓN:
Pérdida de grupos amino.
La C se convierte en U y éste se
empareja con A produciéndose
transiciones: GC→AT.
El U no forma parte del ADN,
la glucosidasa de uracilo se
encarga de detectar U en el
DNA y retirarlo produciéndose
una base apirimidínica.
La 5-Me-C por se convierte en T.
La T es una base normal en el
DNA y no se retira, por tanto estos
errores no se reparan.
Figura 15. Transformación de algunas
bases por desaminación

24. Análogos de bases
 Son compuestos químicos que pueden remplazar a
una base determinada. Por ejemplo, el 5-Bromouracilo
(5BU) es análogo de la Timina (T) y puede remplazarla.
 El 5-Bromouracilo puede provocar un error tras la
replicación del DNA, es inestable y provoca
transiciones .

25. 5-Bromouracilo
Figura 16. Posibles apareamientos del 5-Bromouracilo.

26. 2-Aminopurina
La 2-Aminopurina (2AP) es análogo de la Adenina (A). La 2AP
aparea con la Timina (T) pero en su forma imíno (2AP*) empareja
con la Citosina (C). Esta alteración produce transiciones.
Figura 17. Posibles apareamientos de la 2-aminopurina

27. Desaminantes: HNO2
 Provoca transiciones mediante la sustitución de
grupos amino de nucleótidos por grupos ceto, como
consecuencia la citocina de convierte en uracilo, la
adenina en hipoxantina y la guanina en xantina
Figura 18. Sustitución del grupo amino por el grupo carbonilo en una
desaminación con HNO2

28. Figura 19. Cambios provocados por la desaminación con HNO2

29. Hidroxilamina ﴾HA﴿.
 ﴾NH₂OH): Reacciona con la citosina donde el grupo amino es
reemplazado por un grupo hidroxiamino. Este derivado de la
citosina se aparea con adenina produciéndose transiciones
GC- AT.
Figura 20. Acción de la hidroxilamina en la citosina, provocando
un apareamiento con adenina

30. Alquilantes.
 Etilmetanosulfonato (EMS): produce las sustituciones:
transiciones y transversiones.
 Nitrosoguanidina ﴾NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-
nitrosoguanidina : produce transiciones y transversiones
GC→TA
Figura 21. Cambio en el apareamiento de guanina
provocado por la alquilación.

31. Intercalantes
COLORANTES DE ACRIDINA
 La proflavina y el naranja de acridina son planas, por lo que inician la
mutación insertándose en la doble hélice del DNA, provocando su
deformación; provocando adiciones y deleciones en la replicación.
Figura 22. Moléculas planas policíclicas que se intercalan entre las bases.

32. Figura 23.Esquema de la acción de
los agentes intercalantes

33. Clasificación de mutágenos por su daño, dirección y efecto
Mutágeno Clasificación Daño Dirección Efecto
Luz UV Físico Dímeros de
pirimídinas
Unidireccional Inserción,
deleción,
sustitución
Hidroxilamina Químico Hidroxilante Unidireccional Transiciones de
GC-AT
Ácido nitroso Químico Desaminante Bidireccional Transiciones de
GC-AT y
trasversiones
AT-CG
EMS Químico Alquilante Bidireccional Transiciones de
GC-AT, AT-GC
5-Bromouracilo Químico Análogo de base Bidireccional Transiciones de
GC-AT, AT-GC
Nitrosoguanidina Químico Alquilante Unidireccional Transiciones de
GC-AT
ICR-170 Químico Intercalante Bidireccional Inserción o
deleción
9-Aminoacridina Quimico Intercalante Bidirecccional Inserción o
deleción

34. Mutación por grado de lesión
Macrolesiones:
Alteraciones graves
en la molécula del
DNA o en un
segmento grande
En función de su magnitud, longitud o grado de lesión,
permite clasificarlas en:
Microlesiones:
Alteración
producida en una o
pocas bases del
DNA.

35. Microlesiones (puntuales)
• Sustituciones
• Transversiones
• Transiciones
• Inserciones
• Deleciones • Alteran el marco de
lectura

36. sustitución
Es aquella mutación en la que donde debería haber una base se
encuentra otra del mismo tipo. Por ejemplo, en lugar de la
citosina se instala una timina.
Figura 22. Esquema de las posibles
transversiones y transiciones

37. Inserciones y deleciones
Este tipo de mutación produce un corrimiento en
el orden de lectura.
Pueden ser:
- Adiciones génicas: Es la inserción de nucleótidos
en la secuencia del gen.
- Deleciones génicas: Es la pérdida de nucleótidos.

38. Marcos de lectura
 ORF: Secuencia nucleotídica organizada en tripletes que
codifica una secuencia aminoacídica de un polipéptido,
incluyendo un codón de inicio y un codón de
terminación.
Figura 23. Marco de lectura.

39. Figura 24. Esquema de las consecuencias de
una deleción y de una inserción en la traducción

40. Corrimiento del marco de lectura.
Fig. 25 Mutación por corrimiento del marco de lectura.

41. Mutación Silenciosa:
Son cambios sutiles en las secuencias de DNA,
irrelevantes en un comienzo en cuanto a la
codificación proteínica, que poco a poco van
cobrando importancia siendo determinantes
en la enfermedad y la evolución.
Efecto sobre el fenotipo
Figura 26. Esquema de una mutación silenciosa donde se
sintetiza el mismo aa.

42. Mutación Sin sentido
Son aquellas en las que tiene lugar una sustitución
de bases en un codón dado, en donde en vez de
formar otro aminoácido distinto, se crea uno de
los tres codones “stop” (UAA, UAG, UGA).
.
Fig. 27. Comparación entre
un polipéptido completo y
uno truncado debido a
una mutación sin sentido al
cambiar una guanina por
una adenina. (Tomada de
Snyder & Champness,
2007, p. 157)

43. Mutación En sentido erróneo
Mutaciones que cambian la secuencia de un codón
dado, sustituyendo una base por otra, lo que puede
producir que el aminoácido codificado no sea el que
se había especificado antes.
.
Fig. 28. Cambio de una timina por
una citosina en una cadena de
DNA, produciendo una mutación
en sentido erróneo.(Tomada de
Snyder & Champness, 2007, p. 157)

44. Selección de mutantes.
 Selección de auxótrofos.
Los organismos aúxótrofos son empleados con mayor
recurrencia para buscar un gen específico
defectuoso, motivo por el cual no puede sintetizar sus
factores de crecimiento.
 Selección de protótrofos.
Estos microorganismos son empleados para la
secuenciación del genoma del organismo en su
forma silvestre.

45.  Selección de microorganismos susceptibles a antibióticos.
Los organismos susceptibles a antibióticos son estudiados
para poder identificar los genes que confieren esta
susceptibilidad y poder seguir posibles resistencias
adquiridas
 Selección de microorganismos resistentes a antibióticos
Son usados para estudio de los genes que confieren esta
resistencia, ya que por medio de dichos estudios se pueden
buscar algunas alternativas de tratamiento.

46. Mutaciones no reversibles (unidirecionales)y
reversibles (bidireccionales).
 Si se trata de una mutación unidireccional no reversible, puede
reemplazar al alelo del que se originó. (A1 A2) pero muy a largo
plazo.
 Si se trata de una mutación bidireccional reversible, se puede
establecer una situación de equilibrio que depende solo de las
tasas de mutación (u) y retromutación (v) (A1 A2).

47. Reversión.
 Es una segunda mutación, se restaura total o
parcialmente el genotipo y/o fenotipo dañado por la
primera mutación.
Verdadera: mutante que a revertido a su genotipo
anterior, restauración del genotipo (ADN) silvestre.
No verdadera (por supresión): reversión del fenotipo mutante
al silvestre a causa de una mutación en otro lugar que
suprima o compense la deficiencia de la primera
• Supresión intragénica: se produce cuando la segunda
mutación se da dentro del mismo gen en que se dio la
primer mutación.
• Supresión intergénica: las segunda mutación se da en un
gen diferente a donde se dio la primer mutación.

48. Artículo:
Hidroxilamina como agente
mutagénico de Neurospora
crassa
H. V. MALLING
Biology 3' Division,
Oak Ridge National Laboratory),
Oak Ridge, Tenn. (U.S.A.)
(Received June 21st, I966)

49. Neurospora crassa
o Es un hongo perteneciente a la división Ascomycota
o Es utilizado como organismo modelo por su haploidía, su ciclo
de vida rápido y sencillo, y por la facilidad con la que se
puede cultivar.
o Un sistema preferido para estudiar el mecanismo de la
mutación es el gen ad-3, porque los mutantes ad-3 son
morados y se detectan fácilmente.
Figura 29. Cultivo de
Neurospora crassa.

50. HA induce sustituciones en pares de bases GC- AT
La reacción entre DNA y HA es con citocina y con
RNA con uracilo
A un pH de 6.1 la reacción es mas rápida con
citocina que con uracilo
HA ha sido usada para inducir daño cromosómico
en células de mamíferos
No se ha podido identificar la alteración por HA en
eucariotes a nivel molecular
INTRODUCCIÓN

51. Objetivos
Determinar la especificidad de HA para
producir reversiones en mutantes
dependientes de adenina.
Obtener información más detallada
sobre los efectos de HA en Neurospora

52. Prueba de Ames
 Se basa en la observación de que la exposición de las bacterias
mutantes a las sustancias mutagénicas puede causar nuevas
mutaciones que revierten el efecto de la mutación original.
Figura 30. Prueba de Ames para observar revertientes.

53. Selección de mutantes.
Figura 31. Selección de mutantes por auxotrofía y Pototrofía

54. Réplica en placa
Ésta técnica
conocida como
réplica en placa,
(Joshua Lederberg),
es una técnica de
detección que hace
posible determinar
rápidamente si una
determinada cepa
bacteriana es
auxótrofa para
dado metabolito
Figura 32. Técnica de réplica en placa para
selección de auxótrofo a X metabolito.

55. Medio de cultivo
Conidios
20ml de medio
glicerol
completo con
sulfato de
adenina
Incubados
1 día a
30ºC, 6-9
días a 25ºC
Conidios en
agitación
con perlas
Rompimiento
de cadenas
suspendieron
en solución
salina (0.9%)
Filtrado en malla
de platino
lavados 2
veces por
centrifugación
Resuspender en
solución salina
Se utilizaron 7 cepas mutantes inducidas con
ácido nitroso y una cepa de origen
espontáneo.

56. Mutantes Ad- 3
difieren de las demás
por el desarrollo de
un pigmento
púrpura en el micelio
y conidios cuando
crece en glicerol
completo
La acumulación
de tal pigmento
se elimina al
agregar 250 mg
de sulfato de
adenina por
litro.
La densidad de suspensiones de conidios se midió en un
fotocolorímetro y el punto máximo de absorción se
encontró a 750µm.

57. Tratamientos
Suspensión de conidios
en matraces de
Erlenmeyer en un
agitador rotatorio en
baño de agua a 25º
5 min antes de
detener el
tratamiento.
Después de
los
tratamientos
NA, EMS o
ICR-170
Resuspender en suspensión
salina mínima de Fries
ajustada a un pH de 8 con
NaOH.
Todos los tratamientos se
llevaron a cabo con
suspensiones conidiales
(2X107/ml) en matraces
Erlenmeyer en un agitador
rotatorio

58. Tratamiento con ácido nitroso
Conidios fueron
suspendidos en
0.05M de un
regulador de
acetato de sodio
de un pH de 4.5
Cf: 0.005M de
NaNO2 y el
tratamiento fue
inactivado como
ha sido descrito
pasados los 40
minutos.
% S R/ 108S

59. Tratamiento con EMS
Los conidios fueron
suspendidos en 0.067 M
de un regulador de
fosfatos a un pH de 7.0.
El tratamiento se
inició al añadir
suficiente EMS
para dejar una
concentración
final de 0.1M; el
tratamiento fue
suspendido 300
minutos después.
% S R/ 𝟏𝟎 𝟖
S
Abreviaturas: %S= Porcentaje de sobrevivientes
R/𝟏𝟎 𝟖
S= Reversiones por cada 108
sobrevivientes

60. Tratamiento con Hidroxilamina
Antes del
tratamiento
HA, los conidios
fueron
suspendidos en
NaCl 3M
Dilución 5 veces
en la mezcla de
reacción HA
concentración
final 1M
5 minutos antes de detener
el tratamiento, centrifugó y
decantados y en el tiempo
de detener la reacción (300
minutos después de
iniciado el tratamiento)
Los conidios
fueron
resuspendidos
en NaCl 3M
los conidios fueron
resuspendidos en la
solución salina mínima de
Fries ajustada a un pH de 8.
% S R/ 𝟏𝟎 𝟖S

61. Tratamiento
con ICR-170
Suspensión de
conidios
Suspender en regulador
de fosfato 0.067M pH 7
Adición de un volumen de
ICR-170 a 49 volúmenes de
suspensión de conidia
Concentración
final de 10.58µM
Tratamiento
terminado
130min.
Después
Procedimiento realizado
en luz Roja, y las cajas
incubadas en oscuridad
% S R/ 𝟏𝟎 𝟖S

62. Estimación de la viabilidad de
los conidios tratados y no
tratados.
 Medios de cultivo
Fueron sembrados en medio mínimo de
Westergaard suplementado con sorbosa
(15g/l), glucosa (0.5 g/l), fructosa (0.5 g/l),
ácido casamino (200mg/l), una solución
vitaminada en glicerol completo (1 ml/l),
y adenin sulfato (25 mg/l)
Para estimar el número de
revertores los conidios fueron
sembrados en el mismo sustrato
usado para los sobrevivientes
anotados pero suplementado con
0.2 mg/l de adenin sulfato en lugar
de 25mg/l de adenin sulfato.

63. CONTEO DE REVERTIENTES DESPUES
DEL TRATAMIENTO CON NA, EMS E
ICR-170
Conidios sembrados a una densidad de
106/ml y 2X105 conidios/ml en un
volumen total de 100ml
CONTEO DE REVERTANTES
DESPUES DEL TRATAMIENTO
CON HA
La densidad de los conidios fue de
2X105 en volumen total de 500ml
DETERMINACIÓN DE
SOBREVICENCIA
La densidad de los conidios fue de 5-10
conidios por volumen de sustrato en
volumen total alrededor de 100 mL

64. Supresores
Se analizaron 20 diferentes mutantes inducidos en
el loci ad-3 para observar la incidencia de
supresores extragénicos y ninguno fue encontrado.
Por lo tanto, se pude asumir que la reversión por
supresión fuera de los locus ad-3a ó ad-3b son muy
raros o no ocurren.

65. Alteraciones genéticas inducidas por HA
Tabla 1: Porcentaje de sobrevivientes y frecuencias de
reversión de las cepas después del tratamiento con
ICR-170, NA, EMS e Hidroxilamina.

66. Grafica 1: Incremento del número de reversiones (M)
después del tratamiento con HA sobre el número de
mutaciones espontáneas (Mo) contra el tiempo de
tratamiento con HA.

67. Grafica 2: Porcentaje de sobrevivientes contra el
tiempo de tratamiento con HA.

68.  La frecuencia de reversión con Hidroxilamina no es proporcional al
tiempo en Neurospora, pero sí para fagos.
Grafica 3: Cinética de las inducciones de reversiones por HA en la
sustitución par base de la cepa 2-17-155.
Frecuencia de las reversiones por 108 sobrevivientes contra el
cuadrado del tiempo del tratamiento de HA.
 Heterocarionte
 Rápida penetración
de HA.
 Reacción con citosina
ocurre en dos pasos

69. Conclusiones:
 Se obtuvieron 8 veces mas mutantes en las cepas tratadas
con HA que en las espontáneas.
 El porcentaje de supervivientes no fue menor al 42%.
 En Neurospora crassa la Hidroxilamina produce reversión en
las cepas que revierten por sustitución de pb.
 La alteración genética inducida por la Hidroxilamina en
Neurospora es la transición par de base de GC a AT.
 La frecuencia de la inducción por HA sigue una cinética de
segundo orden.

70. Práctica 2
Inducción de
mutantes en
Escherichia coli

71. Objetivos
 Conocer el manejo de algunas técnicas para
producir mutaciones
 Analizar algunos parámetros que caracterizan el
proceso de mutación como la frecuencia de
mutación y la relación dosis-respuesta.
 Caracterizar el daño producido por la luz UV y HA
mediante pruebas de reversión.

72. Mac Conkey Medio Mínimo Lactosa
 Medio diferencial
 Las bacterias capaces
de fermentar acidifican
el medio. Se forman
colonias rojas o rosadas.
 Medio mínimo
 Sólo crecen
microorganismos
capaces de utilizar
la lactosa como
fuente de carbono.
Figura 30. Prueba positiva y
negativa de lactosa en
medio Mac Conkey
MEDIO LURIA (L)
 Medio rico
Lac+ Lac-
MEDIOS DE CULTIVO

73.  Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en
los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo
puede encontrar en todos lados, dado que es un organismo
ubicuo.
 Escherichia coli W3350
 Fenotipo: F-, Gal-, Su-, Sms
Escherichia coli
CEPA

74. Desarrollo experimental.
Tratamiento con hidroxilamina
Colectar
células
cultivo
E. coli
W3350
4000 x g
10 min
5 ml
medio L
1 ml
9200 x g
3min

75. 1 ml de
HA pH 6
Tubo [ HA] M
1 0.0
2 0.2
3 0.4
4 0.6
5 0.8
Tapar con
papel
aluminio.
Incubar a 37°C
en agitación
30 min.
9200 x g
3min
Condiciones
de
esterilidad
1 ml
sol.
Salina
Determinar el
numero de células
viables en cada
tubo con diluciones
decímales

76. 0.5 ml
10-1
4.5 ml
medio L
Tubo Dilución
1 10-5, 10-6
2 10-5, 10-6
3 10-4, 10-5
4 10-4, 10-5
5 10-4, 10-5
Sol.
salina
Por duplicado
0.1 ml
Mac
Conkey
Incubar
37°C
18 h
Incubar tubos
con dilución 10-1
37°C 18 h

77. DÍA 1. TRATAMIENTO CON LUZ ULTRAVIOLETA
Dilución
1:20 E.
coli
W3350
Medio L
20 ml
Incubar a 37° con
agitación hasta
obtener una densidad
óptica de 60 unidades
Klett equivalente a
As600nm =1.12 (apróx
15h)
4000 x g
15 min
Resuspender
6 ml Sol.
salina
500 ul
4.5 ml
medio L 10-1

78. 5.5 ml Irradiar por 15, 30, 45 y 60 segundos
0.5 ml
4.5 ml
medio L
Tiempo de
irradiación
Dilución
0 10-5, 10-6
15 10-5, 10-6
30 10-5, 10-6
45 10-5, 10-6
60 10-4, 10-5
Sol.
salina

79. 0.1 ml
Mac
Conkey
Por duplicado
Incubar
37°C
18 h
Incubar tubos
con dilución 10-1
37°C 18 h

80. DÍA 2. CUENTA DE SOBREVIVIENTES Y SIEMBRA PARA SELECCIONAR MUTANTES
Cuenta de
sobrevivientes
colonias blancas
Lac-
Calcular el título
de sobrevivientes y
trazar gráfica de %
de sobrevivencia
vs [HA] o tiempo
de irradiación.
Prepara diluciones
10-6, 10-7 y 10-8 De la
dilución 10-1 Medio L
0.1 ml
Mac
Conkey
Sembrar una caja
de la dilución 10-6 y
dos de 10-7 y 10-8
incubar a 37°C 18h
NO
picar las
colonias

81. Cuenta de
sobrevivientes
colonias blancas
Lac-
DÍA 3. REVERSIÓN
NO
picar las
colonias
Calcular frecuencia de
mutación (FM)
Elaborar la curva dosis-respuesta,
considerando la dosis del mutágeno
empleadas y las frecuencias de
mutación calculadas.

82. DETERMINACIÓN DEL TIPO DE MUTACIÓN PRODUCIDO POR LA LUZ
UV Y HA
Una colonia
aislada Lac-
0.5 ml medio L
Agar blando
fundido
0.1 mL
Medio Mínimo Lactosa

83. Papel filtro estéril
Impregnar 20 ul
Estreptomicina y
9-aminoacridina
Nitrosoguanidina
y 5-bromouracilo
Hidroxilamina Nada
Incubar a 37°C 5 días, observándolas diariamente para registrar la
aparición de revertantes. De acuerdo a los resultados obtenidos y
tomando en cuenta el tipo de lesión que produce cada mutágeno,
proponer que tipo de lesiones produjeron la HA y la luz UV

84. Bibliografía
 Klug W.S. (et. Al.), Conceptos de genética, 5ª edición,
ED. PRENTICE HALL, Madrid (1999) pág. 411-412, 423-
430 http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pi
d=S0718-34292009000300009#img01
 http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/13agfisico
s.htm#_Toc59451628
 http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/16mutaci
on.htm#_Toc62545604
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