78490563.apunte evaluacion inmunoserológica (2)

Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología
Evaluación inmunoserológica del paciente
Viviana Lifschitz, Luis A. Merino
La presencia de anticuerpos contra un antígeno en particular en el suero de un paciente
o de antígenos en una muestra clínica se demuestra efectuando una reacción serológica.
Para realizar estos estudios, se cuenta con una gran variedad de metodologías basadas en
una reacción antígeno-anticuerpo, la cual puede ser puesta en evidencia mediante diferen-
tes técnicas.
La elección de una prueba inmunológica en particular, ya sea para realizar el diagnóstico de
una enfermedad infecciosa o evaluar su evolución, se fundamenta en diferentes puntos:
1. Etapa probable de la enfermedad que se desea diagnosticar (aguda o crónica)
2. Sensibilidad y Especificidad de la reacción (se explicarán más adelante).
3. Costo de la prueba a aplicar (Generalmente se comienza el estudio con pruebas
de “screening” o tamizaje las cuales son menos costosas).
4. Factibilidad de realización (debido a su complejidad algunas pruebas sólo se
realizan en grandes laboratorios o centros de referencia)
5. Urgencia en la obtención de resultados (Algunas pruebas serológicos sólo insu-
men 3 a 5 minutos en su realización mientras que otras llevan varias horas hasta
obtener el resultado)
En la Tabla I, al final del capítulo, se presenta un resumen de las pruebas inmunoserológi-
cas más empleadas y su utilidad en el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
De acuerdo al objetivo que se persigue en su realización, las pruebas inmunológicas se
clasifican en:
a) Directas: cuando lo que se desea detectar son antígenos del microorganismo en una
muestra
b) Indirectas: cuando lo que se desea detectar son los anticuerpos formados contra un
agente infeccioso en particular.
En cuanto a la metodología empleada, las técnicas inmunológicas más utilizadas para el
diagnóstico de enfermedades infecciosas pueden clasificarse en:
a) Precipitación
b) Aglutinación
c) Anticuerpos marcados
d) Técnicas de inmunoblotting
e) Pruebas de inhibición
f) Fijación del complemento
Influyen en el desarrollo de estas reacciones los siguientes factores:
a) la concentración relativa de anticuerpos y antígenos,
b) el pH del medio, la clase y concentración de iones,
c) la presencia de sustancias interferentes,
d) la temperatura,
e) la calidad de los anticuerpos empleados en las técnicas directas y
f) la calidad de los antígenos en las pruebas indirectas.
Cuando lo que se intenta es estudiar la presencia de anticuerpos frente a un determinado
agente infeccioso, podemos tener resultados cualitativos (el anticuerpo está presente o no)
o cuantitativos (qué cantidad relativa de anticuerpos existen). En el primer caso, sólo se
realiza una sola determinación cuyo resultado será positivo o negativo, en el segundo caso,
1

deben realizarse diluciones seriadas del suero del paciente (generalmente son diluciones al
medio, p.e.: ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 128, etc. La prueba se aplica a todas las diluciones
del paciente y se considera como título de anticuerpos a la inversa de la máxima dilución
que presente un resultado positivo. Por ejemplo: si en una reacción dada tenemos resulta-
dos positivos en las diluciones ½, ¼, 1/8, 1/16 y 1/32, y negativos en las diluciones 1/64,
128, etc., el título de anticuerpos de ese paciente para esa reacción será de 32.
En la mayoría de las reacciones en las cuales se titulan anticuerpos, especialmente en las
utilizadas para diagnosticar infección aguda viral (p.ej. Rubéola, sarampión, etc), lo que se
busca es un aumento de al menos 4 veces el título inicial, para ello se extrae al paciente una
muestra de sangre en fase aguda y otra en el período de convalescencia y se realiza la titu-
lación de anticuerpos en ambas muestras (“Muestras pareadas”). Ejemplo: si en fase aguda
el paciente tiene un título de anticuerpos de 4 frente al virus de la varicela y en fase de con-
valescencia un título de 32, es evidencia de que el paciente sufrió una infección reciente por
dicho virus.
En otras enfermedades, principalmente aquellas poco frecuentes o frente a las cuales es
poco probable que la población general haya estado expuesta y presente anticuerpos espe-
cíficos, (P.e.: Herpes tipo II, SIDA), el solo pasaje de ser seronegativo a presentar serología
positiva ya es evidencia de infección reciente (Seroconversión)
Reacciones de precipitación
Ocurren cuando el antígeno es una molécula soluble. Al unirse en cantidades equivalentes
del anticuerpo, se forma una red de precipitación haciéndose visible la reacción. Son ejem-
plos de estas técnicas las de:
a) Pocillos sembrados
Fig. 1: Inmunodifusión doble:
Ag (antígeno), Ab (anticuerpo).
Ejemplo para detección de anti-
cuerpos en el paciente.
a) Inmunodifusión doble (IDD): el antígeno y el anticuerpo
se enfrentan en gel de agarosa y luego de permitir su di-
fusión durante 72 horas, la presencia de bandas de pre-
cipitación indica resultado positivo. (Figura 1). Esta prue-
ba se aplica principalmente en la detección de anticuer-
pos dirigidos contra ciertos géneros de hongos como ser
Aspergillus, Cándida, Paracoccidioides e Histoplasma.
b) Contrainmunoelectroforesis (CIEF): se basa en el
mismo principio que la IDR con la diferencia que la placa de
agarosa se somete a un campo eléctrico, con lo cual se
fuerza la migración del antígeno y los anticuerpos, acortando
el tiempo de reacción y aumentando hasta 10-20 veces la
sensibilidad de la prueba (Figura 2).
Esta prueba tiene aplicación princi-
palmente en la detección de polisa-
cáridos capsulares en LCR de
pacientes con meningitis por Strepto-
coccus pneumoniae, Neisseria menin-
gitidis o Haemophilus influenzae tipo b.
Fig. 2: Esquema de la técnica de CIEF
2

c) Inmunodifusión radial (IDR): permite cuanti-
ficar proteínas séricas. Se siembra el suero
del paciente en pocillos practicados sobre un
gel de agarosa conteniendo los anticuerpos
contra la proteína (antígeno) que desea cuan-
tificarse. La proteína difunde y va precipitan-
do con el anticuerpo específico, dejando co-
mo resultado un halo de precipitación, siendo
la concentración de proteínas proporcional al
cuadrado del halo de precipitación formado
(Figura 3). Esta técnica no se utiliza para
diagnosticar una enfermedad infecciosa sino
para evaluar el estado inmune del paciente
(Ver más adelante).
ción, siendo
la concentración de proteínas proporcional al
cuadrado del halo de precipitación formado
(Figura 3). Esta técnica no se utiliza para
diagnosticar una enfermedad infecciosa sino
para evaluar el estado inmune del paciente
(Ver más adelante).
Una forma especial de las reacciones de precipi-
tación es la reacción de floculación, en la cual el
antígeno que se utiliza es lipídico y en vez de
estar disuelto se encuentra emulsionado en una
fase acuosa. Un ejemplo es la prueba de
V.D.R.L. (Venereal Diseases Research Laborato-
ry) para la detección de anticuerpos inespecíficos
(reaginas) en pacientes con sífilis.
Una forma especial de las reacciones de precipi-
tación es la reacción de floculación, en la cual el
antígeno que se utiliza es lipídico y en vez de
estar disuelto se encuentra emulsionado en una
fase acuosa. Un ejemplo es la prueba de
V.D.R.L. (Venereal Diseases Research Laborato-
ry) para la detección de anticuerpos inespecíficos
(reaginas) en pacientes con sífilis.
Reacciones de aglutinaciónReacciones de aglutinación
Estas reacciones pueden ser de dos tipos
diferentes:
Estas reacciones pueden ser de dos tipos
diferentes:
a) Las que utilizan antígenos particula-
dos (aglutinación directa o activa) como ser
bacterias o parásitos. Tienen amplia aplica-
ción, principalmente en la detección de anti-
cuerpos anti Brucella (Reacción de Huddle-
son), anti Salmonella Typhi (Reacción de Wi-
dal), y para el diagnóstico y seguimiento de
enfermedades como la de Chagas y Toxo-
plasmosis.
a) Las que utilizan antígenos particula-
dos (aglutinación directa o activa) como ser
bacterias o parásitos. Tienen amplia aplica-
ción, principalmente en la detección de anti-
cuerpos anti Brucella (Reacción de Huddle-
son), anti Salmonella Typhi (Reacción de Wi-
dal), y para el diagnóstico y seguimiento de
enfermedades como la de Chagas y Toxo-
plasmosis.
b) Las que utilizan antígenos solubles
unidos a partículas que actúan como soporte inerte (aglutinación pasiva o indirecta) como
ser hematíes o partículas de látex (Figura 4). En el caso particular en que los antígenos se
fijen a hematíes la técnica se denomina hemaglutinación indirecta (HAI). Estas pruebas
se realizan en portaobjetos o en policubetas; la formación de redes de aglutinación se mani-
fiesta como “grumos” en las pruebas en portaobjetos (Figura 5) y como “mantos” en pruebas
en policubetas (Figura 6).
b) Las que utilizan antígenos solubles
unidos a partículas que actúan como soporte inerte (aglutinación pasiva o indirecta) como
ser hematíes o partículas de látex (Figura 4). En el caso particular en que los antígenos se
fijen a hematíes la técnica se denomina hemaglutinación indirecta (HAI). Estas pruebas
se realizan en portaobjetos o en policubetas; la formación de redes de aglutinación se mani-
fiesta como “grumos” en las pruebas en portaobjetos (Figura 5) y como “mantos” en pruebas
en policubetas (Figura 6).
Una forma particular de técnica de aglutinación es
la coaglutinación, en la cual se utilizan anticuerpos es-
pecíficos unidos por su fracción Fc a la proteína A de
Staphylococcus aureus (la bacteria actuaría de soporte
inerte) y se utiliza preferentemente para detectar antíge-
nos solubles de Streptococcus pneumoniae, Neisseria
meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus
Una forma particular de técnica de aglutinación es
la coaglutinación, en la cual se utilizan anticuerpos es-
pecíficos unidos por su fracción Fc a la proteína A de
Staphylococcus aureus (la bacteria actuaría de soporte
inerte) y se utiliza preferentemente para detectar antíge-
nos solubles de Streptococcus pneumoniae, Neisseria
meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus
3
a) Aglutinación directa b) Aglutinación indirecta
Fig. 4. Esquema de partículas
insolubles que reaccionaron con
anticuerpos del paciente
Fig. 3: Esquema de los halos obtenidos en
una reacción de IDR y del gráfico correspon-
diente que muestra la relación entre el cua-
drado del diámetro y la concentración de
antígenos (Proteínas) en la muestra.
Concentración del Ag
Antígeno
eritrocitario
Anticuerpo
Eritrocito
Sensibilizado
Diámetro
2
Gel que contiene el Ac Anillo de precipitación
Fig. 5: Aglutinación indirecta en
portaobjetos.
Izquierda: prueba positiva
Derecha: prueba negativa

agalactiae y Criptococcus neoformans en líquidos orgánicos como ser LCR.
Fig. 6: Prueba de hemaglutinación en
policubetas con diluciones seriadas del
suero del paciente. El “manto” indica
resultado positivo. El “botón” indica
resultado negativo. El título de anti-
cuerpos es la mayor dilución que arro-
ja resultado positivo. Para cada suero
se incluyen controles positivos (pos) y
negativos (neg)
Cuando la partícula que se utiliza para
fijar los anticuerpos es un eritrocito, la
técnica se denomina hemaglutinación
reversa (Figura 7). Esta técnica se utili-
za principalmente para detectar antíge-
no de superficie del virus de Hepatitis B
(HBAgs) en suero de pacientes.
La identificación serológica de bacte-
rias a partir de colonias recuperadas
sobre medios de cultivo sólidos se reali-
za mediante pruebas de aglutinación
directa con antisueros comerciales (Es-
cherichia coli, Vibrio cholerae, Salmone-
lla, Shigella) o mediante pruebas de
coaglutinación (Estreptococos betahe-
molíticos). Estas pruebas permiten de-
terminar el serotipo de la bacteria estu-
diada y es de suma importancia en clíni-
ca y en epidemiología
Fig. 7: Reacción de hemaglutinación reversa
Reacciones que utilizan anticuerpos marcados
En ciertos casos, la unión entre un antíge-
no y un anticuerpo puede ponerse de ma-
nifiesto por el uso de un anticuerpo espe-
cífico marcado con fluoresceína (inmuno-
fluorescencia directa o IFD) o utilizando
una antiinmunoglobulina marcada con
fluoresceína (inmunofluorescencia indi-
recta o IFI). La marcación también puede
realizarse con peroxidasa (reacción de
inmunoperoxidasa), isótopos radiactivos
(Radioinmunoensayo o RIA) o fosfatasa
alcalina (Enzymelinked immunosorbent
assay o ELISA también denominada en-
zimoinmunoensayo o EIA). Estas prue-
Fig. 8: Esquema de las técnicas de inmunofluorescencia directa
(A) e indirecta (B).
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bas pueden utilizarse para la detección de antígenos (directas) o para la detección de anti-
cuerpos (indirectas).
a) Inmunofluorescencia directa: La muestra del paciente se fija a un portaobjetos y se
agrega una solución de anticuerpos específicos marcados con fluoresceína. Luego de una
incubación, se lava para eliminar restos de anticuerpos no reaccionantes y se observa con
microscopio de luz UV. La presencia de elementos fluorescentes indica reacción positiva
(Figura 8). Se aplica especialmente en el diagnóstico de sífilis, infecciones por virus respira-
torios, uretritis y endocervicitis por Chlamydia trachomatis, etc.
b) Inmunofluorescencia indirecta:
Se utilizan portaobjetos con el antígeno
contra el cual se desea estudiar la pre-
sencia de anticuerpos. Se agrega el sue-
ro del paciente, se incuba y se lava para
eliminar las sustancias no reaccionantes.
Finalmente se agrega una inmunoglobuli-
na anti inmunoglobulinas totales, anti IgG
o anti IgM y luego se observa al micros-
copio de luz UV. La presencia de elemen-
tos fluorescentes indica reacción positiva
(Figura 8). Esta técnica puede aplicarse
para la detección de anticuerpos del tipo
IgG o IgM para diagnosticar un gran nú-
mero de enfermedades infecciosas como
ser Sífilis, Herpes, Listeriosis, Chagas,
Toxoplasmosis, infecciones por Myco-
plasmas, Chlamydias y Rickettsias, etc.
Existe una prueba, en la cual se absorbe
el suero del paciente con una cepa no
patógena de Treponema pallidum para
eliminar las reacciones cruzadas y luego se realiza, con ese suero libre de anticuerpos ines-
pecíficos, una reacción de IFI. Esta técnica se denomina de anticuerpos fluorescentes ab-
sorbidos (FTAabs) y se aplica para confirmar los resultados positivos de la prueba de
V.D.R.L.
Fig. 9: Esquema del desarrollo de una técnica de E.L.I.S.A.
para la detección de anticuerpos específicos contra un antí-
geno determinado
a) E.L.I.S.A. directo: permite detectar antígenos presentes en una muestra clínica. La
muestra se coloca sobre un soporte sólido (papel, policubetas, esferas de vidrio, etc) que
contiene fijados anticuerpos específicos contra el antígeno que queremos detectar. Luego
de una incubación se lava para eliminar las sustancias no reaccionantes y se agrega un an-
ticuerpo marcado con una enzima, específico contra el antígeno en estudio. Luego de incu-
bar, se lava y agrega un sustrato cromogénico para la enzima utilizada. La presencia de
color indica una prueba positiva. Esta prueba tiene múltiples aplicaciones, siendo algunas de
las más corrientes la detección de antígenos de Chlamydia trachomatis en muestra urogeni-
tales, de Rotavirus en materia fecal, de Listeria en alimentos, etc. Esta prueba permite de-
terminar además la concentración de diversas proteínas y hormonas en el suero del pacien-
te por lo que se utiliza para cuantificar IgE, TSH, T3, T4, marcadores tumorales, etc.
b) E.L.I.S.A. indirecto: permite detectar anticuerpos contra la mayoría de los agentes in-
fecciosos conocidos, ya sean del tipo IgG o IgM (Figura 9). Se coloca el suero del paciente
sobre un soporte sólido conteniendo el antígeno del microorganismo en estudio, se incuba,
se lava y agrega una antigammaglobulina humana marcada con una enzima. Esta Ig puede
ser anti inmunoglobulinas totales, anti IgG o anti IgM. Luego de una incubación, se lava y
agrega el sustrato cromogénico para la enzima. La presencia de color indica una prueba
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positiva o sea presencia de anti-
cuerpos en el paciente. Si esta
prueba se realiza sobre dilucio-
nes seriadas del suero del pa-
ciente, podrá obtenerse el título
de anticuerpos y poder seguir el
curso de una infección (Figura
10). Entre las aplicaciones más
corrientes están la detección de
anticuerpos contra: H.I.V., Chla-
mydias, Mycoplasmas, Herpesvi-
rus, Virus Dengue, Virus de la
Rubéola, antígenos del virus de
Hepatitis B, etc.
Fig. 10: Imagen de una policubeta para determinación cuantitativa de
anticuerpos mediante técnica de E.L.I.S.A.
Técnica de inmunoblotting
Esta técnica, también de nominada Western-blot, se utiliza para detectar anticuerpos contra
fracciones antigénicas proteicas específicas de un microorganismo. Si bien puede aplicarse
en diferentes enfermedades infecciosas, el más frecuente es su uso para confirmar el dia-
gnóstico de infección por Virus de la Inmunodeficiencia humana, ya que permite identificar
contra qué antígeno del virus están dirigidos los anticuerpos presentes en el paciente. Bási-
camente, consiste en tiras de acetato de celulosa sobre la cual se ha realizado una electro-
foresis de proteínas virales. Sobre estas tiras se coloca el suero del paciente y luego de la-
var se agrega una antiinmunoglobulina marcada con peroxidasa. Se incuba nuevamente, se
lava y se agrega un sustrato cromogénico para la enzima peroxidasa. La presencia de anti-
cuerpos se manifiesta por la aparición de color en el sitio de cada banda antigénica. (Figura
11)
Estructura del HIV
Tiras para Western-Blot
Bandas asociadas al HIV
gag – p17, p24, p55
(Core)
pol – p31 (Endonucleasa),
p51, p65 (Transcriptasa
rever-
sa)
env – gp41, gp120, gp160
A: control positivo fuerte
B: control positivo débil
C: control negativo
D: muestra positiva
Fig. 11: Técnica de Western-blot para confirmar el diagnóstico de infección por HIV.
Pruebas de inhibición
También podemos detectar anticuerpos basándonos en su capacidad para inhibir
alguna actividad biológica de los microorganismos. Por ejemplo, la prueba de antiestreptoli-
6

sina O para el diagnóstico de secuelas postestreptocócicas en la que la toxina es neutraliza-
da por los anticuerpos, impidiendo que destruya los hematíes.
Ciertos virus poseen la capacidad de inducir cambios en la morfología de las células en un
cultivo celular (efecto citopático). La presencia de anticuerpos en el paciente puede detec-
tarse por inhibición del efecto citopático cuando se enfrenta una suspensión del virus, el
suero del paciente y las células en cultivo.
Algunos virus poseen la capacidad de aglutinar glóbulos rojos por acción de proteínas de su
envoltura (hemaglutininas). Pueden detectarse anticuerpos en un paciente por inhibición de
la hemaglutinación cuando se enfrenta el suero de dicho paciente, una suspensión del
virus y glóbulos rojos.
Tabla I: Utilidad de las diferentes pruebas inmunológicas en patologías más prevalentes
Microorganismo Patología Técnica utilizada Objetivo
Aspergillus fumigatus Aspergilosis pulmonar IDD Detectar Ac
Brucella abortus Brucelosis Aglutinación directa Titular Ac
Cándida albicans Candidemia IDD Detectar Ac
Chlamydia trachomatis Uretritis, endocervicitis IFD, EIA directo,
IFI, EIA IgG, EIA IgM
Detectar Ag
Titular Ac
Chlamydia pneumoniae Neumonía Atípica IFI IgG, IFI IgM Titular Ac
Chlamydia psittaci Psitacosis IFI IgG, IFI IgM Titular AC
Citomegalovirus Hepatitis EIA IgG, EIA IgM Detectar Ac
Clostridium botulinum Botulismo IDR Detectar toxina
Escherichia coli Diarrea Aglutinación directa Serotipificación
H.I.V SIDA EIA
Western-blot
Detectar Ac
Confirmar EIA
Haemophilus influenzae b Meningitis Coaglutinación, CIEF Detectar Ag
Helicobacter pylori Úlcera gástrica EIA IgG, EIA IgA Detectar Ac
Histoplasma capsullatum Histoplasmosis IDD Detectar Ac
Listeria monocytogenes Listeriosis Aglutinación directa, IFI Detectar Ac
Mycoplasma pneumoniae Neumonía atípica IFI IgG, IFI IgM Titular Ac
Neisseria meningitidis Meningitis Coaglutinación, CIEF Detectar Ag
Paracoccidioides brasiliensis Paracoccidioidomicosis IDD Detectar Ac
Rotavirus Diarrea AL, EIA Detectar Ag
Salmonella enterica Gastroenteritis Aglutinación directa Serotipificación
Salmonella Typhi Fiebre tifoidea Aglutinación directa Detectar Ac
Shigella spp Disentería Aglutinación directa Serotipificación
Streptococcus agalactiae Meningitis Coaglutinación, CIEF Detectar Ag
Streptococcus pneumoniae Meningitis Coaglutinación, CIEF Detectar Ag
Streptococcus pyogenes Faringitis Coaglutinación
Aglutinación directa
Detectar Ag
Serotipificación
Toxocara canis Larva migrans visceral EIA Titular Ac
Toxoplasma gondii Toxoplasmosis HAI, AD, IFI Titular Ac
Treponema pallidum Sífilis IFD
VDRL, FTAabs
Detectar Ag
Detectar/titular AC
Tripanosoma cruzi Enfermedad de Chagas HAI, AD, IFI Titular Ac
Virus Dengue Dengue EIA, IHA Detectar Ac
Virus Hepatitis A Hepatitis A EIA IgG, EIA IgM Detectar Ac
Virus hepatitis B Hepatitis EIA, CIEF, HAR
EIA IgG, EIA IgM
Detectar Ag HBs
Detectar Ac
Virus Rubéola Rubéola EIA IgG, EIA IgM, IHA Detectar/Titular Ac
Virus sincitial respiratorio Neumonía IFD
IFI, EIA
Detectar Ag
Detectar Ac
Abreviaturas: EIA: enzimoinmunoanálisis, IFD: inmunofluorescencia directa, IFI, inmunofluorescencia indirecta, IHA: inhibición
de la Hemaglutinación, HAI: Hemaglutinación indirecta, AD: aglutinación directa, HAR: Hemaglutinación reversa, IDD: inmu-
nodifusión doble, CIEF: contrainmunoelectroforesis. FTAabs: inmunofluorescencia absorbida, AL: aglutinación de látex
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En general, los resultados de una reacción serológica no deben ser interpretados en
forma aislada, sino en relación a un contexto clínico y epidemiológico.
EVALUACIÓN DE LAS PRUEBAS INMUNOLÓGICAS
A la hora de elegir una prueba inmunoserológica y evaluar sus resultados debe tenerse en
cuenta la especificidad y sensibilidad de la misma.
Decimos que una prueba es más sensible cuando menor sea la cantidad de antígeno o
anticuerpo detecte, es decir, cuando más precoz sea el diagnóstico que nos permite realizar.
Por otra parte, una prueba serológica es más específica cuando menor capacidad posea
para dar reacciones cruzadas (reacciones inespecíficas) o sea resultados positivos frente a
antígenos o anticuerpos no buscados.
Si realizamos una tabla imaginaria donde colocamos los resultados obtenidos para una de-
terminada prueba serológica frente a un determinado grupo de pacientes tendremos las si-
guientes posibilidades:
Pacientes
Sanos Enfermos
Positivos FP PV FP+PV
Resultados
Negativos VN FN VN+FN
FP+VN PV+FN Total
En la cual:
Positivo verdadero (PV): resultado positivo en paciente enfermo.
Falso positivo (FP): resultado positivo en un paciente sano.
Verdadero negativo (VN): resultado negativo en un paciente sano.
Falso negativo (FN): resultado negativo en un paciente enfermo.
Sensibilidad es = PV x 100
Observando las fórmulas podemos decir que:
Una prueba serológica es más sensible cuando menos resultados falsos negativos arro-
je.
Una prueba serológica es más específica cuando menos resultados falsos positivos arro-
je.
A continuación daremos un ejemplo: se desea evaluar la calidad de una nueva técnica
de ELISA para el diagnóstico de infección por Chlamydia trachomatis, en una población de
100 pacientes en los cuales se estudió la mediante cultivo en células HeLa (Método están-
dar o de referencia). Los resultados son los siguientes:
Cultivo de
Chlamydia trachomatis
Negativo Positivo
Positivo 1 56 57Test de
ELISA Negativo 40 3 43
41 59 100
PV = 56; FP = 1; VN = 40 y FN = 3
PV+FN
Especificidad es = PV x 100
FP+PV
8

Sensibilidad = 56x100
EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD DE UN PACIENTE
La evaluación inicial del paciente debe incluir una historia clínica completa con todos los
antecedentes del paciente y de sus familiares y un examen físico detallado.
Se puede sospechar una inmunodeficiencia por la presencia de infecciones crónicas, in-
fecciones recurrentes, agentes infecciosos raros, curación incompleta o respuesta incomple-
ta al tratamiento. Se sospecha un defecto de los linfocitos B ante infecciones a repetición
como neumonía, sepsis y meningitis. Sugieren anormalidades de los leucocitos las infeccio-
nes primarias de la piel y osteomielitis crónica por Klebsiella o Serratia.
Una evaluación inicial incluye:
dosaje de concentraciones totales de IgG, M y A,
recuento leucocitario total y diferencial (hemograma),
pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardada,
estudio funcional de los neutrófilos, medición de la cantidad de complemento
hemolítico (CH50) y C3 y C4.
Empezaremos por una evaluación del estado de las barreras físicas (presencia de que-
maduras, heridas, vías endovenosas que alteren la continuidad del epitelio, etc.). Cuando
existe una falla en este nivel es común encontrar infecciones recurrentes, abscesos cutá-
neos, neumonitis y septicemia. En las décadas del ‘60 y ‘70 eran frecuentemente debidas a
S. aureus, al mejorar los tratamientos antibióticos este lugar fue ocupado por Pseudomonas
aeruginosa y Enterobacterias en la década del ‘80 y actualmente se encuentran principal-
mente infecciones por Staphylococcus coagulasa negativos, Aspergillus spp y Candida albi-
cans.
Estas manifestaciones también se presentan cuando la falla se encuentra en los leucocitos
polimorfonucleares y el sistema monocito macrófago.
Agregaremos a la evaluación un hemograma para obtener la cuenta leucocitaria total y dife-
rencial y estudios funcionales de opsonización (dosando C3 y anticuerpos), y capacidad
de migración o respuesta a la quimiotaxis (técnica in vivo de la ventana cutánea de Re-
buck), fagocitosis (viendo la ingestión de Candida spp, polisacárido de E. coli recubierto de
aceite de parafina con colorante rojo), lisis (evaluando la destrucción de bacterias, prueba
del NBT, quimioluminiscencia), y evaluación de los sistemas enzimáticos con coloracio-
nes específicas y estudio de poblaciones con anticuerpos monoclonales.
En casos de deficiencias del complemento, por defectos de producción o exceso de catabo-
lismo, se observan infecciones recidivantes por bacterias piógenas (cocos Gram positivos)
cuando el C3 se encuentra disminuido, o principalmente por gonococos y meningococos
cuando la deficiencia es de C5 u otros factores del complemento.
El nivel del complemento en el suero se puede determinar verificando la actividad hemolítica
total del mismo al incubarlo con eritrocitos de carnero sensibilizados con anticuerpos de co-
nejo anti-eritrocito de carnero. También se puede evaluar cada una de sus componentes por
inmunodifusión radial (C3 y C4), nefelometría, RIA (properdina) y prueba de hemólisis (se
colocan en exceso todas las proteínas del complemento, a excepción de la que se quiere
dosificar).
= 95%
56+3
Especificidad = 56x100 = 98%
1+56
9

Una disminución de C3 y C4 indicarían una activación del sistema complemento por la vía
clásica mientras que una disminución de los niveles séricos de C3 y valores conservados de
C4 indicarían la activación por la vía alterna.
Por último, en el caso de deficiencias de la inmunidad humoral encontraremos principalmen-
te infecciones del tracto respiratorio superior y neumonías por gérmenes como: S. pneumo-
niae (diplococo Gram positivo), Moraxella catharralis (cocos Gram negativos) y Haemophilus
influenzae (bacilo Gram negativo).
Los linfocitos B pueden estudiarse con: hemograma (recuento total de linfocitos) y estudio
de subpoblaciones con anticuerpos monoclonales(en estudios de leucemias).
Para estudiar los anticuerpos podemos realizar un dosaje de: proteínas totales y gama glo-
bulinas; proteinograma electroforético ( evaluación inicial para detectar deficiencias, o dife-
renciar aumentos policlonales de monoclonales), dosaje de inmunoglobulinas G, M y A tota-
les por inmunodifusión radial y de Ig E por RIA, inmunoelectroforesis para estudio de com-
ponentes monoclonales o detección de proteína de Bence Jones en orina, etc.
La evaluación de los distintos componentes de la respuesta inmune inespecífica pue-
de realizarse con numerosas pruebas de laboratorio. También se dispone de estudios que
nos permiten determinar la producción de anticuerpos contra un microorganismo en particu-
lar o buscar antígenos en las distintas muestras remitidas al laboratorio.
La actividad biológica global del complemento en suero se puede medir por su capaci-
dad para producir la lisis de hematíes sensibilizados con anticuerpos, mediante la activación
de la vía clásica. Las actividades de los componentes individuales del sistema del com-
plemento se pueden evaluar por su capacidad para ser tituladas en un sistema lítico depen-
diente del complemento que carece del componente sometido a prueba (se colocan en ex-
ceso los componentes del complemento menos el estudiado y un sistema de detección co-
mo ser glóbulos rojos recubiertos de anticuerpos) el grado de hemólisis dependerá de la
concentración del componente en estudio y de su actividad, o medir su concentración usan-
do reacciones de precipitación en gel (inmunodifusión radial) en esta técnica no se diferen-
cian fracciones activas de inactivas.
Los neutrófilos se evalúan primeramente con el hemograma, con el que se obtiene su con-
centración absoluta y relativa, y luego funcionalmente estudiando el proceso de fagocitosis.
Análisis para las deficiencias del funcionalismo de los neutrófilos: Los defectos de la
quimiotaxis, fagocitosis y muerte bacteriana determinan un aumento de la susceptibilidad del
huésped a la infección. Probablemente, la enfermedad granulomatosa crónica representa el
ejemplo mejor estudiado y mejor definido de enfermedad relacionada con una función defec-
tuosa de los neutrófilos. Los PMN de pacientes con esta enfermedad poseen actividad fago-
cítica normal, pero muestran un defecto en el proceso de muerte de las bacterias. Los mi-
croorganismos implicados generalmente son catalasa positivos.
El defecto reside en un metabolismo anormal del oxígeno, con reducción del consumo de
oxígeno, reducción de la generación de peróxido de hidrógeno y superóxido, y ausencia de
la estimulación por el shunt de la hexosa monofosfato. La pequeña cantidad de peróxido de
hidrógeno presente en la vacuola fagocítica del PMN queda inactivada rápidamente por los
organismos catalasa positivos.
La detección de esta anomalía se favorece empleando la prueba de reducción del coloran-
te nitroazul de tetrazolio. El nitroazul de tetrazolio oxidado es incoloro, pero durante la fa-
gocitosis se reduce y precipita en el citoplasma como azul de formazán. El fracaso para es-
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timular el metabolismo oxidativo, como en el caso de la enfermedad granulomatosa crónica,
impide la reducción del nitroazul de tetrazolio.
En una prueba simple los PMN, látex y nitroazul de tetrazolio se colocan en forma de gota
en un portaobjetos de vidrio y la reducción a formazán se verifica bajo microscopio. La nor-
malidad de los resultados debe confirmarse siempre por un método cuantitativo más preciso.
Una prueba similar consiste en la medición de la luz emitida durante la fagocitosis (quimio-
luminiscencia). La fagocitosis estimula el metabolismo oxidativo de los granulocitos a través
de una descarga de luz (es decir, quimioluminiscencia), la cual se mide con un espectróme-
tro de centelleo líquido. Los defectos de la activación oxidativa disminuyen la cantidad de
quimioluminiscencia. Se han identificado otros defectos con alteración de la actividad bac-
tericida de los neutrófilos. Las deficiencias de mieloperoxidasa y glucosa–6–fosfato des-
hidrogenasa también conllevan un proceso de muerte bacteriana intracelular defectuoso.
Los defectos adquiridos del proceso de muerte bacteriana intracelular pueden aparecer en
ciertos pacientes tratados con fenilbutazona o corticosteroides o irradiados, así como conse-
cuencia de una infección vírica.
Antes de que acontezca la lisis bacteriana es necesario que haya tenido lugar la fagocitosis.
La fagocitosis granulocítica puede medirse por la ingestión del polisacárido de Escherichia
coli recubierto por gotas de aceite de parafina que contengan colorante rojo o de aceite. La
presencia del colorante en el interior de los neutrófilos puede determinarse por espectrofo-
tometría.
Además de las pruebas in vitro de estimulación del metabolismo oxidativo y fagocitosis neu-
trófila, es posible medir el proceso de muerte bacteriana con una prueba bactericida. Los
granulocitos aislados se incuban con suero (como fuente de opsoninas) y bacterias. A dife-
rentes intervalos de tiempo, se extraen muestras de neutrófilos para medir la población bac-
teriana viable total, la población extracelular y los microorganismos asociados con las célu-
las en la mezcla de reacción. Aunque laboriosos, estos procedimientos pueden medir la ac-
tividad bactericida de los granulocitos.
Las técnicas de citometría de flujo con anticuerpos monoclonales también se han mostrado
útiles para la evaluación de las alteraciones de la fagocitosis. La ausencia de una o varias
glicoproteínas adhesivas a la superficie de los granulocitos, identificadas por los anticuerpos
monoclonales MAC – 1, LFA – 1 o p150,95, se asocia a infecciones recurrentes de los teji-
dos blandos y alteración de la curación de heridas, granulocitosis y función leucocitaria
anómala, inclusive quimiotaxis, adherencia y fagocitosis de partículas recubiertas por com-
plemento.
Recuento de eosinófilos: los valores normales varían de 200 a 500 eosinófilos por milíme-
tro cúbico de sangre. En las manifestaciones alérgicas del árbol respiratorio superior su con-
centración en moco nasal y esputo aumenta considerablemente, y su determinación ayuda a
definir como de origen alérgico muchos casos de rinitis, bronquitis y asma.
En cuanto a la inmunidad específica podemos estudiar las inmunoglobulinas y las poblacio-
nes linfocitarias.
Determinaciones útiles para la cuantificación de γ-globulinas séricas totales e inmu-
noglobulinas individuales.
La electroforesis de las proteínas séricas continúa siendo una prueba inicial útil para valo-
rar las concentraciones totales de γ-globulinas, así como para detectar aumentos monoclo-
nales o policlonales. La electroforesis de zona se emplea para separar componentes en el
suero, orina, líquido cefalorraquídeo y otros líquidos orgánicos. En la mayoría de los patro-
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nes electroforéticos de proteínas séricas se observan cinco bandas. Dichas bandas incluyen
albúmina y globulinas α1, α2, β y γ.
Se pueden observar los siguientes patrones: 1) banda o zona normal de γ - globulina total,
0.6 a 1.2 g/dl. 2) Hipogamaglobulinemia: disminución o ausencia de banda Ig. 3) Hiperga-
maglobulinemia: intensificación y amplificación de la banda, lo que significa que dos o más
de las inmunoglobulinas séricas principales están elevadas (Ig G, Ig A o Ig M); ello acontece
en muchas enfermedades inflamatorias crónicas, tales como el lupus eritematoso sistémico
y la hepatitis crónica activa. Este patrón no tiene validez diagnóstica, pero es útil para seguir
el curso de muchas enfermedades. 4) Un componente M o pico monoclonal, cuyo isotipo
debe ser identificado.
Inmunoelectroforesis: es una técnica que combina los principios de la electroforesis de
zona con los de las reacciones antígeno – anticuerpo. Se efectúa en gel y en dos secuen-
cias. En primer lugar, se separa la proteína por electroforesis de zona en un medio de sopor-
te como agar o agarosa. Seguidamente los grupos de proteínas separados se hacen reac-
cionar con antisuero específico para obtener arcos de precipitación. Un corte largo y estre-
cho, paralelo a la dirección de la separación electroforética, se llena con antisuero; los antí-
genos y el anticuerpo difunden uno a través de los otros, y aparecen las líneas de precipita-
ción en forma de arcos elípticos.
La inmunoelectroforesis se emplea para separar e identificar antígenos de una mezcla com-
pleja. La inmunoelectroforesis sérica que emplea antisueros anti–IgA, anti–IgM, anti–IgG,
anti-κ y anti-λ pueden determinar con precisión virtualmente todos los componentes M. La
detección e identificación de la proteína urinaria homogénea de cadena ligera (proteínas de
Bence Jones) puede llevarse a cabo mediante una combinación de electroforesis en acetato
de celulosa e inmunoelectroforesis de orina concentrada.
Inmunodifusión radial: permite determinar con precisión la concentración tanto de antígeno
como de anticuerpo de una solución. En dos tipos de circunstancias, las pruebas de inmu-
nodifusión radial pueden conducir a concentraciones equívocas de inmunoglobulinas. Si el
suero contiene IgM monomérica de bajo peso molecular (7S), tal como puede ocurrir en la
macroglobulinemia de Waldenström, se pueden hallar concentraciones incorrectamente ele-
vadas de IgM, ya que la IgM 19S usada como estándar difunde con mayor lentitud que a
igual concentración de IgM 7S. Como resultado la Ig M 7S forma un anillo de precipitación
mayor que la misma cantidad de IgM 19S.
La situación opuesta acontece cuando en el suero hay altas concentraciones de factor reu-
matoide IgG 7S. La interacción del factor reumatoide con la región Fc de la IgG produce
complejos de IgG que difunden más lentamente que la IgG nativa, resultando un anillo me-
nor de precipitación y, por ende, una subestimación de las concentraciones totales de IgG.
El dosaje de Ig E total requiere de métodos que permitan detectar cantidades del orden
0,004 por 100 ml, por ello se recurre al RIA. Su elevación moderada refuerza la presunción
diagnóstica de un proceso de tipo alérgico, los títulos altos de IgE con o sin eosinofilia su-
gieren la presencia de parasitismo. La medida cuantitativa en suero para IgE específicos
para el alergeno requiere métodos especiales para detectar las cantidades extremadamente
pequeñas (picogramos por mililitro) que se encuentran en los pacientes. La técnica estándar
es la prueba del radioalergosorbente (RAST). Éste es un sistema de dos fases (sóli-
do/líquido) que utiliza un alergeno insolubilizado que se incuba primero con el suero del pa-
ciente y después con anti IgE humana marcada con isótopos radioactivos para detectar los
anticuerpos específicos para el alergeno del isotipo IgE.
Las desventajas de estos métodos in vitro son biológicas y técnicas. La cantidad de anti-
cuerpo IgE sérico no es necesariamente un reflejo directo del anticuerpo con relevancia bio-
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lógica unido a células cebadas. El resultado de la prueba es falso positivo en pacientes con
un nivel total alto de IgE, debido a unión inespecífica, y es falsamente bajo en pacientes
desensibilizados con niveles altos de anticuerpo IgG.
Estudios cuantitativos de los linfocitos
Tanto las células B como las células T presentan características particulares de antígenos
de superficie y receptores, y cada una de estas clases celulares es responsable de fases
específicas de la respuesta inmune.
Bajo microscopía óptica y electrónica los linfocitos B y T son morfológicamente idénticos,
aunque difieren en ciertas propiedades físicas, tales como densidad y adherencia a ciertas
superficies (nylon, lana).
Los linfocitos humanos de la sangre periférica pueden ser asignados a las categorías de B,
T o célula nula sobre la base de ciertas características de la superficie celular. La inclusión
en una u otra categoría se efectúa mediante pruebas con células mononucleares de sangre
periférica aisladas por centrifugación en soluciones Ficoll – Hypaque, o con sangre total si
se emplea la citometría de flujo láser.
Dentro de las células mononucleadas, casi todo son linfocitos, y de ellos hasta un 80% se
identifican como células T con base en su capacidad para formar rosetas con eritrocitos de
carnero, o con base en la presencia de antígenos de superficie específicos de la célula T
identificados por anticuerpos monoclonales.
Del 10 a 15% son células B, identificadas por presentar moléculas de inmunoglobulinas in-
corporadas en su superficie que pueden detectarse con facilidad con antisuero marcado con
fluoresceína contra las inmunoglobulinas humanas, o mediante antígenos de superficie es-
pecíficos para la célula B. La célula B posee un receptor de superficie para el componente
C3 del complemento y un receptor para la porción Fc de las moléculas de inmunoglobulinas.
Los linfocitos no identificados como células T o B se llaman células nulas. Esta población
engloba a las células asesinas naturales, una población celular de gran importancia para la
defensa del huésped contra las células malignas.
Estudios funcionales in vitro
Activación linfocitaria: se separan los linfocitos y se incuban con mitógenos (PHA, Con A,
fitolaca), esto provoca la división celular en linfocitos funcionalmente normales. Se mide el
grado de división a través de la síntesis de ADN a partir de precursores radiomarcados (ti-
midina tritiada) o por evaluación morfológica y estableciendo el porcentaje de linfoblastos.
Este procedimiento evalúa la sumatoria de los mecanismos involucrados en: reconocimiento
del antígeno, interacción linfocito – macrófago y mediadores solubles. Mide la capacidad
funcional de los linfocitos T o B para proliferar después de una provocación antigénica. Se
puede realizar con antígenos específicos como PPD, toxoide tetánico, suspensiones de
cándidas, etc.
Cultivo mixto de linfocitos (CML): Constituye una prueba especial de estimulación antigé-
nica en la cual los linfocitos responden contra antígenos de histocompatibilidad de otra po-
blación linfocitaria. Las células estimulantes se tratan con radiación o mitomicina para que
no puedan dividirse.
Linfólisis mediada por células (LMC): Sirve para detectar linfocitos T citotóxicos. El primer
paso es igual al de las pruebas anteriores, luego los linfocitos estimulados se enfrentan con
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células blanco marcadas con 51
Cr. El grado de liberación del 51
Cr es proporcional a la lisis
de células blanco, y este a su vez a la cantidad de linfocitos T citotóxicos.
Reacciones inmunohistológicas: la presencia de antígenos o anticuerpos unidos a un
tejido se puede estudiar mediante la tinción de cortes histológicos con anticuerpos especí-
ficos marcados con un colorante fluorescente (inmunofluorescencia) o con enzimas con sus-
tratos cromogénicos (inmunoperoxidasa).
Evaluación in vivo de la inmunidad celular
La inmunidad celular se evalúa in vivo mediante pruebas de intradermorreacción. Para ello
se emplean antígenos obtenidos de diversos microorganismo los cuales se aplican en forma
intradérmica y se lee la reacción inmediata y la reacción retardada.
La presencia de un eritema (zona enrojecida) dentro de las 24 hs alrededor del sitio de ino-
culación indica una respuesta alérgica (humoral) a alguno de los componentes del antígeno
inoculado mientras que una pápula (induración) luego de las 48hs en el sitio de inoculación
indica una respuesta celular debido a un contacto previo con el antígeno, ya sea por infec-
ción o por vacunación.
Son ejemplos de estas reacciones las de Mantoux (tuberculosis), la de Mitsuda (lepra) y la
melitina (brucelosis). Los antígenos utilizados y la forma de interpretación de estas pruebas
se tratarán con cada tema en particular

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