Métodos diagnósticos para las inmunodeficiencias primarias

1. MÉTODOS DIAGNOSTICOS PARA LAS INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS
Dr. Iván Omar Peñafiel Quinteros
Residente de 2º año de Alergia e Inmunología Clínica
Dra. Med. María del Carmen Zárate Hernández
Profesor asesor
28 junio 2019

2. Bousfiha The 2015 IUIS Phenotypic Classification for Primary Immunodeficiencies. J Clin Immunol (2015) 35:727–738
• Diferentes categorías (9) según diferentes
características.
• Exámenes de laboratorios según dichas
características de grupo pero también
comunes a varios grupos.
• Laboratorios solicitados según gravedad y
sospecha diagnóstica de determinado
grupo.
Dr. Peñafiel
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3. INTERACCIÓN ANTIGENO-ANTICUERPO
Reacciones de precipitación de Ag-Ac
Ac-Ag soluble en solución acuosa forman
retículo= precipitado visible.
Owen J.KUBI inmunología 7th edición. McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, 2014.
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4. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de precipitación de Ag-Ac
Las reacciones de precipitación en gel (matriz de agar) producen líneas de
precipitina visibles (INMUNODIFUSIÓN).
• Sirve para determinar concentraciones relativas de Ac o Ag.
• Comparar pureza relativa de preparación de Ag.
INMUNODIFUSIÓN RADIAL SIMPLE (Mancini)
foso
Área del anillo es
proporcional a la
concentración de
Ag
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5. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de precipitación de Ag-Ac
INMUNODIFUSIÓN DOBLE (Ouchternoly)
Se difunden tanto Ag como Ac.
Azul de Coomassie: tiñe proteínas precipitadas
Owen J.KUBI inmunología 7th edición. McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, 2014.
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6. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de precipitación de Ag-Ac INMUNOELECTROFORESIS
• La mezcla de antígeno se somete primero a
electroforesis para separar sus componentes por carga.
• Técnica cualitativa.
• Usada para calcular producción anormalmente alta o
baja de prot/Ig en IDP, o proteínas anormales de estados
inmunoproliferativos (mieloma).
Se añade Ac al surco
Ag-Ac forma arcos de precipitina
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7. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de precipitación de Ag-Ac
ELECTROFORESIS EN COHETE
• Técnica cuantitativa (mide concentraciones de Ag).
• Se somete a electroforesis un Ag (de carga (-) en un gel que
contiene Ac.
• Un limitante es que prot no tenga carga (-) = Ig, algunos Ac.
• El precipitado formado entre el Ag y el Ac tiene el aspecto de
un cohete, cuya altura es proporcional a la concentración de
antígeno en el foso.
Alhabbab RY. Basic serological testing. Techniques in Life Science and Biomedicine for the Non-Expert. Springer Nature 2018. ISSN 2367-1122
Gel con Ac
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8. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de aglutinación de Ag-Ac
AGLUTINACIÓN DIRECTA
• La interacción entre el Ac y un Ag particulado resulta en un
agrupamiento visible llamado aglutinación.
• Ac que la producen = aglutininas
• Usada para identificar grupo sanguíneo, bacteriana (tifoidea).
INHIBICIÓN DE LA AGLUTINACIÓN
• Ensayo muy sensible para cantidades pequeñas de antígeno.
• Permiten determinar si una persona utiliza ciertos tipos de
drogas ilegales, como cocaína y heroína, virus (rubeola).
Owen J.KUBI inmunología 7th edición. McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, 2014.
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9. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de detección de Ag o Ac RADIOINMUNOENSAYO ( RIA )
• Técnica muy sensible.
• Unión competitiva de Ag marcado/no marcado—Ac alta afinidad
• Ag marcado—Ac hasta saturar sitios unión de Ag del Ac.
• Se añade concentraciones crecientes de Ag no marcado [] desconocida.
• También RIA de fase sólida (más fácil separación y medición).
• Múltiples usos: Ac. De todo tipo, ej: hepatitis B.
Fosos de microtítulo
Owen J.KUBI inmunología 7th edición. McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, 2014.
Isótopo emisor de partículas ᵧ como I125, ᵦ tritio (3H): MIDE RADIOACTIVIDAD
Antisuero
antiisotipo
secundario.
(precipita)
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10. PRUEBA INMUNOABSORCIÓN LIGADA A
ENZIMAS (ELISA )
• Similar a RIA pero enzima en vez de marcador radiactivo.
• Múltiples usos ! (medición cualitativa o cuantitativa Ac).
• Más seguras, menos costosas.
• Varias técnicas alternativas:
Dx VIH
INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de detección de Ag o Ac
Owen J.KUBI inmunología 7th edición. McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, 2014.
Fosfatasa alcalina,
Peroxidasa de rábano picante
Galactosidasa.
Ag (fase sólida)
Ac paciente
Anti Ac-Enzima
Sustrato
cromógeno.
ESPECTROFOTOMETRÍA
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11. PRUEBA INMUNOABSORCIÓN LIGADA A
ENZIMAS (ELISA )
ELISA INDIRECTO
Dx VIH
INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de detección de Ag o Ac
Owen J.KUBI inmunología 7th edición. McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, 2014.
sustrato
cromógeno.
Placa de 96 fosos:
Lectura en segundos !
Usado para Dx VIH (semana 6).
lectores espectrofotométricos
de placa especializados
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12. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de precipitación de Ag-Ac PRUEBA INMUNOABSORCIÓN LIGADA A
ENZIMAS (ELISA )
ELISA EN SANDWICH
Foso cubierto
con Ac
Owen J.KUBI inmunología 7th edición. McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, 2014.
• Mide antígenos
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13. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de precipitación de Ag-Ac PRUEBA INMUNOABSORCIÓN LIGADA A
ENZIMAS (ELISA )
ELISA COMPETITIVO
Owen J.KUBI inmunología 7th edición. McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, 2014.
• Cuanto más Ag se encuentra en la muestra, tanto menos Ac libre está disponible
para unirse al foso recubierto con Ag.
• Es un ensayo de tipo inhibición = concentración de Ag es inversamente
proporcional al color que se produce.
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14. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de precipitación de Ag-Ac PRUEBA INMUNOABSORCIÓN LIGADA A
ENZIMAS (ELISA )
ELISA CON QUIMIOLUMINISCENCIA
• Las versiones de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia
usan un sustrato luxógeno (que genera luz) en vez de cromógeno.
• Sustancia luxógena-papel fotográfico = luminómetro.
• Mejor sensibilidad (x 10 a x 200 si se usan agentes de realce)
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5 x 10 -18 moles
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15. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de precipitación de Ag-Ac PRUEBA INMUNOABSORCIÓN LIGADA A
ENZIMAS (ELISA )
ELISPOT
El recuento de las manchas de colores permite determinar cuántas células que
secretaban citocina estaban presentes en la suspensión celular adicionada.
Descartar células
Lavar la placa
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16. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de inmunofluorescencia INMUNOFLUORESCENCIA
Es posible marcar Ac con moléculas fluorescentes (fluorocromos):
• Absorben luz de determinada longitud de onda (excitación)
• Emiten luz de otra longitud de onda (emisión).
Fluorocromo + complejo inmunit Ac = detectables por emisión de
luz de color, si se excitan con una luz de longitud de onda
apropiada (pueden combinarse varios).
Ficoeritrina (derivado de algas. Emite luz roja)
Conjugados en Fc
Enlace covalente
(Especificidad no alterada)
Alhabbab R. Basic serological testing. 2018.
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17. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de inmunofluorescencia
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
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18. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
Reacciones de inmunofluorescencia
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
• No necesita marcaje Ac primario
• Mayor sensibilidad (mayor luminiscencia).
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incubación
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19. INMUNOTRANSFERENCIA (Inmunoblot)
WESTERN BLOTT
• Permite la identificación de una proteína específica o Ac en una
mezcla compleja de proteínas ( Ej: VIH ).
SDS: dodecilsulfato sódico: detergente
desnaturalizador potente.
Remocióndegelyse
efectúaelectrotransferencia
Adición de Ac unidos a enzima que
detecta el Ag de interés
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20. La posición de los Ac se observa mediante una reacción ELISA que genera un producto insoluble de color intenso el cual se deposita en la
banda de la reacción (blot o mancha). Se identifica:
▪ Ac- sustrato cromógeno = produce banda de color en sitio del blot, puede usarse con agentes de realce (más usado).
▪ ELISA quimioluminiscente = genera luz = detectada en pieza de película fotográfica.
▪ Ac radioactivo: Autorradiografía – se expone una placa de rayos X a la membrana.
Adición de Ac unidos a enzima que
detecta el Ag de interés
WESTERN BLOTT
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21. INMUNOPRECIPITACIÓN
• Permite el aislamiento del Ag de interés para un análisis más amplio.
• Prueba muy sensible para la presencia de un Ag particular en un tipo de célula o tejido.
luego inmunoblott
Dorresteyn C. Clinical immunology & serology : a laboratory perspective. 4th ed. Davis Company, Philadelphia 2017.
tejido
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22. NEFELOMETRÍA
Alhabbab RY. Basic serological testing. Techniques in Life Science and Biomedicine for the Non-Expert. Springer Nature 2018. ISSN 2367-1122
Suspensión partículas sólidas
Dispersión
(se observa turbia).
Intensidad de la radiación depende:
• Concentración de partículas
• Tamaño partícula
• Longitud de onda de la luz.
• Método donde la turbidez de una
solución se determina por el patrón de
dispersión de la luz
• Mide cant. de proteína de 1–10 μg/mL.
Determinación niveles de Ig:
• Ig son inyectadas en una cámara de
reacción con Ag específicos de Ac.
• Cuando se forma complejo Ag-Ac se
aplica luz y el grado de dispersión se
mide por un nefelómetro.
• Los fotones son reflejados por los
complejos inmunes en un ángulo y
medidos por un tubo foto-multiplicador.
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23. CITOMETRÍA DE FLUJO
• Son instrumentos en los que se hace pasar
una suspensión de células individuales
alineadas por delante de un láser focalizado.
• El impacto en cada célula produce señales
por dispersión de la luz que son recogidas por
distintos detectores que las convierten en
señales eléctricas que luego serán
digitalizadas y analizadas.
• Alta sensibilidad y objetividad cuantitativa.
• Permite medir parámetros individuales de
subpoblaciones celulares pequeñas.
Filtros
Detectores
1. Sistema de flujo
Focalización
hidrodinámica
2. Sistema óptico
3. Sistema electrónico
• Citómetro de flujo basado en flujo.
• Citómetro de flujo basado en acústica.
• Citómetro de flujo con espectrometría
• de masa.
Goetz C. Flow cytometry basics for the non expert. Springer Nature Switzerland AG 2018. ISSN 2367-1122.
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24. CITOMETRÍA DE FLUJO
DETECTORES :
Forward scatter: FSC
• Dispersión frontal
• Determina el tamaño celular
Side scatter: SSC
• Dispersión lateral (mide dirección perpendicular luz
incidente)
• Determina la complejidad celular (granularidad)
Láser
Representación de la información:
Análisis de datos:
Histogramas:
Monoparamétricos
Biparamétricos (dot plots)
• Medición del tamaño y la complejidad celular
10 μm
18 μm
Goetz C. Flow cytometry basics for the non expert. Springer Nature Switzerland AG 2018. ISSN 2367-1122.
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25. SEPARACIÓN DE POBLACIONES LINFOCITARIAS
CITOMETRÍA DE FLUJO
Preparación de la muestra
LISADO DE ERITROCITOS
Muestra fresca (células vivas)
Hb de gl. Rojos interfiere con lectura
Lavado
y centrifugación.
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26. CITOMETRÍA DE FLUJO
• Identificar y cuantificar poblaciones leucocitarias
• Cluster/cúmulo de diferenciación: CD
Incubación
en oscuridad
Nanoesferas unidas a
fluorocromos - CD
Phycoerythrin
Allophycocyanin
PerCP: complejo
proteico
peridinin-
clorofila
Goetz C. Flow cytometry basics for the non expert. Springer Nature Switzerland AG 2018. ISSN 2367-1122.
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27. 1.Láser azul (488 nm)
2. Láser rojo (633 nm)
3. Láser violeta (405 nm)
4. Láser UV (350 nm)
5. Láser amarillo-verde (561 nm),
1. exita: fluoresceína
Ficoeritrina (rojo)
PerCP
2. Aloficocianina (APC).
(color azul)
PerCP: complejo proteico
peridinin-clorofila
CD2+
CD3+
CD4+
CD8+
CD16/CD56+
CD19+, CD20+
Goetz C. Flow cytometry basics for the non expert. Springer Nature Switzerland AG 2018. ISSN 2367-1122.
CITOMETRÍA DE FLUJO
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28. Goetz C. Flow cytometry basics for the non expert. Springer Nature Switzerland AG 2018. ISSN 2367-1122.
Subpoblaciones linfocitarias:
CD2+
CD3+
CD4+
CD8+
CD16/CD56+
CD19+, CD20+
CITOMETRIA DE FLUJO
Linfocitos asesinos naturales
Linfocitos B
Linfocitos colaboradores
Linfocitos citotóxicos
Linfocitos
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29. CITOMETRÍA DE FLUJO
• Viabilidad celular
( célula muerta permite entrada sustancias por membrana que se unen al ADN)
• Apoptosis
• Ciclo celular
(cantidad fluoresceína proporcional a ADN celular)
• Estudios funcionales
• Genotipado, expresión génica, factores de transcripción
• Separación de muestras (poblaciones. FACS, MACS).
Dr. Peñafiel
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30. Marcadores de superficie de los leucocitos y enfermedades proliferativas
Dr. Peñafiel
CRAIC Mty

31. DETERMINACIÓN DE COMPLEMENTO
Espectrofotometría
Nefelometría
RIA, RID
ELISA
Gadjeva M. The complement system. Methods and protocols. Humana press Springer Science NY. 2014. ISSN 1940-6029
Dr. Peñafiel
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32. DETERMINACIÓN DEL COMPLEMENTO
(funcionalidad)
CH50:
• Mide la función de vía clásica del complemento.
• Incluye C1qrs,C2,C4,C3,C5,C6,C7,C8 y C89.
• Se mide usando eritrocitos de cordero (E) y Ac de conejo (A).
• Se mezclan diluciones seriadas de plasma del paciente con EA en suspensión.
con lisis de eritrocitos y liberación de Hb (Espectrofotometría).
Dilución que lisa 50% eritrocitos es la unidad de CH50 cuantitativa.
AH50:
• Mide la actividad funcional de la vía alternativa.
• ELISA
• Valora deficiencia de factores D,B, C3, properidina, y c5-c9.
Gadjeva M. The complement system. Methods and protocols. Humana press Springer Science NY. 2014. ISSN 1940-6029
Dr. Peñafiel
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33. AISLAMIENTO DE POBLACIONES LINFOCITARIAS
Rosetas
Dorresteyn C. Clinical immunology & serology : a laboratory perspective. 4th ed. Davis Company, Philadelphia 2017.
Eritrocitos de carnero
Receptor Linf T: glicoproteina
Dr. Peñafiel
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34. PRUEBAS DE MIGRACIÓN LINFOCITARIA
• In vivo: Inyectar linfocitos marcados.
Medir por fluorescencia.
• In vitro: prueba de Stamper Woodroofe.
Dorresteyn C. Clinical immunology & serology : a laboratory perspective. 4th ed. Davis Company, Philadelphia 2017.
Dr. Peñafiel
CRAIC Mty

35. PRUEBAS DE ESTIMULACIÓN LINFOCITARIA
Prueba de proliferación de linfocitos T
Citometría de flujo
Lee G. ACAAI review for the allergy immunology boards 3rd ed, 2016: 208-209.
Medición de la respuesta mitogénica a lectinas
Concanavalina A (ConA)
Fitohemaglutinina (PHA)
Fitolaca americana (PWM).
Dr. Peñafiel
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36. PRUEBAS DE ESTIMULACIÓN LINFOCITARIA (Linfocitos B)
Citometría de flujo
(medición linfocitos B)
CD19, CD20
Lee G. ACAAI review for the allergy immunology boards 3rd ed, 2016: 208-209.
Dr. Peñafiel
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37. PRUEBAS DE ESTIMULACIÓN LINFOCITARIA (Linfocitos B)
Citometría de flujo
(medición linfocitos B memoria)
CD19, CD20, CD 27
Lee G. ACAAI review for the allergy immunology boards 3rd ed, 2016: 208-209.
Dr. Peñafiel
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38. PRUEBAS DE ESTIMULACIÓN LINFOCITARIA ( función linfocitaria citotóxica)
Citometría de flujo
Medición linfocitos NK: CD16/ CD56
CD107a
(expresa degranulación
Perforina, Granzima B)
Linfocitos T citotóxicos CD8
Prueba de liberación de cromo
(Cr51)
Lee G. ACAAI review for the allergy immunology boards 3rd ed, 2016: 208-209.
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39. TEST DE FAGOCITOSIS
Quimiotaxis:
• Migración por cámara de pozos múltiples de Boyden
en filtro de microporo de 0.75-5 mm: migración a velocidad
mediante quimioatrayentes en cámara baja.
• Ventana cutánea: área de piel es escarificada y cubierta por
cámara de cinta adhesiva.
Dorresteyn C. Clinical immunology & serology : a laboratory perspective. 4th ed. Davis Company, Philadelphia 2017.
Dr. Peñafiel
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40. Opsonización/endocitosis:
• Test de microbios/partículas de látex (etiquetados con fluorocromo
y opsonizados con Ig y complemento en suero )
TEST DE FAGOCITOSIS
Adhesión
CITOMETRÍA DE FLUJO
Deficiencia de adhesión leucocitaria 1: LAD 1:
CD18 (integrina B)
CD11 Y CD18 en macrófagos.
Deficiencia de adhesión leucocitaria 2: LAD 2:
CD15s
Lee G. ACAAI review for the allergy immunology boards 3rd ed, 2016: 208-209.
Dr. Peñafiel
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41. TEST DE FAGOCITOSIS
Evaluación citotoxicidad de neutrófilos
(por producción de RL dependientes de oxígeno):
Útil para Dx enf. Granulomatosa crónica.
Lee G. ACAAI review for the allergy immunology boards 3rd ed, 2016: 208-209.
Dr. Peñafiel
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42. TEST DE FAGOCITOSIS
Test de nitroazul de tetrazolio (NBT)
• Por estallido respiratorio NBT
amarillo se convierte en precipitado
azul (formazan, depositado en citoplasma).
• Cuanto mayor el color azulado,
mejor producción de RL. VN: ≤ 10%.
• Se deben estimular con C. Albicans u
otras partículas de microorganismos
(acetato de forbol miristato PMA).
Especies reactivas de oxígeno
SUPERÓXIDO
Reducción de ferrocitocromo C
NBT
Isoluminol
Lucinogenino.
Prueba in vitro
Dorresteyn C. Clinical immunology & serology : a laboratory perspective. 4th ed. Davis Company, Philadelphia 2017.
Dr. Peñafiel
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43. TEST DE FAGOCITOSIS
Evaluación citotoxicidad de neutrófilos (por producción de RL dependientes de oxígeno)
Dihidro-rodamina
• Se realiza por citometría de flujo
• Mide actividad funcional de neutrófilos (in vitro).
• Objetiva, sensible.
• Cromógeno permeable a la membrana
celular que ingresa a la célula, oxidada
por el H2O2 (peroxidasa por NADPH)
forma rodamina (molécula fluorescente verde ).
1,2,3 dihidrorodamina (DHR)
Resorufina (10-acetil-3, 7-dihidroxifenoxazina)
Luminol (5-amino-2, 3-dihidro-1, 4-talazinadiona).
2’7’ diclorofl uoresceína (DCF),
Hidroetidina,
4 carboxidihidrotetrametilrosamina.
Dorresteyn C. Clinical immunology & serology : a laboratory perspective. 4th ed. Davis Company, Philadelphia 2017.
Dr. Peñafiel
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44. TEST DE FAGOCITOSIS
Dihidro-rodamina
• Diagnóstico enf. Granulomatosa crónica (tamizaje)
• Seguimiento portadores, post-transplante (quimerismo).
Normal: ↑ índice oxidación >30 Enf. Granulomatosa crónica
No ↑ índice oxidación PORTADORA: Patrón bimodal
Rich R. Clinical immunology, priciples and practice 5th ed. Elsevier, 2019
Dr. Peñafiel
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45. Lee G. ACAAI review for the allergy immunology boards 3rd ed, 2016: 208-209.
ABORDAJE INICIAL LABORATORIAL PARA PACIENTES CON SOSPECHA DE IDP
INMUNIDAD
HUMORAL
(Linfos B)
INMUNIDAD CELULAR
(Linfos T/NK)
FAGOCITOSIS
(Macrófagos, monocitos)
COMPLEMENTO
ABORDAJE
CUANTITATIVO
Citometría de flujo (CF)
CD19, CD20
Ig G, Ig A, IgM
BH + Diferencial
Excluir VIH
CF: CD3,CD4,CD8,
CD16,CD56
Screening neonatal TREC
BH/dif + neutrófilos totales
CF: CD11, CD18 (LAD1)
CF: CD15a (LAD2)
C3,C4
ABORDAJE
CUALITATIVO
O FUNCIONAL
Títulos específicos Ac
vacunales:
Ag proteínas: DT
Ag polisacáridos:
Neumococo,
Meningococo
Pruebas citólisis NK
Estimulación con Ag
Producción citocinas
Pruebas citotoxicidad
Pruebas enzimáticas: ADA,
PNP
Función oxidativa: DHR, NBT,
quimioluminiscencia)
Pruebas enzimáticas: MPO, G6PD.
Función fagocítica
Ac. Antineutrófilos.
CH50
AH50
Actividad de ADA: colorimétria: Incubación de muestra+ adenosina en exceso = concentración amonio resultante (IDCG)
Fosforilasa de nucleósido de purina: panel genético..
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46. MEDICIÓN INMUNOGLOBULINAS
ELISA
WESTERN BLOT
ELECTROFORESIS
(SUBCLASES)
Lee G. ACAAI review for the allergy immunology boards 3rd ed, 2016: 208-209.
Dr. Peñafiel
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47. CONCLUSIONES PERSONALES
• Es importante conocer los exámenes de laboratorio disponibles para
orientar a un diagnóstico certero en las inmunodeficiencias primarias, en
especial en aquellas donde un abordaje precoz mejorará el pronóstico.
• Conocer la técnica de los estudios de laboratorio mejora el abordaje de las
IDP, al conocer sus limitaciones, los exámenes de elección, costos y
disponibilidad.
• Pese a no estar disponibles todos los exámenes de laboratorio de elección
para el diagnóstico de IDP, su conocimiento siguiendo una ruta crítica
permitirá un mejor abordaje y de ser posible el llegar a diagnósticos
complejos.
Dr. Peñafiel
CRAIC Mty

48. GRACIAS