EcoRI BamHI SmaI

1. 1
UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL
CURSO:
BIOTECNOLOGIA
TEMA:
“REPLICA DE TRES ENZIMAS DE RESTRICCION CLIVANDO DEL
ADN”
DOCENTE:
Dr. SOTO GONZALES, HEBERT HERNAN
PRESENTADO POR:
LOPEZ CALACHUA, JENNIFER ANDREA
ILO
Noviembre, 2020
VII SEMESTRE

2. 2
CONTENIDO
I. INTRODUCCION .............................................................................................................. 3
II. OBJETIVOS........................................................................................................................ 4
2.1. Objetivo general .......................................................................................................... 4
2.2. Objetivos específicos................................................................................................... 4
III. MARCO TEORICO ........................................................................................................... 5
3.1. Enzimas de restricción................................................................................................. 5
3.2. Ligadura y digestión de enzimas de restricción........................................................... 6
3.3. El ADN ligasa.............................................................................................................. 7
3.4. Aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades genéticas ........................................ 8
IV. MATERIALES Y EQUIPOS ............................................................................................. 9
V. METODOLOGIA .............................................................................................................. 9
VI. RESULTADOS ................................................................................................................ 10
6.1. Eco RI........................................................................................................................ 12
6.2. BamHI ....................................................................................................................... 12
6.3. SmaI........................................................................................................................... 13
VII. CONCLUSIONES.......................................................................................................... 14
VIII. RECOMENDACIONES................................................................................................. 14
IX. REFERENCIAS.............................................................................................................. 15

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I. INTRODUCCION
El descubrimiento, la caracterización y el aislamiento de los diferentes tipos de enzimas ha
facilitado en la investigación las tareas del estudio de los genomas, así como su expresión, su
regulación y su posterior correlación con el desarrollo de diversas enfermedades. Hoy por hoy
es común la aplicación de técnicas de biología molecular en diversas áreas, y en particular en
las ciencias de la salud, ya que han revolucionado los métodos analíticos generando gran
impacto en la investigación básica y la clínica, especialmente en el diagnóstico de
enfermedades.
La biología molecular ha revelado en el último siglo varios de los mecanismos fundamentales
que sustentan el funcionamiento de la célula. Hoy en día, el papel de las biomoléculas
poliméricas el ácido desoxirribonucleico ADN), el ácido ribonucléico (ARN) y las proteínas en
la salud y en las aplicaciones biotecnológicas se estudia en todos los niveles educativos.
Algunos de los conocimientos más populares derivados de la biología molecular son la
codificación química de información en el ADN, la secuenciación del genoma humano, la
posibilidad de las terapias génicas, el diagnóstico molecular de enfermedades y la clonación de
genes. Estos conocimientos no solo han sido de alto impacto científico y tecnológico, también
han fascinado tanto negativa como positivamente al imaginario colectivo.
Los descubrimientos de la biología molecular y sus ramificaciones hacia la medicina, la
biología celular y la biotecnología no se pueden entender sin el avance de las herramientas de
análisis, síntesis y modificación de las moléculas de la vida. Entre los múltiples métodos de los
que se vale el biólogo molecular, cinco han sido pilares en el desarrollo de la biología molecular
y son parte esencial de la investigación moderna. Estos métodos son: electroforesis,
secuenciación, clonación, hibridación y reacción en cadena de la polimerasa.

4. 4
II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
 Elaborar una réplica a escala de 3 enzimas de restricción en base a materiales
reciclados o artesanales, a una dimensión 3D.
2.2.Objetivos específicos
 Realizar una investigación de los fundamentos básicos de endonucleasas o enzimas de
restricción.
 Identificar las enzimas de restricción más comunes, su fuente, secuencia de
reconocimiento y resumen de restricción.

5. 5
III. MARCO TEORICO
3.1.Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción se encuentran en bacterias (y otros procariontes). Reconocen
secuencias específicas de ADN, llamadas sitios de restricción, y se unen a ellas. Cada enzima
de restricción reconoce solo uno o unos pocos sitios de restricción. Cuando encuentra su
secuencia blanca, la enzima de restricción cortará las dos cadenas de una molécula de ADN.
Por lo general, el corte es en o cerca del sitio de restricción y ocurre en un patrón ordenado y
predecible.
Las enzimas de restricción presentan actividad endonucleasa, son de origen bacteriano y cortan
los enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia específica denominada secuencia diana. El
uso de estas enzimas como herramienta biotecnológica surgió de la necesidad de cortar las
largas cadenas de ADN genómico para manipularse y analizarse en fragmentos más pequeños.
El empleo de las enzimas de restricción y otras enzimas que modifican ácidos nucleicos, como
la ligasa, permitió desarrollar la metodología del ADN recombinante.
Como un ejemplo de cómo una enzima de restricción reconoce y corta en una secuencia de
ADN, veamos a EcoRI, una enzima de restricción de uso común en el laboratorio. EcoRI corta
en el siguiente sitio:
Figura 1:
EcoRI, una enzima de restricción
Cuando EcoRI reconoce y corta este sitio, siempre lo hace en un patrón muy específico que
produce extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla:

6. 6
Figura 2:
Corte del sitio EcoRI
Si otro fragmento de ADN tiene secuencias sobresalientes complementarias (porque también
se cortó con EcoRI, por ejemplo), los extremos pueden unirse por complementariedad de bases.
Por esta razón se dice que las enzimas que dejan extremos de cadena sencilla producen extremos
cohesivos. Los extremos cohesivos son útiles en la clonación porque mantienen dos fragmentos
de ADN juntos para que el ADN ligasa los pueda unir.
No todas las enzimas de restricción producen extremos cohesivos. Algunas producen "extremos
romos", cortes a la mitad de la secuencia blanco que no dejan extremos de cadena sencilla. La
enzima de restricción SmaI es un ejemplo de enzima que corta así:
Figura 3:
Enzima de restricción SmaI
El ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre sí. Sin embargo, es más difícil ligar
fragmentos romos (la reacción de ligación es menos eficiente y es más probable que falle)
porque no hay secuencias sobresalientes de cadena sencilla que sostengan a las moléculas de
ADN en su posición.
3.2. Ligadura y digestión de enzimas de restricción
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción son enzimas procarióticas que
reconocen y cortan el ADN en secuencias específicas, denominadas sitios de restricción. Se
cree que evolucionaron como un mecanismo de defensa contra el ADN extraño, como el ADN
viral. Se han identificado más de 3000 enzimas de restricción. Algunas de las enzimas de
restricción más comunes se muestran en la siguiente tabla, donde las flechas hacia arriba y hacia

7. 7
abajo muestran los sitios de escisión. Las enzimas de restricción se nombran según el organismo
procariótico del que se aíslan. Por ejemplo, los aislados de Escherichia coli comenzarían con
Eco. Como la tabla siguiente muestra, la digestión con las enzimas de restricción dará como
resultado extremos superpuestos o romos. EcoRI produce extremos superpuestos "pegajosos":
la enzima se escinde entre G y A en ambas hebras. Por otro lado, la escisión de la enzima de
restricción SmaI produce extremos "romos". La enzima se escinde entre G y C en ambas
cadenas.
Tabla 1:
Endonucleasas de restricción comunes
Enzima Fuente
Secuencia de
reconocimiento
Resumen de restricción
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC3'CTTAAG
5 '--- G ↓ AATTC --- 3'3'
--- CTTAA ↑ G --- 5 '
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC3'CCTAGG
5 '--- G ↓ GATCC --- 3'3'
--- CCTAG ↑ G --- 5 '
TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA3'AGCT
5 '--- T ↓ CGA --- 3'3' --
- AGC ↑ T --- 5 '
HinfI Haemophilus influenzae 5'GANTCA3'CTNAGT
5 '--- G ↓ ANTC --- 3'3' -
-- CTNA ↑ G --- 5 '
Sau3A Staphylococcus aureus 5'GATC3'CTAG
5 '--- ↓ GATC --- 3'3' ---
CTAG ↑ --- 5 '
PvuII Proteus vulgaris 5'CAGCTG3'GTCGAC
5 '--- CAG ↓ CTG --- 3' *
3 '--- GTC ↑ GAC --- 5'
SmaI Serratia marcescens 5'CCCGGG3'GGGCCC
5 '--- CCC ↓ GGG --- 3' *
3 '--- GGG ↑ CCC --- 5'
HaeIII Haemophilus aegyptius 5'GGCC3'CCGG
5 '--- GG ↓ CC --- 3' * 3
'--- CC ↑ GG --- 5'
3.3. El ADN ligasa
Si ya conoces la replicación del ADN, tal vez ya te hayas encontrado con el ADN ligasa. En la
replicación del ADN, el trabajo del ADN ligasa es unir fragmentos de ADN recién sintetizados
para formar una cadena continua. Las ligasas utilizadas en la clonación de ADN hacen
básicamente lo mismo. Si dos fragmentos de ADN tienen extremos complementarios, el ADN
ligasa puede unirlos para formar una molécula sin interrupciones.

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Figura 4:
ADN Ligasa
¿Cómo logra esto el ADN ligasa? Mediante el uso de ATP como fuente de energía, la ligasa
cataliza una reacción en la que el grupo fosfato del extremo 5' de una cadena de ADN se une al
grupo hidroxilo del extremo 3' de la otra cadena. Esta reacción produce un esqueleto de azúcar-
fosfato intacto.
El estudio de estas enzimas permitido un avance significativo en la investigación, y aportado
principalmente al desarrollo epidemiología molecular como ciencia aplicada para el
conocimiento de características genotípicas de comunidades bacterianas en diferentes
ambientes como el ambiental, veterinario y humano, y generado conocimiento sobre el
comportamiento epidemiológico y los cambios que las poblaciones principalmente bacterianas
han desarrollado como mecanismo de defensa y/o adaptación a sus condiciones de hábitat.
3.4. Aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades genéticas
Gracias a las enzimas de restricción somos capaces de diagnosticar ciertas enfermedades
genéticas, bien sean debidas a una variación en el material genético (duplicación, deleción, etc)
o bien sean debidas a una mutación en una base puntual. El procedimiento para dicho
diagnóstico consistiría en amplificar por PCR una región concreta del cromosoma donde
sepamos que debería estar o no ese cambio genético y añadir la enzima o enzimas de restricción
para que así se realicen los cortes pertinentes. Tras realizar dichos cortes, correremos nuestras
muestras en un gel de electroforesis y veremos las diferencias de tamaños que existen. Si la
mutación genera una deleción, al correr en la electroforesis observaremos un fragmento menor
al que esperaríamos de un paciente sano, de tal manera que lo podríamos diagnosticar. Si la
mutación, por el contrario, genera una mutación puntual, podremos aprovecharla para utilizar
una enzima en ese punto y que así, si no existe dicha mutación, ese corte no se producirá y
obtendremos un fragmento mayor en el gel de electroforesis.

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IV. MATERIALES Y EQUIPOS
 Alicates
 Plastilina de colores
 Cable viejo (aproximadamente 2m)
 Cámara fotográfica
 Computador
V. METODOLOGIA
1. De las tiras de cable usadas que ya se encontraban en desuso por su limitado tiempo de
vida de algunos cables, le retiré el plástico protector con ayuda de un cuchillo, obteniendo
los alambres para el soporte de mi maqueta del ADN. Cortando 2 trozos de ella para simular
el esqueleto azúcar-fosfato del ADN y 18 piezas más pequeñas simulando las bases del
ADN. Obteniendo lo siguiente:
Fuente: Elaboración propia
2. Para formar un esqueleto para el ADN, se trenzo de manera que todas las piezas queden
unidas entre sí y dándole una forma final, simplemente la base.
Fuente: Elaboración propia
3. Finalmente, con la plastilina le dio volumen al esqueleto del ADN como a las enzimas que
clivan del ADN.

10. 10
Fuente: Elaboración propia
VI. RESULTADOS
 Logrando el objetivo de elaboración de una réplica de ADN en 3D, e identificando 3
enzimas como son la EcoRI, Bam HI y Sma I, se pudo reconocer cada una de las bases
que conforman el ADN, reconociendo de cerca su estructura y la función de corte de las
enzimas de restricción o endonucleasa.
 Las enzimas de restricción son extraídas de bacterias y toman el nombre de la misma.
Las endonuclesosas restringen las cantidades de bacteriófagos en las baterías y estas
forman parte del sistema inmune de ellos
 La enzima de restricción EcoRI; la letra E significa el género en este caso escherichia,
la co la especie que es coli, la R es el nombre de la cepa RV13 y el número es el orden
de descubrimiento de la endonnucleasa de esa cepa.

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↓
5′
GAATTC 3′
3′
CTTAAG 5′
↑
↓
5′
GGATCC 3′
3′
CCTAGG 5′
↑
↓
5′
CCCGGG 3′
3′
GGGCCC 5′
↑

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6.1. Eco RI
Producida por el microorganismo Escherichia coli que posee una diana de restricción en el
ADN de cadena doble dependiente de una secuencia metilada (al estar la hebra metilada, no
hay corte), palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera
extremos cohesivos. Es sin duda la enzima más conocida dentro del mundo académico.
Figura 5:
Resultado de corte de la enzima EcoRI
6.2. BamHI
Es una enzima de restricción de tipo II producida por el microorganismo Bacillus
amyloliquefaciens que posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble dependiente
de una secuencia no metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica
hidrolasa genera extremos cohesivos.
Figura 6:
Resultado de corte de la enzima BamHI
G
A
A
T
T
C

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6.3. SmaI
es una enzima de restricción de tipo II producida por el microorganismo Serratia marcescens
que posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble dependiente de una secuencia
no metilada, palindrómica y no escalonada, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera
extremos romos.
Figura 7:
Resultado de corte de la enzima SmaI

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VII. CONCLUSIONES
 La entrada de la enzima ligas la cual forma enlaces covalentes entre los extremos 5’ de
cada cadena polinucleotidica y el extremo 3’ en cada cadena polinucleotidica, también
se denomina enzima de unión de polinucloetidicos.
 Se da por concluido que las enzimas de restricción cortan el ADN tiene dos tipos de
corte y una de ellos es lejos del sitio de reconocimiento por medio de formación de asas.
Reconoce el ADN, metila a la secuencia de reconocimiento y corta el ADN a distancia
del sitio de reconocimiento.
 Las enzimas de restricción necesitan condiciones especiales para poder llevar acabo su
función correctamente, como por ejemplo una temperatura optima y un Ph adecuado,
de igual forma contaminantes como proteína, sales, etanol, inhiben las endonucleasas.
VIII. RECOMENDACIONES
 Para la elaboración de esta maqueta conseguir un material rígido y resistencia que
soporte un peso considerable para el tamaño.
 Dependiendo de su magnitud se podría utilizar mayor cantidad de cables, así como
mayor cantidad de plastilina o algún material parecido
 Recomendemos utilizar objetos que ya no usen en casa, evitando el consumo de nuevos
materiales si en caso no contamos con un plan de manejo de residuos como depósitos
de reciclaje.

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IX. REFERENCIAS
Aguirre García, A. (2019). Enzimas Biotecnológicas y su aplicación a la industria
alimentaria. Madrid. Obtenido de
http://147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/ALMUDENA%20AGUIRRE%20GA
RCIA.pdf
BIOTED. (s.f.). Introducción a las Enzimas de Restricción. Obtenido de
https://www.bioted.es/protocolos/INTRODUCCION-ENZ-RESTRICCION.pdf
Douglas Wilkin, P. (s.f.). Gene Cloning - Advanced. Obtenido de ck-12 Foundation Home:
https://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/
Khan Academy. (2018). Las enzimas de restricción y la ADN ligasa. Obtenido de Khan
Academy Web Site: https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-
technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase