1. SYSTEMS ANALYSIS OF TRANSCRIPTION FACTOR
ACTIVITIES IN ENVIRONMENTS WITH STABLE AND
DYNAMIC OXYGEN CONCENTRATIONS
Matthew D. Rolfe, Andrea Ocone, Melanie R.
Stapleton, Simon Hall, Eleanor W. Trotter, Robert K.
Poole, Guido Sanguinetti and Jeffrey Green
Maria Alejandra Lugo
Marcela Osorio Santos
Molecular Biology
September 4
Universidad Pontificia Bolivariana

2. INTRODUCTION
 Transcription is the process responsible for the
synthesis of an RNA molecule from the genetic
information contained in a template sequence of one of
the DNA strands (3-5).
 Has a promoter: Start Marker
Operons: regulate transcription
 Steps: Initiation: recognize the promoter
Elongation: stick the RNTP
Finishing: the sequence is transcribed

3. INTRODUCTION
 A transcription factor is a protein involved in regulating
DNA transcription, but not forming part of the RNA
polymerase.
 It can act by recognizing and binding to specific DNA
sequences, binding to other factors, or by directly
binding to the RNA polymerase.
 It is stimulated by cytoplasmic signals.

4. INTRODUCTION
 E. coli is a facultative anaerobic organism, can grow
both in the presence or absence of oxygen, because
when it is available, uses it as a terminal electron
acceptor, but when oxygen is absent, other biochemical
pathways used to generate energy.

5. INTRODUCTION
 The bacterium Escherichia coli K-12 is a key model
organism that is able to grow in the presence or
absence of oxygen.

6. INTRODUCTION
 Escherichia coli K-12 has two major oxygen-
sensing transcription factors (TFs): the indirect
oxygen sensor ArcBA and the direct oxygen sensor
FNR [7]. Together, these regulators optimize growth
in the presence or absence of oxygen by
remodelling central metabolism.
 Consequently, regulatory circuits that react to key
metabolic signals must be integrated into the
bacterial response to oxygen

7. INTRODUCTION
 To fully understand the complex regulatory
remodelling underpinning responses to changes in
oxygen availability requires detailed knowledge of
the changes in activity of multiple TFs

8. OBJETIVE
 Identify systems analysis of transcription factor
activities in environments with stable and dynamic
oxygen concentrations

9. MATERIALES Y METODOS
 CEPAS: Escherichia coli K-12 MG1655 y sus
derivados JRG6009 (a lac mutante que lleva el FF
(-41,5) FNR-plásmido reportero y JRG6031
( pdhR mutante) fueron utilizados. En estados de
cultivo equilibrados, manteniendo condiciones
estables o dinámicas de oxigeno.

10. MATERIALES Y METODOS
 Aislamiento de ARN: Se extrajo el ADN de las
cepas cultivadas y luego se cuantificó por
espectrometría.

11. MATERIALES Y METODOS
 Transcripcion de perfiles: es un método utilizado
para recolectar y analizar los genes que son
expresados.
 Se deposita en un Microarray
 Suelen utilizarse para identificar genes con una
expresión diferencial bajo condiciones distintas
(aerobio-anaerobio)

12. MATERIALES Y METODOS
 PCR: fue descrita Kary Mullis, se usa para obtener un
gran número de copias de un fragmento de ADN
 Etapas: Desnaturalización
Alineamiento
Síntesis
Caracteristicas: Rendimiento
Duración
Especificidad
Capacidad de detección
Fidelidad

13. MATERIALES Y METODOS
Transcriptomic : utilizado para deducir la actividad
de TFS 134.
 TFI NFER se basa en un modelo probabilístico
que se basa en una aproximación log-lineal de la
dinámica de la transcripción.

14. MATERIALES Y METODOS
 Transcripcion In vitro: Se realizo la transcripcion de
un fragmento ADN de 426 pb de longitud y se
amplificó con los siguientes cebadores:
adelante CGAATTCTGTGGGTCGGATA y
CAGCTGTGTTGCCATTTCC inversa

15. MATERIALES Y METODOS
 Fosforilación de la proteína arcA: Se fosforiló en
condiciones necesarias para dicho proceso, luego
se cuantifico su fosforilación usando Phos-tag-
electroforesis.
 La proteína Arca es un sensor indirecto de la
presencia de oxigeno, la cuantificación de la
fosforilación se realiza para determinar presencia o
no de O2

16. RESULTADOS
 LA ACTIVIDADES DE 7 REGULADORES GLOBALES
QUE REGULAN LA EXPRESION GENETICA EN
RESPUESTA A LA DISPONIBILIDAD DE OXIGENO:
E. Coli cultivada en entornos estables.
Los siete TFS globales mostraron una actividad alterada a
través de la escala de aerobiosis.
Están conectados al estado energético de la bacteria, y
recuperar que la disponibilidad de oxígeno tiene efectos
profundos en E. coli K-12.

17. RESULTADOS
 TF: Arca y FNR regular la respiración en respuesta a la
disponibilidad de oxígeno;
PCR y Lrp censan el estado nutricional
Fis, H-NS y IHF modifican la topología del ADN, que es a
su vez depende de la condición de energía.
 La actividad de H-NS es el más bajo en el rango de
aerobiosis; y la actividad Fis es mucho mayor en
condiciones de suministro de un exceso de oxígeno.

18. RESULTADOS
 Las actividades de ARCA, FNR, IHF y Lrp disminuyó a
medida que aumentó aerobiosis.
 EFECTOS ESPACIALES PUEDEN DAR CUENTA DE LA
RESPUESTA DEL FNR EN CULTIVOS DE ESTADO
ESTACIONARIO MANTENIDOS A PUNTOS FIJOS EN LA
ESCALA DE AEROBIOSIS
Aunque el oxígeno está presente en concentración suficiente
para alterar la fisiología celular y la actividad ArcBA , el citoplasma
bacteriano sigue siendo esencialmente anaeróbico

19. RESULTADOS
El consumo eficiente de oxigeno por las oxidasas
terminales, que están localizadas en la membrana celular
impidiendo que el oxigeno alcance la mayor parte del
citoplasma.

20. RESULTADOS
 PERTURBACIÓN DE ESTADO ESTACIONARIO EN
CULTURAS CON IDENTIFICACION DE UN NÚCLEO
SENSIBLE A OXÍGENO Y LA RED DE TF.
Se obtuvieron muestras de perfiles de transcripción: para
transición de anaerobio-aerobio transición aeróbica-
anaeróbica: la tasa de cambio en la disponibilidad de
oxígeno para las dos transiciones fue similar, pero con
signo opuesto.

21. RESULTADOS
 Cambios en la disponibilidad de oxígeno (detectada
directamente por FNR, y indirectamente por ARCA)
afectan el estado redox del sistema, lo que conduce a
las consecuencias de la homeostasis de iones
metálicos (cobre, molibdato, hierro, detectada por
CusR, modo y piel), el exceso de producción de
metabolito (formiato y piruvato; detectada por FhlA y
PdhR) y la envoltura celular,-estrés (detectada por
CPXR).

22. RESULTADOS
La influencia de la disponibilidad de oxígeno en el E.
coli K-12 es controlado por el regulador sensible al
oxígeno , Arca y FNR, y tambien se sugiere que la
actividad de una red central de 16 TFS se modula para
coordinar la expresión de genes en la E. coli K-12 en
entornos con diferentes, pero estables, o en entornos
inestables de la disponibilidad de oxígeno.

23. RESULTADOS
 Arca, CRP, Fis, FNR, H-NS, IHF y Lrp son
reguladores verdaderamente globales, con respecto
a la respuesta a la disponibilidad de oxígeno, en el
sentido de que sus salidas crear el marco
transcripcional en el que los reguladores locales
funcionan en respuesta a determinados entornos
inestables.

24. RESULTADOS
 PDHR COMPORTAMIENTO DURANTE TRANSICIONES
PARA EL IRREVERSIBILIDAD DEL PERFIL DE
TRANSCRIPCIÓN NDH
Una de las adaptaciones hechas por E. coli en respuesta a la
alteración disponibilidad de oxígeno es la "mezcla y
combinación“ de deshidrogenasas (NDH-I, codificada por el
operón nuo, y, NDH-II, codificado por ndh) y oxidasas
terminales (por ejemplo, citocromo bo0, codificada por el
operón CYOA-E, y el citocromo bd-I, codificada por el operón
cydAB) para optimizar conservación de la energía y el
potencial de crecimiento.

25. RESULTADOS
 Las respuestas de las transcripciones NUO operón
que codifica para la conservación de la energía NDH-
I fueron mínimos.
 Por el contrario, la transcripción ndh, que codifica la
nonproton NDH-II, respondió fuertemente en la
transición de anaeróbico a condiciones aeróbicas

26. RESULTADOS
 Además de la regulación por Arca y FNR, la expresion
de ndh es reprimida por la TF-piruvato sensible a
PdhR.
 La expresión ndh fue rápida y fuertemente mejorado en
la transición anaeróbico a aeróbico lo que se podría
explicar por Arca, FNR y PdhR :todo reprimir la
expresión ndh bajo condiciones anaeróbicas seguido
por una rápida remoción de la represión tras la
introducción de oxígeno, para inactivar Arca, FNR y
PdhR.

29. DISCUSSION
Who said What he said Yes No
Alexeeva S At 0 per cent aerobiosis, cultures are anaerobic, whereas X
at 100 per cent aerobiosis, cultures have just sufficient
oxygen to grow entirely by aerobic respiration (at
aerobiosis values greater than 100%, the oxygen supply
exceeds the amount required to support aerobic
respiratory growth). The region between 0 and 100 per
cent aerobiosis is the micro-aerobic range.
Martinez- suggested that global TFs can be identified by the X
Anatonio A breadth of their regulons, their interactions with co-
regulators and alternative s factors, the
number of ‘slave’ TFs, the size of their evolutionary
families and the range of conditions under which they are
active
Crack JC y Jervis mediates changes in gene expression through its X
AJ cognate regulator ArcA when the supply of oxygen is
insufficient to fully penetrate the cytoplasm and inactivate
the direct oxygen sensor FNR.
Storz G OxyR and SoxS are the major regulators of the oxidative X
stress response in E. coli K-12

30. CONCLUSION
 E.coli is a microorganism suitable for in vitro
experiments, due to its adaptability to the
environment, either aerobic or anaerobic, since these
conditions modify their growth in terms of gene
expression but not stop growing.
 There are sensors for the presence of oxygen, as are
the protein FNR ARCBA and both are responsible for
gene expression in the presence or absence of this gas.

31. CONCLUSION
 E. coli is a microorganism highly variable, which
can grow in different environmental conditions.
 transcription factors are important for the
transcription of DNA, and as discussed in this
article have important functions in the proper
development of the E. coli