Revisión de artículo "Producción de vacas transgénicas que expresan ácidos grasos Omega-3".

1. Producción de vacas
transgénicas que expresan
ácidos grasos Omega-3.
Manuel García-Ulloa Gámiz
Mariette Viladomat Jasso

2. Introducción
-Aumento en el tiempo de
coagulación (evitan
problemas
cardiovasculares)
-Cerebro
-Anti depresivo
Proporciones no-equitativas,
donde n-6 se encuentra en
altas cantidades:
-Cáncer
-Enfermedades
cardiovasculares
-Desórdenes mentales.
• Proporción ideal  1:1
•Razón de consumo humano actual,
8-16  10:1 o 30:1

3. •Los mamíferos carecen de enzimas: n-6 o n-3
sintetasas // enzimas que conviertan n-6 a n-3
 Ingesta constante.
•Fijación de metilmercurio y otros metales
toxicos en peces, por lo que es un peligro para
el ganado; además de $.
•Se reportó la expresión del gen humanizado
fat-1 (hfat-1) de C. elegans en ratón (y puerco) y
en su leche (aumento de n-3 y descenso de n-
6/n-3).
•Las crías alimentadas con leche rica en n-
3, presentaron niveles altos de ácido
docosahexaenóico en el cerebro.
•Genes de desaturasas de ác. grasos
aislados de plantas como la espinaca, se
expresan bien en mamíferos después de
ser introducidos a células animales.

4. EN EL ESTUDIO:
•Se construyó un vector de expresión con el gen fat-1 ‘mamalizado’ (mfat-1).
•Se introdujo el vector en fibroblastos primarios de un feto bovino.
•Se produjo una vaca transgénica que expresara el gen mfat-1 a través de
transferencia nuclear de células somáticas.
•Se analizaron las composiciones de los ácidos grasos poli insaturados n-3
y n-6 del producto transgénico.

5. Construcción del Vector de
expresión para el gen mfat-1.
1) La región codificante para el
gen fat-1 (C. elegans), se
optimizó para la expresión en
células mamíferas y se
nombró mfat-1.
MATERIALES Y MÉTODOS:
2) El cDNA de mfat-1 se
sintetizó
3) Y se introdujo al vector de
expresión pST200
•Potenciador de creatina cinasa (de
músculo de ratón).
•Potenciador de citomegalovirus con
promotor de B-actina (de pollo).
•Cassette de expresión pgk-neo, seguido
de sitios loxP (adherido como marcadores
de selección).

6. Cultivo de células y preparación de
las células transfectadas.
• Las líneas celulares donadoras se establecieron de un
feto de vaca Holstein de 50 días.
• Se picó el tejido y se suspendió en DMEM/Ham’s F12
(medio de cultivo celular) suplementado con FBS (suero de
feto de bovino) y antibióticos. <En un frasco de cultivo de 25
cm2 a 39°C; aire humidificado y 5% de CO2, por varios
días>
• El vector de expresión para mfat-1 se linearizó y se
transfectó en fibroblastos (de pasaje temprano) del feto de
bovino, a través de electroporación.
• Se seleccionaron las células transfectadas con 250 µl/ml
de G418 (antibiótico selectivo). Se combinaron (en un pool)
y se usaron para clonar embriones transgénicos (con mfat-
1) con el método a continuación:

7. Maduración de Ovocitos in vitro
• Ovarios bovinos se colectaron de
un matadero y un cúmulo complejo
de ovocitos fueron aspirados de
folículos de 3-8mm.
• Se seleccionaron ovocitos con un
citoplasma uniforme y capas
intactas, para su seguido cultivo en
un medio de maduración (M199 +
10% FBS, 0.5 µl/ml FSH, 5 µl/ml LH
y 100 U/ml penicilina/ 100 µl/ml
estreptomicina) durante 20 horas.
• A aquellos ovocitos con su primer
corpúsculo polar, se les extrajo el
núcleo.

8. Transferencia nuclear
• Las células transfectadas se
transfirieron al espacio perivitelino
de los ovocitos sin núcleo 
fusionados, en buffer de manitol,
por dos descargas de 1.8 kV/cm
por 20 µs.
• Los clones se activaron con 5 µM
de ionomicina por 5 min y tratados
con 10 mg/ml de clicloheximida en
medio CR1aa por 5 hr y aire con
5% de Co2 a 38°C.
• Seguido a la activación, los
embriones se cultivaron en medio
CR1aa, suplementado con BSA
por 40 hr para después ser
tranferidos y cultivados en medio
CR1aa + 4% FBS.

9. Transferencia del embrión y
evaluación del embarazo
1) Transferencia de
blastocistos a vacas nodriza
en día 7.
2) Detección
de embarazo
con
ultrasonido
transrectal a
los 60 días.
3)
Monitoreos
de vacas
preñadas por
palpación o
ultrasonido
cada 30 días.

10. Análisis con RT-PCR tejido de
orejas de los becerros fundadores
• Muestreo de tejido de oreja.
• Extracción de RNA con TriZol.
• Transcripción reversa con transcriptasa reversa del virus
aviar de mioblastosis (AMV).
PCR mfat-1
(incubación por 35 ciclos)
94ºC – 30s
65ºC – 30s
72ºC – 60s
Gel de agarosa al 1%

11. Extracción de
DNA genómico de
tejido de orejas.
Hibridación Southern Blot
standard.
*Vector pIE-fat1 como
control positivo.
Amplificación de
fragmento de 534 pb con
primers interiores.
Southern Blot de DNA genómico de
becerros fundadores
Digestión con EcoRI en
exceso por 18 hrs.
Amplificación de
fragmento de 727pb con
primers exteriores.

12. Análisis de ácidos grasos en tejido
Extracción de
lípidos
Solución: Tejido +
metanol +
cloroformo + agua
(x 15 mins).
Centrifugación.
+ cloroformo
Separación y procesamiento
de fase inferior.
Vórtex y recuperación
de fase superior.
Secado, resuspensión
e inyección en
columna capilar.
Cromatografía
de gases
Identificación de
componentes

13. Reproducción y lactancia de la
vaca transgénica
• Primer celo a los 13 meses de edad.
• Inseminación artificial a los 14 meses de edad.
• Detección de embarazo por ultrasonido transrectal a los 60 días.
• Luego de parir, se tomaron muestras de leche y se analizaron
(mismo protocolo que con tejido).

14. Análisis estadístico
• Prueba t student
– Diferencia estadísticamente significativa : p<0.05

15. Desarrollo de embriones
reconstruidos.
RESULTADOS:
• De total de 224 ovocitos reconstruídos (transfectados) que fueron obtenidos:
Tasa de fusión – 83%
Tasa de escotamiento – 84%
Tasa de desarrollo de blastocistos – 34%
• 48 blastocistos fueron transferidos a 23 madres-vaca nodrizas (sincronizadas),
donde:
Tasa de término de embarazo – 8.7%
• Dos vacas nodriza (tras 281 días de embarazo) parieron a sus terneros en el
mismo día. Fueron nombrados ZK001 (con 32.2kg) y ZK002 (con 32.6kg).
•Se logró 1 ternero transgénico que expresó el gen mfat-1.

16. RT-PCR y Southern blot
demostraron transgénico positivo.

17. Composición de ácidos grasos en
tejido de la vaca transgénica

18. Producción de n-3 y n-6 en todas
las vacas
La vaca transgénica produjo el
doble de n-3 en relación a n-6

19. Composición de ácidos grasos de
la leche de la vaca transgénica
• La vaca
transgénica
(ZK002) produjo la
misma cantidad de
n-6 y n-3 en su
leche, mientras
que el control
(ZK001) 4 veces
más n-6 que n-3.

20. Discusiones
• Los mamíferos no cuentan con desaturasas de ácidos grasos n-3, por lo
que estas biomoléculas deben ser obtenidas de la dieta.
• Los genes de las desaturasas se encuentran en hongos, gusanos y plantas
como la espinaca.
• mfat-1 es un gen mamalizado de desaturasa encontrado en C. elegans y
usado exitosamente en ratones y cerdos.
• La vaca transgénica para mfat-1, ZK002, tuvo una disminución significativa
en la relación n-3:n-6 en tejido de oreja y leche al compararla con los
controles. Además, tuvo un desarrollo normal, llegando a etapa
reproductiva y siendo capaz de dar a luz.
• Debido a la baja cantidad de vacas transgénicas en el estudio (1), no fue
posible sacrificar al animal para analizar sus tejidos internos como músculo,
hígado, riñones, corazón, etc.
• El estudio comprueba que es posible generar animales con leche y tejido
enriquecido en n-3, siendo una opción viable para la demanda de este
ácido graso.

21. Resumen
n-3 ácido graso desaturasa