aislamiento de amiloliticos y celuloliticos

1. Protocolo aislamiento de microorganismos celulolíticos
Proyecto cepario : colección de microorganismos de interés agro empresarial
Objetivo : aislar e identificar microorganismos celuloliticos
Laboratorio de biotecnología - sena agro empresarial y minero

2. Introducción
Microorganismos celuloliticos
La celulosa es un polisacárido cuya fórmula es (C6H10O5)n. Es el principal componente de la
membrana celular de la mayor parte de las plantas. Está constituida por moléculas de D-
glucosay espolímeromás abundante enlabiosfera,unode loscomponentesmásabundantes
de la biomasavegetal yporlo cual se encuentraengranmedidaen el suelo, es degradada por
una serie de microorganismosmediante laacciónde variasenzimasnoasociadasencomplejos
como lascelobiohidrolasas y las endoglucanasa que se encargan de su degradación, como en
los hongos filamentosos y en algunos actinomicetos o formando un complejo denominado
"celulosoma",como en los clostridios y en bacterias del rumen (Murashima et al., 2002; Lynd
et al., 2002)
Los microorganismos degradadores de celulosa incluyen hongos y bacterias aerobios y
anaerobios mesofilicos y termofilicos que ocupan una variedad de hábitats. Entrelos hongos
celuloliticosse destacanThrichodermareesei;Phanerochaete chrysosporium, Fusariumsolani,
Penicillium funiculosum, Thrichoderma koningii, Sporotrix sp, Alternativa sp, Geotrichum
spRhizoctonia sp, Trametes sp, Mucor sp, Cladosporium sp, Buñgaria sp, Chaetomium sp.
Helotium sp, Aspergillus sp. Las bacterias celuloliticas mas abundantes y conocidas son las
aerobias entre las cualesse puede citar: Cellulomonas sp, Microbispora bispora,
Thermomonosporasp.,Cytophagasp,Corynebacteriumsp,Vibriosp,Bacillussp,Pseudomona
sp,Thermobifidasp.Ademasse encuentranalgunosanaerobioscomoAcetivibriocellulolyticus,
Butirivibriosp,Bactroidescellulolyticus,Bacteroides succnogenes, Clostridium cellulovorans,
Clostridium thermocellum, Ruminococcus albus, Rumionococcusflavefaciens. Entre los
actinomicetes se destacan. Sterptpmyces drozdowiczii, Streptomyces cellulolyticus,
Thermomonospora curvata, thermomonospora chromogena, thermomonospora alba y
Thermomobifidafusca.
El pH optimo para la actividad de las celulasas producidas por bacterias abarca un amplio
rango,el cual incluye condicionesalcalinasyacidas.Por otro lado, las celulasasproducidas por
hongos requieren generalmente un pH acido.

3. Fundamento
La lignina conforma la pared celular de las plantas, es un polímero constituido por celulosa y
hemicelulosa (Ortiz, 2009). Los microorganismos lignolíticos catabolizan la celulosa y la
hemicelulosa. La mayoría de estos son hongos de la pudrición blanca y algunas bacterias
(Dávila & Vázquez-Duhalt, Enzimas lignocelulolíticas fúngicas para fines ambientales, 2006).
La celulosa es un polímero de origen vegetal constituido por 15.000 moléculas de D-glucosa.
Forma unaestructura rígidade cadenasparalelasunidasporpuentesde hidrógeno (Cuamatzi,
2004). Los microorganismoscelulolíticos son mesofílicos, termofílicos, aerobios y anaerobios
de los géneros Bacillus sp., Clostridium sp., Streptomyces y hongos como Sclerotium sp.,
Aspergillus sp., Achlya sp., Rhizopus sp. y Penicillum sp. (Gaitán & Pérez, 2007).
Los microorganismoscapacesde degradarcelulosa secretan un sistema complejo de enzimas
extracelulares, celulasas y xilanasas, que actúan en forma conjunta en la degradación de
celulosa y hemicelulosa (los dos componentes principales de la madera).
Las fibras de celulosa son degradadas esencialmente por dos tipos de sistemas enzimáticos
llamados agregativos y no agregativos, como se muestra en la siguiente figura:
Los microorganismoscelulolíticos(que degradan celulosa) desempeñan un papel importante
en la biosfera reciclando este polímero. Existe una diversidad de estos microorganismos,
bacteriasy hongosaeróbicosoanaeróbicos,mesófilosotermófilos (ver Cuaderno Nº 57), que
producen las enzimas celulasas. Algunos de ellos son:

4. GRUPO ESPECIES
Hongos aerobicos Trchodermaviride,trichodermareesei,penicillum
pinophilum,fusarium solani,talaromyces emersom y
trichoderma koningii.
Hongos aerobicos
termofilos
Sporotrichum thermophile, thermoascus aurantiacus, y
humicola insolens.
Hongos anaerobicos
Mesofilicos
Neocallimastix frontalis, piromonas cammunis, sphoeramonas
cammunis
Bacterias aerobicas
mesofilicas y
termofilas
Cellulomonas sp, celluibrio sp, microbispora bispora y
thermomonospora sp.
Bacterias anaeróbicas
mesofilicas y
termófilas
Acetivibrio celbriolyticos,bacteroides succinogenes
rminococcus albus, ruminococcus flavefaciens y clostridium
thermocellum.
Dentrodel grupode hongosaeróbicos,el hongofilamentosoTrichodermareesei es uno de los
más estudiados y se caracteriza por su efectividad en la degradación de la celulosa nativa y
cristalinamediante sucomplejocelulolíticoque presentalastresactividadesnecesariasparala
hidrólisis de la celulosa (endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa). Otra ventaja que
presenta el uso de este microorganismo, es su estabilidad en reactores agitados bajo
condiciones de pH ácido y a 50 ºC durante 48 hs.
Entre los microorganismos, los termófilos son de interés por su capacidad para producir
enzimas celulolíticas termoestables, las cuales son en general estables bajo condiciones
severas,inclusoennivelesde pHaltamente ácidosoalcalinosasí como temperaturas de hasta
90 °C.
Las enzimas celulolíticas producidas por las bacterias del género Bacillus presentan
básicamente actividad endo-β-1,4-glucanasa y exo-β-1,4-glucanasa; pero tienen una
característica particular, en especial las enzimas de Bacillus subtillis y es la resistencia a ser
inhibida por la propia glucosa o celobiosa que producen.
En la actualidad existen disponibles numerosos preparados enzimáticos comerciales que
contienenprincipalmenteactividadcelulolítica(endo-β-1,4-glucanasa,exo-β-1,4-glucanasa, β-
1,4-glucosidasa).Estospreparados enzimáticos son obtenidos de microorganismos de origen
fúngicoybacteriano,que principalmenteprovienen de los microorganismos Trichoderma sp.,
Aspergillus níger y Bacillus subtillis.
Aislamiento
Se pesaran 10g de las muestras de residuos vegetales o de las muestreos de suelo tomados
para luegoserllevadosa90 ml de agua peptonada a 0.1% (p/v). Posteriormente se realizaran
diluciones seriadas a en agua peptonada a 0.1% (p/v) a partir de las diluciones
preparadas se realiza siembra en superficie en agar carboximetilcelulosa (cmc) al 1% (p/v).
Las cajas se incubaran a 35ºc por 48 horas

5. Transcurridoel tiempode incubación se adiciona rojo congo al 1 % (p/v) como revelador a las
colonias presentes en los medios, luego de 15 minutos se retira el exceso y se adiciona NaCI
0.1 M, dejando reposar por 15 minutos, para luego hacer el recuento de las colonias que
presentaron halos de hidrolisis (teathery Wood, 1982).
Materiales y equipos
 Espátula o cucharilla
 Carboximetilcelulosa 10g
 Extracto de levadura 2.5g
 Peptona universal 2.5g
 Sulfato de amonio 0.5g
 Cloruro de calcio 0.5g
 Fosfato monobásico de potasio 0.1 g
 Fosfato dibasico de potasio 0.1 g
 Agar – agar 15 g
 Agua destilada 1000.0ml
 Rojo congo al 1 % (p/v)
 NaCI 0.1 M
 Balanza analítica
 Plancha de calentamiento y agitación
 Cámara de flujo laminar
 Autoclave
 Potenciómetro
Agar CMC
Composición
Carboximetilcelulosa 10g
Extracto de levadura 2.5g
Peptona universal 2.5g
Sulfato de amonio 0.5g
Cloruro de calcio 0.5g
Fosfato monobásico de potasio 0.1 g
Fosfato dibasico de potasio 0.1 g
Agar – agar 15 g

6. Cálculos
Carboximetilcelulosa
10 g 1000ml
X 240ml
X = 10 g x 240ml = 2.4 g
1000 ml
Extracto de levadura
2.5g 1000ml
X 240ml
X = 2.5 g x 240ml = 0.6g
1000 ml
Peptona universal
2.5 g 1000ml
X 240ml
X = 2.5 g x240ml= 0.6g
1000 ml
Sulfato de amonio
0.5 g 1000ml
X 240ml
X = 0.5 g x 240ml = 0.12g
1000 ml
Cloruro de calcio
0.5 g 1000ml
X 240ml
X = 0.5 g x 240ml = 0.2 g
X= 2.4g de
carboximetilcelulosa
X=0.6g de extracto de
levadura
X= 0.6g de peptona
universal
X=0.12g de sulfato de
amonio
X=0.2g de cloruro de
calcio

7. 1000 ml
Fosfato monobásico de potasio
o.1g 1000ml
X 240ml
X = 0.1g x 240ml = 0.024g
1000 ml
Fosfato dibasico de potasio
0.1 g 1000ml
X 240ml
X = 0.1 g x 240ml = 0.024g
1000 ml
Agar – agar
15g 1000ml
X 240ml
X = 15 g x ? = 2.88g
1000 ml
Rojo congo
1% p/v 1000ml
X 50 ml
X= 1% p/v x 50 ml = 0.5 g
1000 ml
Calculos para preparar cloruro de sodio ( NaCI) AL 0.1 M
Utilizaremos un volumen de 30 ml
X=0.024g de fosfato
monobásico de potasio
X=0.024g de fosfato
dibasico de potasio
X= 2.88g de agar
X=0.5g de rojo congo

8. 1 L 1000ml
X 30 ML
X = 30ML x 1L = 0.03L
1000 ml
M= n mol = n moles = M . L sln
Lsln n moles = w (peso en gramos ) = w= n mol . pm
Pm
n mol = 0.1 moles/L x 0,03 L = 0,003 n mol
n moles = w ( peso en gramos) = w= n mol . pm
pm
pm NaCI = 58,44 g/mol
w= 0,003 mol x 58,44g/mol = 0,17 g
Procedimiento
Se disuelvencadacomponente enaguadestilada,unavezdisueltostodoslos componentes se
ajusta el Ph ( 7.1 – 7.2 ), luego se somete a temperatura promedio al punto de ebullición, el
mediotomaraun colorcristalino esto nos indica que debemos retirar el medio de la plancha
de calentamiento, por siguiente se lleva al autoclave para su debida esterilización por
consiguiente estando el medio esterilizado se reparte en cajas Petri. Después de tener las
cajas cajas con el medio Se inocula en las placas mediante el método por estrías o
agotamiento, esto en condiciones asépticas.
Transcurridoel tiempode incubación( 36ºc por 48 h ) se adiciona rojo congo al 1 % (p/v) como
revelador a las colonias presentes en los medios ( se le adiciona rojo congo por gotas a las
colonias), luego de 15 minutos de haber adicionado rojo congo como revelador se adiciona
NaCI 0.1 M, dejando reaccionar por 15 minutos mas , para luego hacer el recuento de las
colonias que presentaron halos de hidrolisis.
X= 0.03 L
N mol = 0,003
W= 0,17 g

9. Bibliografía
Celulosas y Celulasas. ArgenBio (2007)
http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=102
Aislamiento y evaluación de microorganismos celuloliticos a partir de residuos vegetales y
en compost generadosenun cultivo de crisantemo. Diana Gaitan, Liliana perez. (enero 2007)
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis274.pdf