Clase introductoria a la microscopía electrónica donde se describen sus principios físicos, los principales componentes de un microscopio electrónico, preparación de la muestra y las técnicas aplicadas para este tipo de microscopía.

1. Nicole Salgado Cortes (MSc)
Unidad de Microscopía Avanzada Medicina
Facultad de Medicina
Pontificia Universidad Cátólica de Chile

2. ¿QUÉ ES LA
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA?

3. HITOS DE LA MICROSCOPÍA
Ernst Abbe
-1877-
d = distancia
Λ = longitud de onda
Ƞ = índice de refracción
α = apertura

4. HITOS DE LA MICROSCOPÍA
Ernst Ruska & Max Knoll
-1931-
Manfred von Ardenne
-1937-
Carl Braun
-1897-
Dubochet, Frank & Hendersen
-2017-

5. Super
Resolu
ción
RESOLUCIÓN
Poder de resolución de los microscopios
OJO HUMANO
MICROSCOPIOS ÓPTICOS
MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS

6. ÓPTICA V/S ELECTRÓNICA

7. Para microscopia electrónica:
Electrones a 100 kEV ≈ 0.004 nm
Objetivo NA ≈ 0.01
d ≈ 0.1-0.2 nm
Para muestras biológicas ≈ 1 nm
Para microscopia de fluorescencia:
Luz verde ≈ 500 nm
Objetivo NA = 1.4 en aceite
d ≈ 220 nm
ÓPTICA V/S ELECTRÓNICA
RESOLUCIÓN
Capacidad para distinguir separadamente
dos objetos que se encuentran muy juntos.
λ
2Ƞ sin α
d =
¡El límite de resolución esta dado por la muestra!

8. Como la longitud de onda de los electrones es mucho menor a la
de los fotones, el microscopio electrónico tiene un mayor poder
de resolución.
EN CONCLUSIÓN

9. ÓPTICA V/S ELECTRÓNICA
VENTAJAS
• Imaging en células vivas
• Marca en múltiples señales (colores)
DESVENTAJAS
• Resolución limitada por la difracción
de la luz
• Mala resolución en el eje Z (>600nm)
• Bajo reconocimiento de estructuras y
compartimentos, requiere marcaje.
• Imágenes de la superficie son
limitadas.
VENTAJAS
• Alta resolución solo limitada por la
muestra
• Reconocimiento de estructuras sin
necesidad de marca
DESVENTAJAS
• Solo muestras fijadas
• Limitado a muestras ultradelgadas
(TEM) o superficie (SEM)
• Baja sensibilidad a marca, alto
background.
• Requiere tiempo y personal
altamente calificado.

10. PRINCIPIOS DE
MICROSCOPÍA ELECTRONICA
1.Fuente de electrones
2.Aceleración
3.Enfoque
4.Muestra
5.Detección
6.Columna al vacío

11. FUENTE DE ELECTRONES
Filamento y tubo de rayos catódicos
Provee de una corriente amplia y estable de electrones (kV)

12. ACELERACIÓN
Un aumento en el voltaje de aceleración
resultará en una mayor penetración y
mayor volumen de interacción.
Efectos de la aceleración de electrones en la imagen final
¿Qué efecto tendrá esto en la imagen final?

13. LENTES ELECTROMAGNETICOS
Los lentes electromagnéticos emulan la acción de un lente
óptico, enfocando electrones paralelos en un punto focal.

14. MUESTRA

15. COLUMNA AL VACÍO
¿Por qué necesitamos una columna al vacío?
Optimiza la detección de electrones dispersos.
El microscopio electrónico es un sistema sellado al vacío para
permitir que el rayo de electrones viaje en línea recta.
Previene que el cátodo arda.

16. Fuente de electrones
Aceleración
Dirección
MUESTRA
Enfoque
Detección
DE TRANSMISIÓN
TEM | TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE

17. DETECCIÓN EN TEM
El ángulo de dispersión da
información sobre la estructura
atómica de la muestra.

18. DE BARRIDO
SEM | SCANNING ELECTRON MICROSCOPE
Fuente de electrones
Aceleración
Dirección
MUESTRA
Enfoque
Detección

19. DETECCIÓN EN SEM
Electrones secundarios
Back-scatter
Rayos X
Mapeo de la muestra
Características químicas
Topografía de la superficie

20. TEM V/S SEM
• Produce imágenes de la ultraestructura
de células y sus componentes.
• El rayo de electrones pasa a través de la
muestra.
• Detecta los electrones primarios
transmitidos por la muestra.
• Alta resolución (~1nm).
• Contraste del espécimen por absorción de
electrones.
• Produce imágenes en 2 dimensiones.
• Produce imágenes de superficies de
células y pequeños organismos.
• El rayo de electrones escanea sobre la
superficie de la muestra
• Detecta los electrones dispersados por la
superficie de la muestra, emitidos por la
excitación del rayo de electrones.
• Baja resolución (~10nm)
• Contraste del espécimen por dispersión de
electrones secundarios.
• Produce imágenes en 3 dimensiones
Grano de polen en TEM y SEM

21. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
¿POR QUÉ ES IMPORTANTE?
Alga sin contraste Alga con contraste por materiales pesados
¡El límite de resolución esta dado por la muestra!

22. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Células de hígado, 40,000x
+Os +Os+U
+Os+Pb +Os+Pb+U

23. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA TEM
FIJACIÓN
DESHIDRATACIÓN
MONTAJE
CORTE
TINCIÓN
TEM

24. FIJACIÓN
Función: preservar el tejido (ultraestructura) lo más parecido a
su estado natural.
Desactivar enzimas proteolíticas.
Proteger la muestra de daño externo.
Procesamiento y tinción.

25. DESHIDRATACIÓN
Función: Sustituir el agua de la muestra por un solvente.
Etc, etc...

26. MONTAJE

27. CORTE
Muestras ultra delgadas 50-200 nm

28. TINCIÓN
Contraste con metales pesados

30. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA SEM
FIJACIÓN
DESHIDRATACIÓN
RECUBRIMIENTO
SEM

31. MATERIAL CONDUCTIVO
Low-voltage micrograph (300 V) of distribution of adhesive droplets on a Post-it note.
No conductive coating was applied: such a coating would alter this fragile specimen.

32. RECUBRIMIENTO CON AU
Sombreador de oro

34. TÉCNICAS AVANZADAS PARA
MICROSCOOPÍA ELECTRÓNICA

35. INMUNOGOLD PARA TEM

36. CRIO-FRACTURA

37. CRIO-FRACTURA

38. CRYO-ELECTRON MICROSCOPY

39. CRYO-ELECTRON MICROSCOPY
Forest Semliki virus from dehydration in the vacuum of an electron microscope.
Each virus is about 500 Ångströms, or 50 nanometers, across.

40. RECOSNTRUCCIÓN 3D

41. ELECTRON TOMOGRAPHY MICROSCOPY

42. ELECTRON TOMOGRAPHY MICROSCOPY

43. 3D view of the model of the Pd/multiwall CNTs showing the high filling efficiency of the nanotubes by palladium particles
(in red, gold particles; blue, palladium particles; green, carbon nanotube; pink, amorphous residues).
ELECTRON TOMOGRAPHY MICROSCOPY

44. CORRELATIVE
ELECTRON MICROSCOPY

45. RECAPITULEMOS
La microscopía electrónica utiliza electrones, por lo que tiene mayor
poder resolutivo que la microscopía óptica.
Existen dos tipos principales de microscopía electrónica: TEM y SEM
La preparación de la muestra es crucial, ya que limita la resolución.
El uso de microscopía electrónica tiene ventajas y desventajas.
Existen técnicas avanzadas para tener mas información.