3. No polares, con grupos R alifáticos
Polares, grupos R sin carga
Grupos R aromáticos
Grupos R cargados positivamente (aminoácidos básicos)
Grupos R cargados negativamente (aminoácidos ácidos)
Estructura general de los aminoácidosRepaso
Clasificación de los aminoácidos
4. Repaso
¿la Gly tiene actividad óptica?
¿Qué características particulares tiene la Pro en su estructura?
Aminoácidos no polares con grupo R alifático
5. Aminoácidos con grupo R aromático
Repaso
Los aminoácidos aromáticos absorben luz UV
Las proteínas tienen un máximo de absorbancia UV en 275-280 nm
La absortividad molar del Trp es 5 veces mayor que Tyr y 50 veces la de Phe
Conociendo la absortividad molar de una proteína particular, se puede
determinar su concentración por espectrofotometría: A = ε b c.
Propiedades de los aminoácidos aromáticos
6. aminoácidos básicos, cargados positivamente a pH neutro.
¿por qué no está cargada la His?
¿qué significa ε-NH2 de la lisina?
Repaso
1
2
3
4
5
6
con carga positiva
Aminoácidos con grupo R cargado
7. Repaso
¿cuáles son los grupos polares de estos aminoácidos?
la formación del puente disulfuro es una modificación postraduccional
Aminoácidos polares con grupo R
sin carga
Unión de dos residuos de cisteína:
formación del puente disulfuro
cisteína
cistinacisteína
8. Los aminoácidos se identifican por un código
de tres letras o uno de una sola letra
Repaso
los aminoácidos habituales son 20
8 de ellos son esenciales para los humanos
14. Formación del enlace peptídico
Repaso
la formación del enlace peptídico en una reacción de condensación
los aminoácidos que forman parte de un péptido se llaman residuos, para indicar
la pérdida de la molécula de agua
15. Péptidos
Repaso
según la cantidad de residuos, los péptidos se denominan dipéptidos, tripéptidos,
tetrapéptidos, pentapéptidos, … oligopéptidos o polipéptidos
16. Indique la carga neta de la molécula a pH 3. Estime el pI del péptido
Ejercicio
Titulación de péptidos
17. Niveles de organización de las proteínas
estructura
terciaria
estructura
secundaria
estructura
cuaternaria
estructura
primaria
estructura
función
18. Estructura primaria:
estructura covalente de proteínas
la secuencia de una
proteína es el orden en que
se presentan sus aminoácidos
cada proteína tiene una
secuencia única
los sucesivos enlaces
peptídicos definen la cadena
principal o esqueleto
peptídico
19. Estructura primaria:
estructura covalente de proteínas
Cada proteína tiene una secuencia única
de aminoácidos (estructura primaria)
Si se altera la secuencia de aminoácidos
la función de la proteína puede cambiar
Cada proteína tiene una estructura 3D
única que le confiere una función única
La estructura terciaria de la proteína está
condicionada por la secuencia de la misma
Conocer la estructura primaria
SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS
secuencia de ADN
insulina
20. Homología de secuencia
Secuencia de aminoácidos del citocromo c
Las proteínas homólogas: presentan similitudes en secuencia de aa y
estructura 3D comparten características estructurales y funcionales
Son miembros de una familia de proteínas
Amarillo: aa idénticos; azul: sustituciones conservativas;
sin colorear: sustituciones no conservativas
21. Alineamiento de secuencias de proteínas
Homología de secuencia
Proteína Hsp70: la introducción de un hueco (“gap”) en la secuencia de
B. subtilis permite un mejor alineamiento de residuos de aminoácidos
Secuencia de transportador ABC (ATP binding cassette) de tipo I
22. Secuencias consenso
Secuencia consenso se refiere a los aminoácidos (o bases) más frecuentes
encontrados una posición determinada luego de comparar varias secuencias
Representación de secuencias consenso
Logotipos de secuencia
23. Árbol filogenético de proteínas
Homología de secuencia
comparar en cuánto difieren
dos proteínas relacionadas
permite establecer hace cuánto
tiempo se separaron las
especies
24. Secuenciación de proteínas
Estrategia para secuenciar una proteína
Tener a la proteína de interés pura
Determinar cuántas cadenas polipeptídicas componen la proteína:
si hay más de una, separarlas
Desnaturalizarla
Romper los puentes –S-S- y bloquear los grupos –SH
Determinar la composición en aminoácidos de cada cadena polipeptídica
Determinar los residuos amino y carboxilo terminal de cada cadena
Determinar de la secuencia de aminoácidos por reacción de Edman,
proteólisis específicas, ordenamiento de los fragmentos y superposición
Localizar los puentes disulfuro
25. Los procedimientos de purificación separan proteínas
teniendo en cuenta diferencias de:
Solubilidad (precipitación por salado)
Tamaño (diálisis, ultracentrifugación, cromatografía de
exclusión molecular, SDS-PAGE)
Carga eléctrica (intercambio iónico, electroforesis)
Polaridad (cromatografía en fase reversa, de adsorción)
Afinidad de unión (cromatografía de afinidad)
Purificación de proteínas
Seminario de proteínas
Tener a la proteína de interés pura
26. Desnaturalización de las proteínas
Seminario de proteínas
Desnaturalizarla
La desnaturalización de las proteínas
implica la pérdida de la estructura
secundaria y terciaria, pero no la estructura
primaria se rompen uniones débiles
La proteína pierde su estructura y, por lo
tanto, su actividad
27. Uniones en las proteínas
Uniones covalentes:
- enlace peptídico
- puente disulfuro
Interacciones débiles:
- puente hidrógeno
- interacción electrostática
- interacción hidrofóbica
- fuerzas de van der Waals
Seminario de proteínas
Desnaturalizarla
28. Desnaturalización de las proteínas
Seminario de proteínas
Desnaturalizarla
Desnaturalizantes:
• ácidos y bases
• solventes orgánicos
• calor
• detergentes
• urea y cloruro de
guanidinio
urea
guanidinio
SDS
29. Ruptura de puentes disulfuro
Seminario de proteínas
Romper los puentes –S-S- y bloquear los grupos –SH
Puentes intercatenarios
Puentes intracatenarios
Grupos accesibles
Grupos inaccesibles
30. Ruptura de puentes disulfuro
CH2I
C=O
O-
iodoacético
CH2I
C=O
NH2
iodoacetamida
ácido perfórmico
2-mercaptoetanol
ditiotreitol
Seminario de proteínas
oxidante
reductores
bloqueantes si se reducen los puentes disulfuro,
es necesario bloquearlos para evitar
que se vuelvan a formar
31. Composición en
aminoácidos
Determinar la composición en aminoácidos
de cada cadena polipeptídica
Para conocer la composición en
aminoácidos de una proteína es
necesario romper sus enlaces
peptídicos
HCl 6N, 110°C, 24h
32. Análisis cromatográfico de
aminoácidos
Determinar la composición en aminoácidos de cada cadena polipeptídica
Reacciones para la
determinación de aminoácidos
Reacción de la ninhidrina
33. Determinación del residuo N-terminal
Determinar los residuos amino y carboxilo terminal de cada cadena
DNFB:
dinitrofluorbenceno
Reactivo de Sanger
PITC:
fenilisotiocianato
Reactivo de Edman el cloruro de dansilo y
el cloruro de dabsilo
son más sensibles que
el DNFB
34. Determinación del residuo C-terminal
Hidrazinólisis Carboxipeptidasa
(ruptura en el lado amino del aa C-terminal)
Determinar los residuos amino y carboxilo terminal de cada cadena
35. Degradación de Edman
La automatización de este proceso se conoce como degradación secuencial de
Edman, se utiliza para establecer la secuencia de aminoácidos en una proteína
Determinar de la secuencia de aminoácidos por reacción de Edman,
proteólisis específicas, ordenamiento de los fragmentos y superposición
marcación
liberación
marcación
liberación
primera
vuelta
segunda
vuelta
36. Ruptura proteolítica de la cadena peptídica
Determinar de la secuencia de aminoácidos por reacción de Edman,
proteólisis específicas, ordenamiento de los fragmentos y superposición
37. Determinar de la secuencia de aminoácidos por reacción de Edman,
proteólisis específicas, ordenamiento de los fragmentos y superposición
Solapamiento de péptidos
Ejemplo
39. Asignación de puentes disulfuro
Sólo los –SH libres
aparecen alquilados
- Alquilación
- Hidrólisis
- Reducción
- Alquilación
- Hidrólisis
Aparecen alquilados
los –SH libres y los SS
Sobre la proteína con enlaces SS intactos
Digestión con enzimas/rvos qcos
Separación de los fragmentos resultantes
A cada fragmento
