3. Restricción modificación Sistema CRISPR-Cas
•Reconoce genoma viral, se
inactiva y se destruye.
•Una parte de ese genoma
viral se incorpora al
genoma de la bacteria para
así generar una protección
más eficiente.
4. C Clustered
R Regularly
I Interspaced
S Short
P Palindromic
R Repeats
"Repeticiones Palindrómicas Cortas
Agrupadas y Regularmente Interespaciadas"
C CRISPR
a associated
s genes
Genes asociados a
CRISPR
8. Gene editing
Capacidad de eliminar, reemplazar, modificar secuencias
de un genoma en forma altamente específica
No al azar!
creando un sistema que genera DSB en una secuencia
determinada
¿Cómo nos podría servir este sistema
de inmunidad natural de bacterias a fagos
para hacer Gene editing?
componentes Cas9 + sgRNA
bueno….trasladando CRISPR a eucariotas…
9. Single guide RNA
(sg RNA)
Requerimiento: la secuencia target tiene que estar seguida inmediatamente río abajo
por una secuencia PAM:
5′-GG por la que Cas9 tiene afinidad
• Secuencia guia
• Secuencia CRISPR y“scaffold” (tracrRNA)
artificialmente fusionadas entre sí y
además a la guía específica a elección del
investigador
¿Puedo “targetear” cualquier secuencia de un genoma?
SI
5′-NGGLa endonucleasa Cas9
no tiene repeats
CRISPR
11. Una vez generado el DSB en el genoma…
Dos formas de “reparación” por la célula:
Non homologous end joining (NHEJ)
Homologous Recombination (HR)
Genera INDEL mutations
Cambio marco de lectura
o aparición de STOP prematuro
Knock-out del alelo
Si además agregamos un vector “de reparación” con secuencias homólogas
flanqueando la modificación que se quiere hacer… Knock-in del alelo
13. Queremos generar una línea celular con un
alelo de un gen knockeado…
Diseñar secuencia guía teniendo en cuenta PAM (5’ – NGG)
Clonar secuencia guía elegida en el vector sgRNA/Cas9
Transfectar células con el vector
Seleccionar células transfectadas
Validar el editing (mediante PCR y secuenciación)
Validar no haber generado OFF-targets
Se hace con la ayuda de un software
PCR para genes homólogos y y secuenciación
En células transfectadas
se expresa Cas9 y sgRNA. Con alta eficiencia, ocurre el DSB en uno o en ambos
Alelos. Si deseamos knock-in, también agregar vector con la otra versión del gen
Entonces…
14. ¿También sirve para hacer transgénicos?
Claro! Y de manera sitio-dirigida
Por ejemplo, en ratones, igual que para KO:
Una forma
• Modificar células madre embrionarias
• Inyectarlas en blastocistos
• Transferir a madre adoptiva y obtener animales quimera
Otra forma
Directamente en cigoto y transferir blastocisto resultante a madre adoptiva:
crías genéticamente homogéneas, es decir no-quimeras
15. Y la construcción?
+
Se agrega un vector (de “reparación”) con secuencias homólogas al sitio target (“brazos” )
flanqueando la inserción que se quiere introducir
el reemplazo ocurre
mediante HR
ejemplo:
tagging de proteínas endógenas;
evita introducir proteína taggeada exógena
16. Ventajas del sistema CRISPR
Sólo hay que diseñar un sgRNA y no una proteína!
• Es mucho más barato, más rápido y más fácil
Se pueden hacer múltiples modificaciones en el genoma
al mismo tiempo.
• Individuos (plantas o animales) con varios genes mutados
al mismo tiempo
• Grandes deleciones eligiondo 2 sitios target cercanos
Más eficiente que otros sistemas (Zinc finger nucleases y TALEN)
17. Ademas…
Se diseñaron variantes la proteína Cas9
nCas9: Proteína “nickasa” (le falta un dominio).
En vez de generar DSBs, genera nicks en una cadena.
• Reduce la frecuencia de NHEJ y favorece HR para knock-in
Cas9 sin actividad endonucleasa: se dirige al sitio elegido
(mediante sgRNA), pero no lo corta:
• Se la puede fusionar a GFP y mostrar la ubicación aproximada
de un locus en su cromosoma en células vivas.
18. Se inaugura una nueva era de ingeniería genética
en la que se puede:
editar
corregir
alterar
de una manera
fácil
rápida
barata
altamente precisa.
el genoma de cualquier célula
19. curar enfermedades
mejorar los alimentos transgénicos
modificar bacterias y otros microorganismos
de uso industrial y alimentario.