Esta es la técnica CRISPR, novedad.

1. Imagen de ADDGENE
Tecnologías
CRISPR/Cas
UNCAUS

2. La ingeniería genética comprende una serie de técnicas de manipulación del
material genético de cualquier célula, que incluyen el control y transferencia
del ADN de un organismo a otro, con el fin de aplicarlo a problemas biológicos,
médicos o agrícolas específicos (corrección de los defectos genéticos, creación de
nuevas cepas de microorganismos, de variedades de plantas y razas de animales
para una obtención más eficiente de sus productos, etc).
• Secuenciación del DNA
• DNA recombinante
• PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
• Clonación
• Transgénesis
• Mutación excepcional
• Bloqueo génico
• Edición genómica
Ingeniería genética

3. Control genético y epigenético de células con
tecnologías de ingeniería genómica
• Las mutaciones genéticas o las variantes
epigenéticas asociadas, recreadas en modelos
animales o celulares (Modelos animales, Variación
genética).
• La manipulación de circuitos biológicos para la
generación de materiales sintéticos útiles
(Materiales)
• La ingeniería genética aplicada a cultivos
agrícolas para conferir resistencia a factores
ambientales o a infecciones patógenas, mejorando
la seguridad alimentaria y evitando la introducción
de ADN extraño (Alimentos).
• Los biocombustibles (fuente de energía
renovable), mediante la creación de vías
metabólicas eficaces para la producción de etanol a
partir de algas o maíz (Combustible).
• La corrección directa in vivo de los defectos
genéticos o epigenéticos en el tejido somático para
abordar la causa de los trastornos codificados
genéticamente (Cirugía génica).
• Ingeniería genética aplicada a células para la
generación de precursores o fármacos en fábricas
bacterianas (Desarrollo de fármacos)

4. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats (Repeticiones Palindrómicas Cortas
Agrupadas y Regularmente Interespaciadas)
CRISPR associated system (sistema asociado a CRISPR)
CRISPR/Cas
UNCAUS

5.  La función de CRISPR como sistema de defensa adaptativo (inmunidad adquirida)
contra elementos de DNA invasor es utilizado por microorganismos procariotas (su
mecanismo de acción es similar al del RNA de interferencia existente en eucariotas)
Sistema CRISPR en inmunidad de Procariotas
(Bacterias y Arqueas)

6. • La matriz CRISPR es un ARN transcrito no codificante que se madura enzimáticamente
a través de vías distintas que son únicas para cada tipo de sistema CRISPR
• En los tipos I y III CRISPR, el pre-
crRNA transcrito se escinde dentro
de las repeticiones por
ribonucleasas asociadas a CRISPR,
liberando múltiples crRNAs
pequeños.
• En CRISPR de tipo II, un ARN
CRISPR (tracrRNA) trans-activante
asociado hibrida con las
repeticiones directas, formando un
dúplex de ARN que es escindido y
procesado
• Los crRNA maduros de los
sistemas CRISPR de tipo I y III son
cargados en los complejos de
proteínas efectoras para
reconocimiento del objetivo y
posterior degradación.
• En los sistemas de tipo II, los
híbridos crRNA-tracrRNA se
complejan con Cas9 para mediar
la interferencia

7. • Mecanismo de identificación por apareamiento de bases y corte de la
secuencia que es unívoco y específico
• El sistema CRISPR/Cas9 se puede transferir y expresar de manera
heteróloga entre otras procariotas (bacterias distintas) y en eucariotas
• Mediante los sistemas de reparación celular se introduce la mutación
deseada. Hay dos vías de reparación, la vía de unión de extremos no
homólogos (NHEJ) y la vía de reparación directa por homología (HDR):
a) Vía NHEJ: se promueven mutaciones de inserción o deleción que
generan, (por un cambio en la pauta de lectura), un codón de terminación
y, por tanto, una disrupción del gen.
b) Vía HDR: se puede modificar la secuencia génica sin truncarla
proporcionando a la célula un molde de reparación portador de la
mutación puntual pretendida.
• Modificando la proteína Cas9 se puede provocar otro tipo de cambios como
regulador transcripcional por lo que se puede usar para regular la expresión
genética
Por qué su uso como herramienta de
edición genética?

9. La endonucleasa Cas9 (azul) se dirige al ADN mediante un ARN guía que puede suministrarse como un
sistema de dos partes que consiste en crRNA y tracrRNA o como ARN guía único, en el que el crRNA y
tracrRNA están conectados por un enlazador. El reconocimiento del blanco es facilitado por el motivo
adyacente al protoespaciador (PAM). La escisión se produce en ambas hebras (tijeras) 3 pares de bases
hacia adelante del PAM.
Sistema CRISPR/Cas9 (tipo II)

10. Las rupturas de la doble hebra de ADN (DSB) son reparados por la
unión de extremos no homólogos (NHEJ) o por reparación homóloga
directa (HDR). En NHEJ, las Indels se introducen cuando las cadenas
complementarias sufren resección y reparación que eventualmente
conducen a mutaciones que cambian el marco de lectura original y
producen el bloqueo de genes.
Alternativamente, las proteínas pueden unirse a los extremos DSB
durante la fase de HDR, que por recombinación genómica directa por
homología sobre una plantilla de reparación exógena facilitan la
introducción de modificaciones de genes precisas
REPARACIÓN DEL
ADN

11. REPARACIÓN DEL
ADN Y EDICIÓN

12. APLICACIONES PARA EL FUTURO

13.  ZFNs: nucleasas con dedos de zinc.
 TALENs: nucleasas efectoras tipo activación de la transcripción.
 CRISPR-Cas: agrupaciones de repeticiones cortas palindrómicas regularmente
interespaciadas asociadas a nucleasas Cas.
 pre-crRNA: precursor de RNA transcrito de CRISPR.
 crRNA: RNA transcrito de CRISPR.
 Cas: asociadas a CRISPR.
 PAM: motivo adyacente al protoespaciador.
 tracrRNAs: molécula transactivadora de crRNA.
 sgRNA: RNA guía individual.
 NHEJ: reparación de unión de extremos no homólogos
 HDR: reparación directa por homología.
 DSB: doble corte en la cadena.
 InDel: inserciones o deleciones.
 PI: dominio de reconocimiento de la secuencia PAM.
 Cas9n: Cas9 nickasa.
 dCas9: Cas9 defectiva para la actividad nucleasa.
 spCas9: Cas9 de Streptococcus pyogenes.
Abreviaturas

14. Referencias
• Patrick D. Hsu, Eric S. Lander, and Feng Zhang. Development and Applications of
CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. (2014)
• López Mancheño, Yaiza Araceli. Ingeniería Genómica mediante sistemas CRISPR-cas.
(2015)
• Kira S. Makarova, Yuri I. Wolf, Omer S. Alkhnbashi, Fabrizio Costa, Shiraz A. Shah, Sita
J. Saunders, Rodolphe Barrangou, Stan J. J. Brouns, Emmanuelle Charpentier, Daniel
H. Haft, Philippe Horvath, Sylvain Moineau, Francisco J. M. Mojica,Rebecca M. Terns,
Michael P. Terns, Malcolm F. White, Alexander F. Yakunin, Roger A. Garrett, John van
der Oost, Rolf Backofenand Eugene V. Koonin. An updated evolutionary
classification of CRISPR–Cas systems. (2015).
• Patrick D Hsu, David A Scott, Joshua A Weinstein, F Ann Ran, Silvana Konermann,
Vineeta Agarwala, Yinqing Li, Eli J Fine, Xuebing Wu, Ophir Shalem, Thomas J Cradick,
Luciano A Marraffini, Gang Bao & Feng Zhang. DNA targeting specificity of rNA-
guided Cas9 nucleases. (2013)