ENSEÑANZA EN MEDICINA HUMANA

1. Diagnóstico Molecular

2. Deben proporcionar de manera inequívoca la
identidad del origen de la enfermedad.
Es deseable que permitan discriminar entre
diferentes variantes celulares o patógenos
capaces de producir una enfermedad
Deben ayudar al monitoreo de la terapia
adecuada para cada enfermedad
Las pruebas de diagnóstico

3. Métodos de diagnostico basados en
ADN:
PCR
Northern blot
Southern blot

4. La Revolución del Diagnóstico
Molecular
*PCR (REACCIÓN EN
CADENA DE LA
POLIMERASA).

6. *La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales
en inglés son PCR ("polymerase chain reaction"), es una
técnica que fue desarrollada por Kary Mullis a mediados
de los años 80.
*Con esta metodología se pueden producir en el
laboratorio múltiples copias de un fragmento de ADN
específico, incluso en presencia de millones de otras
moléculas de ADN.
*Como su nombre indica, se basa en la actividad de la
enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una
cadena de ADN complementaria a otra ya existente.
*Además destaca por su sencillez y versatilidad ya que las
muestras biológicas pueden provenir de gotas de sangre,
orina o biopsia; permitiendo la detección y/o
identificación del patógeno a analizar

7. *
*Es una técnica que permite la amplificación in vitro de
una región especifica de ADN obteniéndose al final de
la reacción millones de copias de una secuencia
determinada del genoma de un organismo.
*La síntesis de la hebra complementaria al ADN a
amplificar(molde) se realiza bajo condiciones
apropiadas requiriendo tres etapas térmicas, que
constituyen un ciclo de amplificación:
* ETAPA I: Denaturación
* ETAPA II: Anillamiento
* ETAPA III: Extensión

8. http://www.revistaaquatic.com/aquatic/art.asp?t=h&c=128
Los pasos
del PCR

9. *
*Denaturación inicial: someter el tubo de
reaccion a altas temperaturas (95°C) durante
4-10 minutos.
*ETAPA I:
*Denaturación: incubar el tubo de reacción a una T°
de 95°C.

10. *
*ETAPA II:
*Objetivo: es que los oligonucleotidos se unan a
sus secuencias complementarias especificamente
con la hebra de ADN previamente denaturada.
*La temperatura de anillamiento es de vital
importancia en la optimización de un ensayo de
PCR.
*Ta = 2(A+T) + 4(G+C) – 5°C
*Es recomendable hallar experimentalmente la Ta
de cada set de oligonucleotidos.

11. *
*ETAPA III:
*Es la etapa de la reaccion en que la ADNpol
termoestable añade sucesivamente nucleotidos
al extremo 3´hidroxilo del oligonucleotido
iniciador, teniendo como molde la hebra de ADN
complementaria, en sentido 5´a 3´.
*La temperatura de extension depende de la
ADNpol a usar. La Taq ADNpol alcanza su
actividad maxima a los 72°C y el tiempo depende
del tamaño del fragmento que se desea
amplificar.

12. *
*ETAPA III:
*Extension final: se realiza despues del ultimo
ciclo de PCR a 72°C por 10´.
*Objetivo: permite que los productos de
amplificacion parciales terminen de completarse.
*Finalmente, las muestras pueden ser
almacenadas a 4°C hasta su posterior analisis.

14. *

16. *
*La reacción de amplificación incluye:
*Muestra biológica: ADN
*ADNpol termoestable
*Oligonucleotidos iniciadores
*Desoxiribonucleotidos trifosfatos
*Buffer de reacción
*Magnesio

17. *
*Muestra biológica: ADN
*La muestra biológica usada en la reacción de PCR
puede ser obtenida de sangre, suero, orina, heces,
esputo u otros fluidos, los cuales luego de ciertos
pasos previos de preparación son incluidos al tubo
de reacción de PCR.

18. *
*Iniciadores o cebadores
*Son oligonucleotidos pequeños (15-20) de cadena
simple que se diseñan de tal manera que sean
complementarios a los extremos 5´de las hebras
del segmento de ADN que se desea amplificar.

19. *
*ADN polimerasas:
*Son enzimas que sintetizan ADN a partir de un
oligonucleotido iniciador y una hebra de ADN molde.
Son enzimas termoestables y termoactivas.
*La actividad de estas enzimas así como la fidelidad
de la misma depende de la concentración de iones
de Mg+2 libres de los desoxiribonucleotidos y del pH
del buffer de reacción.

20. *
*Buffer de reacción:
*Debe ser elegido de acuerdo a la enzima a usar.
*Componentes del buffer: Tris-HCl, gelatina, o
albúmina sérica bovina y detergentes no iónicos
como el Tween 20 o Tritón X-100.
*Estos componentes pueden ser utilizados a fin de
estabilizar la actividad de la Taq ADNpol.

21. *
*Agua:
*Es un factor muy importante en el PCR. Se debe
utilizar agua de alta pureza, tridestilada,
desionizada, libre de ADN contaminante o de
ADNasas.
*Aceite mineral:
*Objetivo: prevenir la evaporación del agua del
tubo de reacción, mantener la estabilidad del
calor.

22. *
*Los productos de amplificación son
separados por electroforesis en geles
de agarosa y luego visualizados por
tinción con bromuro de etidio.
*La sensibilidad del sistema de
detección puede ser aumentada
mediante la conjunción de técnicas
hibridación con sondas de ADN.

23. *
*La detección de ADN, y eventualmente su
cuantificación, se basa en el marcaje
radioactivo, fluorescente, quimioluminiscente o
enzimatico de las sondas u oligonucleotidos
usados en PCR.
Bromuro de etidio