OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS EN EL MICROSCOPIO. TÉCNICA PARA OBSERVAR LOS MICROORGANISMOS

3.  El microscopio (de micro-
pequeño y scopio observar)
es un instrumento que
permite observar objetos que
son demasiado pequeños
para ser vistos a simple vista.
 Microscopio óptico
 Microscopio electrónico

4.  Sistema de soporte:
 Base
 Brazo
 Tubo o cabezal
 Platina
 Revolver
 Sistema de ajuste:
 Tornillo
macrométrico
 Tornillo
micrométrico

5.  Parte óptica:
 Fuente de iluminación
 Condensador y diafragma
 Lentes: oculares (10x y
12x) y objetivos (4x, 10x,
40x y 100x).

6.  En los microscopios antiguos tenía forma de
herradura o de trípode pero en la actualidad
suele ser una plataforma rectangular.
 Tiene un peso suficiente para dar estabilidad
al aparato.
 En él se integra la fuente luminosa.

7.  Es una columna
perpendicular al pie.
 Puede ser arqueado o
vertical y une la base
con el tubo.

8.  Es una cámara oscura
unida al brazo mediante
una cremallera.
 Tiene el revolver con los
objetivos en su parte
inferior y los oculares en
el extremo superior.

9.  Es una plataforma
horizontal con un
orificio central, sobre
el que se coloca la
preparación.

10.  Permite el paso de los
rayos de la fuente de
iluminación situada
por debajo.
 Tiene 2 pinzas y un
sistema de cremallera
guiado por dos
tornillos de
desplazamiento.

11.  Es un sistema en el
que se encuentran
los objetivos, y que
gira para utilizar un
objetivo u otro.

12.  Son tornillos de
enfoque, mueven la
platina hacia arriba
y hacia abajo.

13.  El macrométrico lo hace de forma rápida y el
micrométrico de forma lenta.
 Llevan incorporado un mando de bloqueo
que fija la platina a una determinada altura.

14.  Se trata de una lámpara halógena de
intensidad graduable.
 Esta situada en el pie del microscopio.
 En su superficie externa puede tener una
especie de anillo para colocar filtros que
facilitan la visualización.

15.  El condensador es un
sistema de lentes
situadas bajo la platina
su función es la de
concentrar la luz
generada por la fuente
de iluminación hacia la
preparación.

16.  En el interior del
condensador existe un
diafragma (iris) cuya
función es limitar el haz
de rayos que atraviesa el
sistema de lentes
eliminando los rayos
demasiado desviados.

17.  Están colocados en la parte
superior del tubo.
 Su función es la de captar y
ampliar la imagen formada
en los objetivos.
 Permite ajustar la distancia
interpupilar.

18.  Están colocados en la
parte inferior del tubo
insertados en el revolver.
 Generan una imagen
real, invertida y
aumentada.

19.  Los mas frecuentes son los de 4, 10, 40 y 100
aumentos.
 Este último se llama de inmersión ya que para
su utilización se necesita utilizar aceite de
cedro sobre la preparación.

20.  En la superficie de cada objetivo se indican sus
características principales, aumento, apertura
numérica y llevan dibujado un anillo coloreado
que indica el número de aumentos :
 10x o seco débil
 40x o seco fuerte
 100x o de inmersión

21.  Utiliza electrones en
lugar de fotones o luz
visible para formar
las imágenes.
 Permiten alcanzar
una capacidad de
aumento muy
superior.

22.  Funciona con un haz de electrones generados
por un cañón electrónico, acelerados por un alto
voltaje y focalizados por medio de lentes
magnéticas.
 Los electrones atraviesan la muestra y se
amplifican por lentes magnéticas que forman la
imagen sobre una placa fotográfica o una
pantalla sensible al impacto de los electrones
que transfiere la imagen formada a la pantalla
de un ordenador.

23.  Hay dos tipos:
 Microscopio electrónico de transmisión
 Microscopio electrónico de barrido

24.  Emite un haz de electrones, que rebotan o
son absorbidos por el objeto y otros lo
atraviesan formando una imagen aumentada
de la muestra.
 La muestra debe cortarse en capas finas, < de
un par de miles de ángstroms.
 Pueden aumentar la imagen hasta 1 millón de
veces.

25.  La muestra es recubierta con una capa de
metal delgado y es barrida con electrones
enviados desde un cañón.
 Un detector mide la cantidad de electrones
enviados que arroja la intensidad de la zona
de muestra, siendo capaz de mostrar figuras
en tres dimensiones, proyectados en unaTV.

26.  Su resolución está entre 3 y 20 nm.
 Permite obtener imágenes de gran resolución
en materiales pétreos, metálicos y orgánicos.
 La luz se sustituye por un haz de electrones,
las lentes por electroimanes y las muestras se
hacen conductoras metalizando su superficie.

29.  Es la capacidad que tiene un microscopio de
percibir por separado dos puntos pequeños,
adyacentes y cercanos.
 Es la capacidad para percibir detalles.
 El poder resolutivo aumenta a medida que
disminuye la distancia que separa dichos
puntos.

31.  Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y
seco, se coloca una gota del material que se
va a observar o se hace rodar el hisopo con
que se tomó la muestra.
 El hisopo ya no puede ser empleado para
inocular los medios de cultivo.
 Se puede diluir el material en una gota de
solución salina.

32.  Se deja secar al aire.
 Sirve para observar microorganismos vivos:
 Trofozoítos móviles de parásitos intestinales
como Giardia, Entamoeba.
 Huevos y quistes de parásitos, larvas y gusanos
adultos.
 Trichomonas.
 Hifas.

33.  Cándida sp.

34.  Se denomina frotis a la extensión que se
realiza sobre un portaobjetos de una muestra
o cultivo con objeto de separar lo más posible
los microorganismos.

36.  Se siguen los mismo pasos que para el examen
en fresco.
 Muestra de cultivo sólido se diluye.
 Muestra de cultivo líquido no se diluye.
 Fijación de la muestra: hace que las células
queden inactivadas y adheridas al vidrio
alterando lo menos posible la morfología
bacteriana y las agrupaciones de células y
permite continuar con los procesos de tinción.

37.  La fijación se puede realizar:
 Por calor: pasando algunas veces el portaobjetos
por la llama, se deja enfriar el porta entre los
pases.
 Con metanol (para bacterias procedentes de
medio líquido): se añade unas gotas de metanol
sobre la extensión seca, se retira de inmediato el
exceso de metanol y se espera a que se evapore
completamente.

38.  La muestra esta lista para ser observada o
continuar con procesos de tinción.

39.  Es la “impresión” de un tejido solido en un
portaobjetos donde se busca que los
microorganismos superficiales queden
expuestos para su observación al
microscopio.

41.  Sirven para:
 Distinguir entre tipos
diferentes de células
 Revelar la presencia de
determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos,
esporas, cápsulas, paredes
celulares, etc.

42.  Colorantes:
 La mayoría son compuestos orgánicos que tienen
alguna afinidad específica por los materiales
celulares.
 Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
cationes y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente,
tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos
ácidos.

43.  Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de
metileno, el cristal violeta y la safranina.
 Otros colorantes son aniones y se combinan con
los constituyentes celulares cargados
positivamente, como las proteínas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el
rojo Congo.

44.  Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles; los colorantes de este grupo se
combinan con los materiales lipídicos de la célula,
usándose a menudo para revelar la localización de
las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de
colorante liposoluble es el negro Sudán.

45.  Tinciones simples
 Positivas (se tiñe la bacteria)
▪ Azul de metileno
▪ Hidróxido de potasio (hongos)
 Negativas (se tiñe el medio que rodea a la
bacteria)
▪ Tinta china (cápsulas)
▪ Nigrosina

46.  Hacer un frotis sobre un porta, secar y fijar.
 Cubrir la preparación con el colorante
elegido, durante el tiempo especificado.
 Lavar con agua, arrastrando todo el exceso
de colorante.
 Secar al aire.
 Observar al microscopio.
 Las bacterias se verán teñidas del color
elegido.

47. TINCIÓN SIMPLECON
AZUL DE METILENO

48. TINCIÓNCON
HIDRÓXIDO DE
POTASIOAL 10%
El KOH digiere
parcialmente las
proteínas de las
membranas
celulares, pero no
actúa sobre los
polisacáridos de
los hongos.

49. TINCIÓN SIMPLECON
TINTA CHINA
Los polisacáridos
de la bacteria
rechazan el
colorante y se
observa la
cápsula.

50.  Tinciones compuestas o diferenciales
 Tinción de Gram
 Tinción de Ziehl-Neelsen
 Tinción de Giemsa
-Se utilizan varios colorantes
-Las estructuras celulares se diferencian en
función de los diferentes colorantes que fijan de
acuerdo con su constitución química.

51.  Tinción importante.
 Dividir las bacterias en dos grupos: grampositivas y
gramnegativas debido a las diferencias constitutivas
en la estructura de sus paredes celulares.

52.  Cubrir el frotis con cristal violeta y lavar para
quitar el exceso de colorante.
 En este estado, todas las células están
teñidas de azul.
 Se coloca lugol (solución yodada), el I2 entra
en las células y forma un complejo insoluble
en agua con el cristal violeta, en todas las
células.

53.  Se lleva a cabo después la decoloración,
usando una mezcla de alcohol-acetona,
sustancias en las que es soluble el complejo
I2-cristal violeta.
 Las bacterias grampositivas no se decoloran,
mientras que las gramnegativas si lo hacen.
 La mezcla de alcohol/acetona es un solvente
lipídico y disuelve la membrana exterior de la
pared de la célula.

54.  Las células gramnegativas son incapaces de
retener el cristal violeta-yodo por tener poco
peptidoglicano y la célula se decolora.
 Las células grampositivas tienen más
peptidoglicano y fijan el colorante, contienen
menos lípido y no se disuelven, la mezcla
alcohol-acetona deshidrata la pared celular y
cierra los poros, provocando que el complejo
cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la
pared celular.

55.  Se utiliza una coloración de contraste como la
safranina que es roja, que colorea todas las
células restantes.

56. BACTERIAS
GRAMPOSITIVAS

57. BACTERIAS
GRAMNEGATIVAS

58.  BAAR (bacilos alcohol-ácido resistentes)
 Las paredes celulares de ciertas bacterias
contienen ácidos grasos (ácidos micólicos)
que les confieren la propiedad de resistir la
decoloración con alcohol-ácido, después de la
tinción con colorantes básicos.
 La coloración clásica de Ziehl-Neelsen
requiere calentamiento para que el colorante
atraviese la pared bacteriana.

59.  Hacer un frotis, secar y fijar con calor.
 Cubrir con fuscina fenicada por 5-10 min,
calentando hasta que emita vapor, sin que hierva
o se consuma y lavar.
 Decolorar el frotis con alcohol ácido por 1 min y
lavar.
 Cubrir con azul de metileno como contraste por 1
min. y lavar.
 Observar al microscopio con el objetivo 100x
(inmersión).

60. TINCION DE ZIEHL-
NEELSEN

61.  Observar bacterias
intracelulares, como
Rickettsia, parásitos
sanguíneos, etc.
 Se usa la solución de
Giemsa, se deshidrata
con alcohol y se
aclara con Xilol.

62.  También se emplea la modificación deWright
que detecta zonas con alto contenido de ADN, lo
que permite distinguir los componentes
celulares.
 Resultados:
 Citoplasma: rosa
 Núcleos: azul
 Eritrocitos: rojo
 Gránulos de las células cebadas: púrpura
 Bacterias y parásitos: azul

63.  Tinciones estructurales
 Tinción de cápsulas
 Tinción de flagelos
 Tinción de esporas
 Tinción de corpúsculos metacromáticos
 Tinciones especiales:
 Tinciones fluorescentes
 Tinción de auramina-rodamina
 Tinción con naranja de acridina

64.  Los ácidos micólicos de las micobacterias se
tiñen con rodamina-auramina y se usa
permanganato de potasio como contraste.
 Las micobacterias aparecen naranjas en un
fondo verde.

65.  Se une al acido nucleico
nativo o desnaturalizado.
 Colorante “vital”
 Verde = vivo
 Rojo = muerto

66.  La paredes
celulares de los
hongos fijan el
colorante,
aumentando su
visibilidad.

67.  Observar endosporas.
 Se usa verde de
malaquita que tiñe las
esporas en caliente y
safranina como
contraste.