Jose Ignacio Recalde MD,PhD. - TESIS DOCTORAL -

SERIE: SALUD
Modificaciones funcionales, clínicas y
bioquímicas tras cross-linking corneal
por queratocono
Programa de Doctorado en Biomedicina y Ciencias de la Salud
Escuela de Doctorado e Investigación
José Ignacio Recalde Yurrita
Dirigida por:
Dr. Juan Antonio Durán de la Colina
Dr. Miguel Ángel Sánchez Tena
Dr. Iñaki Rodríguez Agirretxe
Madrid, 2017

INFORME Y AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR PARA PRESENTAR LA TESIS
DOCTORAL
(Planteamiento, objetivos, medios utilizados y aportaciones originales)
ESCUELA DE DOCTORADO E INVESTIGACIÓN
DE LA UNIVERSIDAD EUROPEA DE MADRID
Con objeto de profundizar en el conocimiento sobre la cirugía de cross-linking
corneal y conocer si es capaz de detener la progresión del queratocono, hemos
analizado la evolución topográfica corneal en el postoperatorio. También hemos
evaluado diversos parámetros clínicos de función lagrimal y la evolución de tres
biomarcadores en lágrima relacionados con la patología de ojo seco.
La topografía corneal permanece estable a lo largo del estudio y la función
lagrimal tampoco se ve afectada. Como novedad aportada por esta tesis se
puede señalar el hallazgo de que se produce la normalización tras el cross-
linking de dos de los biomarcadores estudiados (MMP-9 y S100A6). El tercero
(CST4) no se ve alterado.
Por el interés del tema estudiado y por tratarse de un trabajo original realizado
siguiendo estrictos métodos científicos,
El Dr. Juan Antonio Duran de la Colina, el Dr. Miguel Ángel Sánchez Tena y el
Dr. Iñaki Rodríguez Agirretxe, Directores de la Tesis de la que es autor D. Jose
Ignacio Recalde
AUTORIZAN la presentación de la referida Tesis para su defensa en
cumplimiento del Real Decreto 99/2011, de 28 de enero, por el que se regulan
las Enseñanzas Oficiales de Doctorado, y de acuerdo al Reglamento de
Enseñanzas Universitarias Oficiales de Doctorado de la Universidad Europea de
Madrid RD 1393/2007 y RD99/2011.
Madrid, 15 de marzo de 2017
Fdo.: LOS DIRECTORES
Dr. Juan Duran de la Colina
Dr. Miguel Ángel Sánchez Tena
Dr. Iñaki Rodríguez Agirretxe

AGRADECIMIENTOS
La idea de escribir esta tesis surgió de conversaciones mantenidas con Iñaki
Rodríguez Agirretxe sobre las dificultades inherentes a un empeño semejante.
También su ejemplo resultó estimulante para mí, pues escribió su propia tesis
pasados ya sus años de formación. A él debo, por lo tanto, el impulso inicial.
Arantxa Acera ha sido mi “hada madrina”, guiándome durante todo el
proceso. La parte bioquímica y experimental habría sido infinitamente más
ardua sin su apoyo.
Juan Duran de la Colina, ha desempeñado el papel fundamental de alta
dirección y apoyo decisivo en momentos cruciales.
Miguel Ángel Sanchez Tena y otra vez Iñaki Rodriguez Agirretxe con su pericia
estadística han contribuido como codirectores a la exigencia y coherencia de
este trabajo.
Juan San Cristóbal Epalza con sus atinadas observaciones, ha resultado de una
ayuda inestimable. Word y Excel no tienen secretos para él.
La colaboración de mis compañeros del ICQO, sobre todo Ainhoa Bilbao y
Vanessa Freire del departamento de I+D, ha sido fundamental para la
recolección de muestras y logística en general.
Finalmente, la elevada preparación técnica del equipo de colaboradores de
BIOFTALMIK SL, encargados del estudio bioquímico, ha dado a este trabajo su
carácter innovador.
Quede aquí constancia de mi profundo agradecimiento a todos ellos, pues
sin su ayuda no me habría sido posible escribir esta tesis.

” Este proyecto está financiado en parte por el Ministerio de Economía y
Competitividad, dentro de la convocatoria Retos-Colaboración del Programa
Estatal de Investigación, Desarrollo e Innovación Orientada a los Retos de la
Sociedad, en el marco del Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica y
de Innovación 2013-2016 (BOE de 19 de diciembre) cuyo expediente es RTC-
2014-2375-1“

A mis padres José Luis†
y Paquita por su ejemplo y educación en valores.
A mi querida esposa Begoña por su apoyo incondicional en todo momento.
A nuestro maravilloso hijo Iñaki, con fe en él y esperanza en su futuro.

ÍNDICE
RESUMEN...................................................................................................... 17
ABSTRACT ..................................................................................................... 18
0. INTRODUCCIÓN.................................................................................... 21
0.1 Queratocono.................................................................................. 21
0.1.1 Epidemiología............................................................................ 22
0.1.2 Genética .................................................................................... 24
0.1.3 Patogenia................................................................................... 26
0.1.3.1 Inflamación........................................................................ 28
0.1.3.3 Alteraciones de la sensibilidad corneal............................. 33
0.1.4 Fisiopatología ............................................................................ 33
0.1.4.1 Desequilibrio entre moléculas pro y antiinflamatorias..... 34
0.1.4.2 Estrés oxidativo ................................................................. 35
0.1.5 Alteraciones histo-patológicas corneales.................................. 36
0.1.6 Clínica ........................................................................................ 38
0.1.7 Topografía corneal en el queratocono...................................... 40
0.1.7.1 Sistemas de topografía...................................................... 40
0.1.7.2 Clasificación topográfica del queratocono........................ 41
0.1.8 Tratamiento............................................................................... 43
0.1.8.1 Gafas.................................................................................. 43
0.1.8.2 Lentes de contacto............................................................ 43
0.1.8.3 Implantación de anillos intracorneales............................. 45
0.1.8.4 Queratoplastia lamelar profunda (DALK).......................... 46
0.8.1.5 Queratoplastia penetrante................................................ 48

0.1.8.6 Cross-Linking (CXL) ............................................................ 48
0.1.8.7 Corneoplástica (cirugías combinadas)............................... 49
0.2 Cross-linking corneal con radiación UVA y riboflavina.................. 50
0.2.1 Mecanismo de acción: efecto cross-linking .............................. 51
0.2.2 Indicaciones............................................................................... 56
0.2.3 Técnica quirúrgica ..................................................................... 57
0.2.3.1 El Protocolo de Dresde...................................................... 57
0.2.3.2 Otras técnicas quirúrgicas ................................................. 57
0.2.4 Complicaciones.......................................................................... 64
0.3 Biomarcadores .............................................................................. 64
0.3.1 Biomarcadores en el queratocono............................................ 66
0.3.1.1 Biomarcadores en córnea ................................................. 66
0.3.1.2 Biomarcadores en lágrima................................................. 67
0.3.2 Biomarcadores analizados en esta tesis.................................... 70
0.3.2.1 Metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9). .......................... 70
0.3.2.2 Calciclina (S100A6) ............................................................ 72
0.3.2.3 Cistatina S (CST4)............................................................... 74
1. JUSTIFICACIÓN...................................................................................... 79
2. HIPÓTESIS.............................................................................................. 83
2.1 Hipótesis general........................................................................... 83
2.2 Hipótesis secundaria primera........................................................ 83
2.3 Hipótesis secundaria segunda....................................................... 83
3. OBJETIVOS............................................................................................. 87
3.1 Objetivo general............................................................................ 87
3.2 Objetivos específicos..................................................................... 87

4. MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................................ 91
4.1 Diseño del estudio......................................................................... 91
4.2 Demografía.................................................................................... 91
4.2.1 Pacientes. .................................................................................. 91
4.2.2 Diagnóstico del queratocono .................................................... 91
4.2.3 Criterios de inclusión / exclusión. ............................................. 93
4.3 Intervención quirúrgica................................................................. 94
4.4 Calendario de visitas. .................................................................... 95
4.5 Exploraciones clínicas realizadas en cada visita............................ 95
4.5.1 Osmolaridad lagrimal ................................................................ 96
4.5.2 Cuestionario Ocular Surface Disease Index (OSDI). ................. 96
4.5.3 Tiempo de ruptura de la película lagrimal (BUT). ..................... 97
4.5.4 Tinción corneal con fluoresceina (FLUO)................................... 99
4.5.5 Test de Schirmer 1 con anestesia (SCH).................................. 100
4.5.6 Aclaramiento lagrimal (CLR).................................................... 100
4.5.7 Tinción corneal con verde de lisamina (VL)............................. 101
4.6 Recogida de la muestra lagrimal................................................. 102
4.7 Análisis de la muestra lagrimal por inmunoensayo. ................... 103
4.8 Topografía y agudeza visual corregida........................................ 107
4.9 Análisis estadístico ...................................................................... 107
5. RESULTADOS....................................................................................... 111
5.1 Evolución topográfica y funcional postoperatoria...................... 113
5.1.1 Queratometría en el ápex corneal (k max). ............................ 113
5.1.2 Queratometría media (Sim K) ................................................. 114
5.1.3 Grosor corneal mínimo ........................................................... 115
5.1.4 Agudeza visual con corrección................................................ 115

5.2 Análisis estadístico de los datos topográficos............................. 116
5.2.1 Valores basales........................................................................ 116
5.2.2 Comparación de resultados con basal .................................... 116
5.2.3 Correlaciones entre parámetros topográficos........................ 118
5.3 Análisis bioquímico de biomarcadores (microarrays)................. 119
5.3.1 Metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9). ................................ 121
5.3.2 Calciclina (S100A6) ................................................................. 121
5.3.3 Cistatina S (CST4)..................................................................... 122
5.4 Análisis estadístico de los datos bioquímicos obtenidos ............ 122
5.4.1 Valores basales preoperatorios............................................... 122
5.4.2 Comparación de resultados con basal (3,6 y 12 meses) ......... 123
5.4.3 Comparación versus basal por subgrupos evolutivos............. 125
5.4.4 Correlación entre datos clínicos y bioquímicos....................... 127
5.4.5 Correlación entre datos clínicos y bioquímicos por subgrupos
evolutivos…………………………………………………………………………….128
5.5 Evaluación de parámetros clínicos.............................................. 130
5.5.1 Osmolaridad lagrimal .............................................................. 130
5.5.2 Cuestionario Ocular Surface Disease Index (OSDI).................. 130
5.5.3 Tiempo de ruptura de la película lagrimal (BUT). ................... 131
5.5.4 Tinción corneal con fluoresceína (FLUO)................................. 132
5.5.5 Test de Schirmer 1 con anestesia (SCH).................................. 132
5.5.6 Aclaramiento lagrimal (CLR).................................................... 133
5.5.7 Tinción corneal con verde de lisamina (VL)............................. 134
5.6 Análisis estadístico de los datos clínicos obtenidos.................... 135
5.6.1 Valores basales preoperatorios de los pacientes.................... 135
5.6.2 Comparación de resultados con basal (3, 6 y 12 meses) ........ 135
5.6.3 Comparación de resultados por subgrupos evolutivos........... 138

5.6.4 Correlaciones entre parámetros clínicos ................................ 141
6 DISCUSIÓN .......................................................................................... 145
7 CONCLUSIONES................................................................................... 167
8 BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................... 171
ANEXOS....................................................................................................... 191
ABREVIATURAS........................................................................................ 193
AUTORIZACIÓN DEL ESTUDIO ................................................................. 197
ARTÍCULOS PUBLICADOS......................................................................... 199
PRESENTACIONES Y POSTERS.................................................................. 207

RESUMEN
Con objeto de conocer si el cross-linking del colágeno corneal (CXL) es capaz
de detener la progresión del queratocono y qué tipo de cambios induce en
la córnea y la superficie ocular, se ha planteado un estudio prospectivo
observacional. Se ha estudiado la evolución topográfica y funcional de
pacientes tratados con CXL, junto con la expresión en lágrima de tres
biomarcadores (MMP-9, S100A6 y CST4). También se han valorado distintos
parámetros clínicos de alteración de la superficie ocular. La función visual
mejora ligeramente tras el CXL y la topografía permanece estable. Dos de
los biomarcadores analizados (S100A6 y MMP-9) disminuyen su
concentración en el postoperatorio de manera estadísticamente
significativa. El tercer biomarcador CST4 no varía tras cross-linking. Los datos
clínicos muestran que CXL no produce alteración de los parámetros
comúnmente utilizados para valorar la superficie ocular. Se concluye que el
CXL produce cambios permanentes en la expresión en la lágrima de
proteínas relacionadas con la inflamación, la apoptosis y el ojo seco. Estos
cambios podrían desempeñar un papel complementario en la estabilización
postoperatoria del queratocono tras CXL. Se añadirían al aumento de la
rigidez corneal por el efecto cross-linking o reticulación del colágeno corneal,
que está considerado en la actualidad como el único agente estabilizador
del queratocono tras CXL.

ABSTRACT
In order to know if corneal collagen cross-linking (CXL) is able to stop the
progression of keratoconus and wether it affects the ocular surface, a
prospective observational study has been performed. The postoperative
topographic evolution of patients treated with CXL has been recorded. The
expression of three biomarkers (MMP-9, S100A6 and CST4) in the tear film
of these patients and several clinical parameters of ocular surface disease
have been studied. Topography revealed no postoperative progression of
keratoconus. S100A6 and MMP-9 were overexpressed preoperatively and
normalized after CXL. CST4 showed no postoperative variation. It is
concluded that CXL does not produce alteration of the parameters
commonly used to evaluate the ocular surface in the medium and long term.
CXL elicits permanent changes in the expression of proteins related to
inflammation, apoptosis and dry eye. Such changes could be partially
responsible for the postoperative stabilization of keratoconus after cross-
linking. In that case, the increased corneal stiffness (cross-linking effect) will
not be the unique factor in the stabilization of keratoconus.

INTRODUCCIÓN
21
0. INTRODUCCIÓN
0.1 Queratocono
El queratocono es una ectasia progresiva de la córnea de origen desconocido.
Cursa con reblandecimiento del tejido corneal, que se deforma adquiriendo
una forma cónica, lo que da lugar a la aparición de un astigmatismo irregular
que afecta a la visión de manera importante (Fig. 0.1).
Es una enfermedad conocida de muy antiguo. Las primeras descripciones
datan de los antiguos egipcios. A pesar de esto muchos aspectos de su
etiología y patogenia continúan siendo un misterio para nosotros
actualmente.
Dado que no presenta los clásicos signos externos de inflamación; calor, rubor,
tumor y dolor, ha sido clasificado desde su descripción por Nottingham en
1854 como un cuadro no inflamatorio(Kachmer et al., 1984; Rabinowitz 1998).
Este criterio está siendo puesto en cuestión en los últimos tiempos pues se
están publicando numerosos artículos que ponen de manifiesto la expresión
alterada de mediadores de inflamación en la lágrima (Lema y Duran 2005, Jun
et al., 2011), tejido corneal (Fan Gaskin et al., 2015) y humor acuoso de estos
pacientes (Soria et al., 2015). La evolución natural de la enfermedad es
progresiva en muchos casos, sin que actualmente podamos achacar este
hecho a una causa concreta.
Afortunadamente hoy en día disponemos de medios suficientes para
garantizar que estos enfermos puedan tener una buena calidad de vida. Por
una parte se han producido avances muy importantes en la detección precoz
de la afección con la popularización de los topógrafos corneales. Por otra, las
grandes mejorías que se han logrado en la corrección óptica de estos

INTRODUCCIÓN
22
pacientes permiten que puedan hacer una vida normal en la mayor parte de
los casos.
Por último, en las dos últimas décadas se han desarrollado sistemas como el
cross-linking corneal (CXL) que por primera vez han permitido frenar el
desarrollo natural del proceso (Raiskup-Wolf et al., 2008; O´Brart et al., 2015).
Su incidencia de complicaciones es muy baja (Koller et al., 2009; Koppen et
al., 2009; Rama et al., 2009). Por este motivo el procedimiento ha sido
recientemente aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) de los
EEUU lo que supone su aceptación general como una técnica homologada
para el tratamiento del queratocono. Este importante respaldo acrecienta la
necesidad de estudios que ayuden a mejorar el conocimiento de esta técnica.
0.1.1 Epidemiología
Existe la impresión entre el colectivo médico de que el queratocono es una
patología en aumento. La incidencia oscila entre 1 y 25 casos por 100.000
Figura 0.1: Protrusión corneal excéntrica en el
queratocono. (Imagen propia)

INTRODUCCIÓN
23
habitantes por año. La prevalencia varía entre 1 y 3 por cada 1000 habitantes
(Kennedy et al., 1986). Estas cifras están sometidas a grandes oscilaciones
pues existen grupos raciales como los asiáticos del subcontinente indio que
presentan una prevalencia mayor. Además algunos grupos étnicos y sociales
con alta consanguinidad, como algunas tribus del norte de Pakistan, los
musulmanes del este de Africa y los maoríes de Nueva Zelanda, presentan
tasas muy superiores (Pearson et al., 2000, Mohammad Naderan et al., 2015).
La enfermedad se manifiesta por lo general en la pubertad y progresa hasta
los cuarenta años. Existen, como es natural, las obligadas excepciones a esta
regla, pues se han dado casos de aparición precoz, incluso a los 6 años (Gomes
et al., 2015).
El queratocono se puede presentar asociado a cuadros como atopia,
conjuntivitis vernal o retinitis pigmentosa. Existe una fuerte asociación con el
síndrome de Down con una prevalencia de entre el 0,5 y el 15% (Cullen et al.,
1963, Rabinowitz et al., 1998). La asociación con la amaurosis congénita de
Leber es muy alta (Elder et al., 1994).
Hay varios autores que relacionan al queratocono con alteraciones del tejido
conectivo como la osteogénesis imperfecta, síndrome de Ehlers-Danlos y
prolapso de la válvula mitral, sugiriendo que el queratocono podría ser una
manifestación localizada de una alteración leve del tejido conectivo
(Robertson et al., 1975, Woodward et al., 1990, Lichter et al., 2000). Hasta
ahora no se ha podido establecer una relación causal. Sin embargo, tiene
sentido buscar signos de atopia sistémica o de alergia ocular en estos
pacientes. Y, al contrario, descartar queratocono en pacientes con síndrome
de Down o enfermedades del tejido conectivo.

INTRODUCCIÓN
24
0.1.2 Genética
El papel de la herencia en el queratocono está bien documentado (Rabinowitz
et al., 1990, Bechara et al., 1996). La acumulación de casos de queratocono
en determinadas familias junto a la elevada tasa de presentación simultánea
en gemelos monocigóticos, pero no en dicigóticos (Tuft et al., 2012), ha
llevado a presumir una base genética en el queratocono. La prevalencia de la
enfermedad en los familiares de los pacientes afectados es entre 15 y 64
veces superior a la de la población en general (Kennedy et al., 1986; Wang et
al., 2000).
Aunque la mayor parte de los casos de queratocono son de aparición
esporádica, se han documentado modos de transmisión autosómica
dominante con penetrancia reducida y también de transmisión autosómica
recesiva (Davidson et al., 2004; Wang et al., 2000; Bisceglia et al., 2009;
Tyynismaa et al., 2002)
Los numerosos estudios realizados tratando de localizar los loci responsables
del queratocono, han permitido identificar al menos 17 loci genómicos (Fig.
0.2), aunque raramente han relacionado el mismo locus con el queratocono.
Además, apenas se han identificado mutaciones en el mismo gen en los
múltiples loci estudiados en casos de queratocono familiar (Gayecka et al.,
2011), lo que sugiere una gran heterogeneidad genética en la epidemiología
del queratocono (Nowak, et al., 2011). Hasta la fecha, sólo un locus, 5q21.2,
previamente reportado (Tang et al., 2005), ha sido replicado (Bisceglia et al.,
(2009). Esto significa que el queratocono podría ser causado por mutaciones
en un diferente número de genes en diferentes familias.

INTRODUCCIÓN
25
Los genes implicados potencialmente han sido el VSX1 (distrofia polimorfa
posterior), miR-184 (catarata polar anterior), AIPL-1 y CRB1 (amaurosis
congénita de Leber), DOCK9, SOD1, RAB3GAP1 y HGF entre otros.
Diversos investigadores han examinado las mutaciones VSX1 en pacientes
con queratocono (Gajecka et al., 2009; Abu-Amero et al., 2011; Saee-Rad et
Figura 0.2: Loci genómicos del queratocono: 5q21.2 es replicado por 5q14.3-
q21.1.
(Tomada de Nowak DM. Middle East African Journal of Ophthalmology)

INTRODUCCIÓN
26
al., 2011). La mayoría de las variantes identificadas son polimórficas (Wheeler
et al., 2012) y no está claro si las mutaciones VSX1 contribuyen a la
patogénesis de KC (Aldave et al., 2006; Romero-Jimenez et al., 2010).
También es posible que las mutaciones de VSX1 afecten sólo a un porcentaje
muy pequeño de pacientes de queratocono, lo cual es consistente con el
concepto de heterogeneidad genética de queratocono.
0.1.3 Patogenia
Los factores que determinan el comienzo, la progresión o estabilización de
esta enfermedad son desconocidos. Parece que la etiología es multifactorial
o representa el camino final común de distintos procesos patológicos
(Karchmer JH., 2004).
El proceso comienza con un primer desencadenante o varios
desencadenantes que ponen en marcha la cascada de sucesos en la córnea,
con cambios histológicos en la capa epitelial y estromal, condicionando la
aparición de la ectasia. Uno de los rasgos más significativos en el queratocono
es el adelgazamiento progresivo que resulta de la pérdida de los
componentes estructurales de la córnea, entre los que destaca la destrucción
de la matriz extracelular.
Las córneas con queratocono exhiben un incremento de la actividad
enzimática o un desequilibrio en la acción de los inhibidores de proteasas. La
actividad colagenolítica en la córnea es muy compleja y de difícil análisis.
Además, dentro de una misma córnea pudieran estar ocurriendo sucesos
diferentes (actividad enzimática o proceso cicatricial), lo que explicaría los
hallazgos no uniformes y en ocasiones contradictorios.
La aparición del queratocono podría ser probablemente el resultado de una
interacción compleja tanto de predisposición genética como de factores

INTRODUCCIÓN
27
desencadenantes ambientales. En esta interacción se basa la hipótesis de las
dos causas (two hits theory) en el desencadenamiento del queratocono
(Karchmer JH 2004).
El queratocono se desencadena por una combinación de factores entre los
que se pueden señalar el frotamiento ocular, atopia, los microtraumatismos
producidos por las lentes de contacto y la exposición a la radiación UVA de la
atmósfera. La contribución relativa de cada uno de estos factores es
desconocida. Una excesiva presencia de cualquiera de estos factores
ambientales provocaría stress oxidativo que dañaría la córnea por la
incapacidad de procesar las especies de oxígeno reactivas (ROS). Esto
provocaría finalmente un proceso de degradación, adelgazamiento y
deformación corneal con la consiguiente pérdida de visión.
El adelgazamiento corneal que en último término dará lugar a la ectasia en el
queratocono podría estar relacionado con la degradación de las laminillas del
colágeno y la matriz extracelular posiblemente debido a la acción de enzimas
proteolíticas (Balasubramanian et al 2010). El proceso sería debido a falta de
expresión de enzimas como aldehído dehidrogenasa 3 (ALDH 3), catalasa o la
superóxido dismutasa (SOD), incapaces de neutralizar las especies reactivas
de oxígeno (ROS) (Gondhowiardjo et al, 1993). El tejido corneal así debilitado
es incapaz de resistir tracciones o presiones mecánicas y mantener al mismo
tiempo su forma regular asférica. Esto dará lugar a la típica deformación en
forma de cono, la aparición del astigmatismo irregular y el consiguiente
deterioro de la visión (Fig. 0.1).

INTRODUCCIÓN
28
0.1.3.1 Inflamación
Existe una evidencia creciente de que el queratocono podría presentar en sí
mismo un elemento inflamatorio, como se deriva de varias observaciones en
las que se aprecia en estos pacientes, una alteración de mediadores de la
inflamación en lágrima, respecto a los sujetos normales (Lema y Durán 2005).
Algunos autores, sugieren que, más que un aumento indiscriminado de
citoquinas proinflamatorias, lo que ocurre en el queratocono es más bien un
desequilibrio entre moléculas proinflamatorias y antiinflamatorias que
alterarían la homeostasis corneal (Jun et al., 2011; Gordon-Shaag et al., 2015).
Aunque el queratocono se ha asociado con diversas patologías en las que
concomitantemente existiría un proceso inflamatorio como por ejemplo, la
atopia, fiebre del heno y asma, el frotamiento ha resultado ser el factor más
determinante en la aparición de la ectasia. El uso de lentes de contacto, tanto
rígidas como hidrófilas, tan frecuente en estos pacientes, puede ser un factor
agravante o desencadenante (Macsai et al., 1990). Se ha demostrado que
diversas citoquinas (IL-6, TNF-α) están sobre expresadas en los pacientes con
queratocono que son usuarios de lentes de contacto; cuanto más avanzado
es el cuadro, mayores niveles alcanzan los mediadores en la lágrima del
paciente (Lema et al., 2008).
0.1.3.2 Frotamiento ocular compulsivo
El frotamiento intensivo de los ojos, es una característica central del cuadro
de queratocono (Bawazeer et al., 2000; Mc Monnies et al., 2007).
Curiosamente, muchos enfermos no son conscientes de que realicen este
gesto tan exageradamente y de hecho, al ser interrogados en este sentido, lo
niegan. Son con frecuencia los familiares los que refieren que, en efecto, se
suelen frotar los ojos habitualmente e incluso son reprendidos por ello. Se

INTRODUCCIÓN
29
han citado diversos mecanismos tanto demostrados como supuestos por los
que el frotamiento desencadenaría la ectasia (Mc Monnies et al., 2009).
- Aumento de mediadores de inflamación en la lágrima.
- Actividad enzimática anormal.
- Aumentos puntuales muy elevados de presión intraocular (PIO).
- Presión hidrostática elevada en el tejido corneal.
- Alteración de la viscosidad de la sustancia propia de la córnea.
- Adelgazamiento epitelial.
- Laxitud de las fibras de colágeno en el ápex corneal.
- Alteraciones en los queratocitos.
El frotamiento intenso y prolongado de los ojos, aumenta el nivel de
proteasas y mediadores de inflamación; IL-6, TNF-α y MMP-13 en la lágrima
de sujetos sanos de manera similar a la expresada en pacientes con
queratocono establecido (Balasubramanian et al., 2013). Este hecho da al
frotamiento un papel clave en el desencadenamiento de la afectación corneal.
En artículos recientes (Gatinel 2016) se magnifica la importancia del factor
mecánico en la patogenia del queratocono, llegando a postularse que el
frotamiento ocular compulsivo sería el factor único y suficiente para el
desencadenamiento de la ectasia corneal.
La formación del cono parece depender sobre todo de la pérdida de
resistencia del tejido como consecuencia de la reducción de viscosidad y
función de sostén en la sustancia propia de la córnea que haría que la córnea
se deformase, cediendo ante el aumento de la PIO. El hydrops corneal,
caracterizado por edema estromal debido al paso del humor acuoso a través
de una dehiscencia de la membrana de descemet se produce también como

INTRODUCCIÓN
30
consecuencia de un traumatismo corneal reiterado, relacionado con el
frotamiento (Maharana et al., 2013).
Existen en la literatura múltiples comunicaciones reportando casos de
ectasias unilaterales relacionadas directamente con el frotamiento (Jafri et al.,
2004; Diniz et al., 2005; Ioannidis et al., 2005). Un caso de ectasia corneal con
restregamiento compulsivo de los ojos, relacionado con el síndrome de
Tourette, por desgracia terminó en ceguera (Kandakaris et al., 2011). Se ha
publicado un caso de queratoplastia bilateral que no abandonó su hábito de
frotamiento compulsivo y desarrolló un queratocono posteriormente (Koenig
et al., 2008).
El frotamiento ocular que se produce en el queratocono tiene unas
características propias muy bien definidas (Recalde y Duran, 2014). De hecho,
podría incluso servir para poner en guardia al clínico sobre la presencia de
esta enfermedad. El paciente apoya las yemas de dos dedos, índice y medio,
e incluso el anular (Fig. 0.3). Comprime el globo con gran fuerza durante un
periodo prolongado, a veces de más de 60 segundos, realizando
simultáneamente un movimiento circular. Otra variante quizás más
exagerada es apoyar los nudillos y comprimir el globo a través del párpado
realizando también en este caso, el consabido movimiento circular (Fig. 0.4).
Durante esta agresiva maniobra, la PIO se incrementa extraordinariamente
(se multiplica por diez), con los consiguientes efectos sobre el nervio óptico y
otras estructuras oculares.
Por otra parte, en la alergia ocular es frecuente que el frotamiento tenga otras
características. En este caso, el paciente extiende su mano y juntando los
dedos, coloca el dorso de la mano sobre el ojo realizando un movimiento de
vaivén (Fig. 0.5).

INTRODUCCIÓN
31
Figura 0.3: Movimiento circular, compresivo.
(Imagen propia)
Figura 0.4: Compresión del globo con los nudillos.
(Imagen propia)
Figura 0.5: Frotamiento ocular en la alergia.
(Imagen propia)

INTRODUCCIÓN
32
Otras veces suelen apoyar la palma de la mano; las eminencias tenar e
hipotenar cubriendo completamente toda la zona de los anexos procediendo
a continuación a restregar concienzudamente (Fig. 0.6). También suelen
emplear la yema del dedo índice para hurgar en la zona de la carúncula (Fig.
0.7).
Figura 0.7: Hurgar en la zona de la carúncula (alergia).
(Imagen propia)
Figura 0.6: Restregado apoyando la palma (alergia).
(Imagen propia)

INTRODUCCIÓN
33
0.1.3.3 Alteraciones de la sensibilidad corneal
La inervación corneal desempeña un papel fundamental en el mantenimiento
de la estructura y función de la córnea. La alteración de la sensibilidad corneal
en el queratocono es un hecho conocido así como la correlación entre la
hipoestesia y la severidad del cuadro clínico (Millodot et al., 1983). La
disminuida sensibilidad corneal traduciría una alteración del epitelio y el
estroma. Esto se asocia con deficiencia lagrimal, alteraciones en la citología
de impresión y adelgazamiento corneal.
Mediante microscopía confocal se han encontrado importantes alteraciones
en las características morfológicas los nervios corneales sub-basales y
estromales, que se ven engrosados (Al-Aqaba et al., 2011) y tienden a
orientarse anárquicamente sobre todo en la zona del cono.
Todo esto sugiere un importante papel de la inervación corneal en la
fisiopatología del queratocono (Kontadakis et al., 2013).
0.1.4 Fisiopatología
Una evidencia creciente apoya el hecho de que el adelgazamiento y la ectasia
de la córnea están relacionados con una matriz extracelular degradada con
aumento de los niveles de MMP-9, IL-6 y TNF-α (Lema y Duran 2005; Jun et
al., 2011) y el aumento del estrés oxidativo (Galvis et al., 2015).
Los mecanismos por los que se llega a desencadenar el cuadro de
queratocono se pueden sintetizar en alteración del equilibrio entre moléculas
proinflamatorias y antiinflamatorias, y stress oxidativo (Fig 0.8).
Las anomalías en la reparación del estroma y la actividad de las ROS, están
implicadas en el desarrollo del queratocono. Se producen modificaciones en
la composición, disposición y cuantía del colágeno corneal, de forma que los

INTRODUCCIÓN
34
colágenos tipo I, III, V y XII están reducidos. También hay reducción del
número de lamelas de colágeno de forma que se produce una reordenación
espacial vertical y horizontal (Meek et al., 2005).
La desregulación de las vías reparadoras en el queratocono hace que las
córneas queratocónicas estén permanentemente alteradas. Además, la
respuesta a una agresión externa (frotamiento, stress oxidativo, uso de lentes
de contacto), está debilitada. Se ha demostrado que la producción basal de
prostaglandina E2 (PGE2) es 10 veces mayor en el queratocono que en los
sujetos normales (Pouliquen et al., 1996). La PGE2, cuya liberación puede ser
inducida por el TNF-α, tiene efectos inhibidores sobre la síntesis de colágeno
lo que produce un aumento de la degradación del colágeno.
0.1.4.1 Desequilibrio entre moléculas pro y antiinflamatorias
La degradación del estroma corneal en el queratocono implica la expresión
de mediadores inflamatorios, incluyendo citoquinas proinflamatorias y
moléculas de adhesión celular, que modulan la actividad de MMPs y son
moduladas por ella. Un balance inadecuado entre citoquinas proinflamatorias
y antiinflamatorias, podría conducir a una alteración de la estructura y
función corneales, desencadenando un incrememento en la expresión de
metaloproteinasas y la apoptosis de queratocitos (Cheung et al., 2013; Jun et
al., 2011).
En el queratocono hay una disminución importante en el nivel de inhibidores
de proteasas. La actividad enzimática es el resultado del equilibrio con sus
inhibidores (inhibidor tisular de MMP (TIMP). Puede aumentar no sólo debido
a un nivel de IL más alto, sino también debido a un menor nivel del inhibidor
(Clark et al., 2008). La película lagrimal en el queratocono presenta
incremento en el nivel de moléculas pro-inflamatorias: IL-1α, -4, -5, -6, -8, y -

INTRODUCCIÓN
35
17, TNF-α, TGF-B1 (TGFβ-1), ICAM- 1 y VCAM-1. Los niveles elevados de IL-1-
α y TNF-α, y niveles bajos de β-actina se han relacionado con el
desencadenamiento de la apoptosis de queratocitos. Estos datos apoyan el
papel de los eventos inflamatorios crónicos en la patogénesis del
queratocono (Galvis et al., 2015) (Fig. 0.8).
0.1.4.2 Estrés oxidativo
Una de las funciones más importantes de la córnea, es neutralizar los
radicales libres y los oxidantes ROS y especies reactivas de nitrógeno (RNS)
que se forman a partir del metabolismo celular y de la exposición a la luz
ultravioleta del sol. Para llevar a cabo esta función, se vale de enzimas como
superóxido dismutasa (SOD) y glutatión peroxidasa (Shoham et al., 2013).
Las córneas en el queratocono tienen un contenido reducido de glutatión y
una capacidad antioxidante total disminuida, lo cual puede estar relacionado
con un mayor estrés oxidativo que puede inducir daño oxidativo a los
componentes tisulares. La alteración de las vías antioxidantes puede conducir
a la acumulación de subproductos tóxicos, que pueden inducir la apoptosis
de las células corneales. Los queratocitos son particularmente susceptibles al
estrés oxidativo, lo que puede tener un papel importante en el desarrollo y
progresión del queratocono.
En el queratocono hay una disminución en los niveles de varias moléculas
antioxidantes o antiinflamatorias; SOD, glutatión, lactoferrina, IgA e, IL-10.
Cuando existe una escasez de estas moléculas, los niveles de ROS y RNS se
mantienen elevados y dañan el ADN y la cadena respiratoria mitocondrial,
desnaturalizan las proteínas y provocan la peroxidación lipídica, que además
genera radicales libres, entrando así en un círculo vicioso de oxidación

INTRODUCCIÓN
36
(Kenney et al., 2003). Se destruye más de lo que se crea y se repara mal, con
lo que se produce alteración del equilibrio biomecánico.
0.1.5 Alteraciones histo-patológicas corneales
Los primeros cambios aparecen en las capas superficiales del epitelio corneal
y a continuación se afectan las capas basales.
Figura 0.8: Imbalance enzimático. El inadecuado equilibrio entre citoquinas
pro-inflamatorias, enzimas proteolíticas, inhibidores de proteasas,
moduladores inflamatorios y antioxidantes puede conducir a una alteración de
la estructura y función corneal en el queratocono, desencadenando un círculo
vicioso entre el estrés oxidativo, la apoptosis de los queratocitos y el aumento
de la actividad de las metaloproteinasas.
(Tomado de Galvis et al. Keratoconus: an inflammatory disorder?. Eye 2015)

INTRODUCCIÓN
37
A medida que progresa el queratocono, tanto las células del epitelio corneal
como los queratocitos del estroma se ven afectados. En fases avanzadas, la
membrana celular se destruye y desaparecen las células epiteliales basales,
quedando únicamente una o dos capas de células epiteliales superficiales
posicionadas sobre una membrana basal alterada (Rabinowitz, 2003).
El número de queratocitos disminuye en las córneas afectas de queratocono
comparativamente con las de sujetos normales. Hay degeneración de
queratocitos con aumento de la apoptosis (Kalddawi et al., 2002; Kim et al.,
1999). La densidad de queratocitos está disminuida sobre todo en el estroma
central anterior.
El adelgazamiento corneal característico del queratocono se debe a
sobreexpresión de proteasas celulares y desregulación de sus inhibidores
(Kenney et al., 2005). Este hecho produciría además la destrucción de la
matriz extracelular. La acelerada apoptosis y lisis de las células del epitelio
basal con liberación de enzimas proteolíticos intracelulares, son los factores
desencadenantes de los fenómenos destructivos que afectarán al tejido
corneal subyacente. Al degenerar, las células basales epiteliales producen
enzimas proteolíticos que destruyen el estroma corneal subyacente. La
reducción del grosor corneal descrita en el queratocono (Teng., 1963; Patel y
McLaughlin., 1999), podría deberse al aumento de diversas enzimas
degradativas como esterasas, fosfatasas y lipasas (Critchfield et al., 1988; Zou
et al., 1998). También puede influir en el adelgazamiento corneal la actividad
alterada de colagenasas (Kao et al., 1982) y la alteración del balance entre
metaloproteinasas de matriz e inhibidores tisulares de metaloproteinasas de
matriz (TIMPs).
En el queratocono se producen cambios histo-patológicos en distintos
estratos de la córnea. El epitelio degenera, pierde su estructura regular

INTRODUCCIÓN
38
(Jongebloed y Worst., 1987). Se presentan fenómenos degenerativos en el
epitelio corneal de los pacientes con queratocono (Pfister y Burstein., 1977).
El epitelio está adelgazado en la zona central con irregularidades. Hay
degeneración de la membrana basal epitelial con adelgazamiento del epitelio
en la zona central de la córnea, y disminución del número de células (Scroggs
y Proia., 1992; Ucakhan et al., 2006) con aumento simultáneo del área de
superficie celular. Esto afecta sobre todo a la disposición y ordenamiento de
las células del epitelio basal (Tsubota et al., 1995; Hollinsworth et al., 2005;
Niederer et al., 2008). Se observan rupturas en la capa de Bowman
(Sawaguchi 1998) y, junto a ellas, cicatrización estromal y celularidad con
signos de apoptosis.
La microscopía confocal “in vivo”, muestra menor densidad en los nervios
sub-basales que se correlaciona con una disminución de la sensibilidad
corneal. El plexo nervioso subepitelial está alterado (Patel y McGhee., 2006).
Hay pérdida de lamelas de colágeno. Alteración en la orientación de las fibras
de colágeno y disminución de uniones interfibrilares. El endotelio y Descemet,
no suelen estar afectados excepto en caso de Hydrops.
0.1.6 Clínica
El queratocono se manifiesta por lo general en la adolescencia. El paciente
acude a consulta refiriendo alteración visual y varios cambios de graduación
en los últimos tiempos. La exploración clínica puede ser muy engañosa al
principio, pero a medida que avanza la enfermedad, se van apreciando con
claridad los signos patognomónicos.
Los signos clínicos, retinoscópicos y biomicroscópicos son los siguientes:

INTRODUCCIÓN
39
En retinoscopía se aprecian unos reflejos que se cortan “en tijera” y el
reflejo de fondo transmite una formación “en gota de aceite” (Signo de
Charleux).
Nervios corneales prominentes y engrosados.
Adelgazamiento corneal, sobre todo en la zona del ápex.
Cicatrización subepitelial y en la zona del estroma anterior, secundarias a
rupturas en la membrana de Bowman.
Estrías de Vogt. Son finas líneas paralelas en el estroma posterior, que
desaparecen al comprimir el globo.
Anillo de Fleischer, formado por depósitos subepiteliales de
hemosiderina alrededor de la base del cono. Se aprecia mejor con luz azul
cobalto.
Signo de Munson, propio de una fase avanzada de la enfermedad. Al
dirigir la mirada hacia abajo, se deforma el párpado inferior, adquiriendo
un perfil angulado en vez de redondeado, debido a que la córnea es
excesivamente cónica.
Signo de Rizzuti, al iluminar la córnea lateralmente, se produce un haz
enfocado en el limbo nasal.
La evolución natural de la enfermedad es a la progresión, sobre todo en las
fases tempranas de la vida. A partir de los 40 años, lo habitual es que se
estabilice, por el aumento de la rigidez corneal que se produce de modo
natural en la edad madura. Este fenómeno se conoce como cross-linking
enzimático y es debido a la acción de la enzima lisil oxidasa (Dudakova et al.,
2012).

INTRODUCCIÓN
40
0.1.7 Topografía corneal en el queratocono
Es el elemento determinante para el diagnóstico precoz. En el queratocono
se observa una zona paracentral muy convexa, rodeada de zonas más planas,
con una asimetría inferior-superior, con más protrusión en la zona inferior
(Fig 0.9). Puede haber falta de paralelismo en los meridianos más convexos,
que aparecen angulados (Rabinowitz 1995).
0.1.7.1 Sistemas de topografía.
Aunque con medios muy simples como un queratómetro de Javal se puede
sospechar la existencia de queratocono, la introducción de los topógrafos de
reflexión basados en el disco de Plácido, permitió que se detectara la
enfermedad en sus fases iniciales, evitándose así un deterioro innecesario de
la córnea, antes de llegar al diagnóstico.
Figura 0.9: Imagen topográfica de un caso de queratocono.

INTRODUCCIÓN
41
Los sistemas iniciales eran sistemas de reflexión. Se basaban en la
computerización de las imágenes anulares de un disco de Plácido, reflejadas
por la córnea, proporcionadas por un aparato llamado videoqueratógrafo. Se
obtenían unos mapas fáciles de interpretar visualmente que reproducían
fielmente las irregularidades de la superficie corneal.
Posteriormente han surgido los topógrafos de proyección o tomógrafos que
incluyen medición directa de las superficies anterior y posterior junto con la
paquimetría corneal. Entre ellos ha destacado el Orbscan (Bausch & Lomb,
Rochester, NY, USA), que combina un corte óptico de hendidura que se
proyecta sobre la córnea, con un sistema de reflexión de tipo Plácido, y por
último el Pentacam (Oculus Optikgerate, Wetzlar, Alemania).
0.1.7.2 Clasificación topográfica del queratocono.
El manejo del queratocono depende del grado de la enfermedad el cual
puede determinarse utilizando diversas clasificaciones. No hay consenso
actualmente sobre cual pudiera ser una clasificación idónea del grado de
evolución del queratocono (Gomes et al., 2015), por lo que aquí se expone la
de Rabinowitz de 2013 (Hafezi y Randleman, 2013), que es sencilla y práctica.
Esta clasificación considera 5 estadíos evolutivos en el queratocono
ordenados de menor a mayor gravedad y facilita el establecimiento de la
indicación terapéutica (Tabla 0.1).
Estadío 1: Sospecha de queratocono
• Abombamiento excéntrico inferior de la córnea como único signo.
Estadío 2: Queratocono frustre
• Topografía sugestiva de queratocono, pero que no alcanza a cumplir
los criterios de Rabinowitz.

INTRODUCCIÓN
42
Estadío 3: Queratocono incipiente
• Queratometría central menor de 50 D.
• Sombras en tijera en retinoscopía.
• Topografía con lazo asimétrico
Estadío 4: Queratocono moderado
• Refracción difícil.
• Queratometría central menor de 57 D.
• Signos clínicos (Munson, Charleux, Rizzutti).
• Topografía evidente de queratocono.
Estadío 5: Queratocono avanzado
• Refracción imposible
• Queratometría central mayor de 57 D.
• Cicatrices en el ápex corneal.
Tabla 0.1: Indicación quirúrgica según el estadío evolutivo del
queratocono.
Estadíos 2 y 3. CXL
Estadíos 3 y 4. Anillos intracorneales con o sin CXL.
Estadío 5 Queratoplastia.

INTRODUCCIÓN
43
0.1.8 Tratamiento
0.1.8.1 Gafas
El defecto refractivo que provoca el queratocono, puede ser corregido
satisfactoriamente mediante gafas en los estadíos iniciales de la enfermedad.
0.1.8.2 Lentes de contacto
A medida que el proceso avanza los cambios progresivos en el perfil corneal
y el astigmatismo irregular resultante, hacen imprescindible el uso de lentes
de contacto. En un primer momento, las lentes tóricas blandas de hidrogel o
silicona, pueden neutralizar el defecto suficientemente y proporcionar una
buena visión. Más adelante, se requieren lentes rígidas permeables al gas de
diseño especial, que proporcionan una excelente visión al neutralizar por
completo el astigmatismo irregular de la córnea, aunque su adaptación a
veces es muy difícil. Se puede emplear el ajuste apical (Fig. 0.10), ajuste en
tres puntos (Fig. 0.11) y geometría inversa entre otros.
Figura 0.10: Ajuste apical.
(Imagen cedida por el Dr. Imanol Recalde).

INTRODUCCIÓN
44
Los casos más avanzados, pueden requerir lentes de apoyo escleral, lentes
híbridas (blandas en la periferia y rígidas en el centro) o el piggy-back (Fig. 12)
en el que una lente rígida se apoya sobre una hidrófila resultando de ello un
porte confortable de la lente.
Figura 0.11: Ajuste en tres puntos.
Figura 0.12: Piggy-back. Colocación de una lente rígida
permeable al gas sobre una lente de contacto hidrófila.

INTRODUCCIÓN
45
0.1.8.3 Implantación de anillos intracorneales
Inicialmente se diseñaron para corregir la miopía, siendo una técnica de
adición, no de sustracción de tejido como en la cirugía con láser de excímero.
Hoy día se emplean para mejorar la tolerancia a las lentes de contacto en
casos de queratocono moderado.
Existen varios tipos de anillos intracorneales como Intacs (Addition
Technologies, Sunnyvale, EEUU) y los anillos de Ferrara (Mediphacos, Belo
Horizonte, Brasil). Son segmentos circulares fabricados con un material inerte
como polimetil metacrilato y diversos polímeros acrílicos.
Es condición indispensable que el cuadro no haya progresado recientemente,
la ausencia de cicatrización corneal en la zona del ápex y una paquimetría
mínima de 450 μm en el lugar de implantación. Se insertan profundamente
en el estroma, en la unión entre los dos tercios anteriores y el tercio posterior.
Previamente hay que crear unos canales, bien mecánicamente o con láser de
femtosegundo. Los resultados visuales son a veces bastante impredecibles y
el espectro en el que estos dispositivos son útiles es limitado. La visión puede
Fig 0.13: Anillos intracorneales.
(Imagen cedida por el Dr. Duran de la Colina).

INTRODUCCIÓN
46
no mejorar gran cosa en casos incipientes o en aquellos que ya toleraban bien
las lentillas. Como posibles complicaciones citaremos perforación, erosión,
infección, haze corneal, neovascularización, melting corneal y pérdida de
agudeza visual.
0.1.8.4 Queratoplastia lamelar profunda (DALK).
Consiste en reemplazar únicamente el estroma y las capas anteriores de la
córnea, respetando el endotelio y estroma profundo (Fig. 0.14).
Existen dos técnicas quirúrgicas de DALK:
• Técnica de Melles, disección manual con espátula. (Fig. 0.15)
• Técnica de la burbuja (Big Bubble) de Mohamed Anwar. (Fig 0.16)
La técnica que domina por numerosas ventajas es la Big Bubble ya que acelera
los tiempos de la cirugía, permite liberar la membrana de Descemet de todas
las adherencias estromales y se permite una agudeza visual comparable a la
queratoplastia penetrante.
La queratoplastía anterior lamelar profunda (DALK), presenta ciertas ventajas
sobre la queratoplastia penetrante. Conserva la membrana de Descemet y el
Fig. 0.14 Esquema de una queratoplastia lamelar profunda (DALK).
(Imagen tomada de orlandoeyeinstitute.com)

INTRODUCCIÓN
47
endotelio del propio paciente, por lo que no hay rechazo endotelial, que es la
principal causa de fracaso del trasplante completo de todas las capas de la
córnea. Al no haber riesgo de rechazo endotelial, se utilizan menos
corticoides, lo que reduce la incidencia postoperatoria de cataratas y
glaucoma. La técnica DALK permite utilizar corneas conservadas que vienen
ya precortadas pues no se necesita el endotelio para la cirugía (Fig. 0.17).
Fig. 0.16. Técnica “Big Bubble”: a) disección de plano predescemético con burbuja de
aire, b) excisión y extracción del estroma corneal, c) los detalles del iris, se
transparentan a través de la capa de Descemet.
Fig. 0.15. Técnica manual de disección de Melles.

INTRODUCCIÓN
48
0.8.1.5 Queratoplastia penetrante
Cuando las lentes de contacto no se pueden tolerar o el paciente es incapaz
de manejarlas, la alternativa durante varias décadas ha sido la queratoplastia
penetrante que proporciona muy buenos resultados. La supervivencia del
transplante es de 18 años de media con buenos resultados visuales y bajas
tasas de complicaciones. Los segundos transplantes en un mismo ojo, tienen
una media de supervivencia de más de 12 años.
0.1.8.6 Cross-Linking (CXL)
Esta técnica quirúrgica se desarrollará extensamente en el siguiente apartado
Fig 0.17: Queratoplastia lamelar (DALK).
(Imagen cedida por el Dr Duran de la Colina).

INTRODUCCIÓN
49
0.1.8.7 Corneoplástica (cirugías combinadas)
Una vez que hemos conseguido estabilizar el queratocono realizando un
tratamiento de cross-linking, pensamos en obtener la mejor visión posible del
ojo tratado. En muchos casos una buena adaptación de lentes de contacto
resuelve este problema muy satisfactoriamente. A veces, sin embargo, los
pacientes rechazan depender de las lentillas. Aquí es donde surge un
apasionante campo en el que debemos aplicar todo nuestro saber y
experiencia para mejorar por medios quirúrgicos, la visión de ojos altamente
deteriorados.
1. CXL con adición de anillos corneales
Una combinación terapéutica cada vez más usual es la de cross-linking con
anillos corneales. Se produce aquí una evidente sinergia entre las
propiedades de ambas técnicas. Existe cierta discrepancia sobre si es mejor
comenzar implantando los anillos o bien realizar antes cross-linking.
Si la implantación se realiza con técnicas manuales, la cirugía es menos
dificultosa en una córnea no tratada, por ser mucho más blanda. Además el
efecto modelador de la cirugía sobre la córnea, sería algo mayor. Sin embargo,
si se dispone de un láser de Femtosegundo, la tunelización del tejido corneal
es mucho más precisa cuando se realiza sobre una córnea previamente
endurecida por el cross-linking.
La realización simultánea de ambos tratamientos no se recomienda, pues el
efecto aplanador del cross-linking sobre la córnea se prolonga durante casi
dos años, por lo que resultaría difícil ajustar el tratamiento desde un punto
de vista refractivo (aunque podría programarse una hipocorrección).

INTRODUCCIÓN
50
2. El Protocolo de Atenas
Se están realizando en distintos centros, cada vez con más frecuencia,
tratamientos combinados de cross-linking con ablaciones superficiales
customizadas con láser excímero (PARK-P). Es lo que se ha denominado el
Protocolo de Atenas. Consiste en realizar una ablación personalizada con
láser de excímero, guiada por aberrometría y, a continuación, realizar el
cross-linking para estabilizar la córnea y fijar los resultados refractivos.
Se comienza realizando la aberrometría cuyos resultados son plasmados por
el láser excímero sobre la córnea. Inmediatamente después se procede a
realizar el cross-linking, siguiendo los parámetros habituales. El
endurecimiento corneal y la estabilización subsiguiente, fijaría los resultados
de la cirugía (Kanellopoulos et al., 2015)
0.2 Cross-linking corneal con radiación UVA y riboflavina
Crosslink es una expresión inglesa que significa entrelazar, interconectar. En
el ámbito científico, se emplea para designar actuaciones destinadas a
remodelar la estructura intima de los materiales a nivel molecular.
En la industria, cross-linking se emplea para alterar alguna característica de
un material cualquiera (dureza, rigidez, o resistencia al calor). Es un
procedimiento utilizado habitualmente en la fabricación de polímeros.
En el ámbito médico, esta técnica es conocida desde hace tiempo (composites
en odontología, prótesis valbulares cardiacas).
En oftalmología CXL se emplea desde hace relativamente poco tiempo para
endurecer la córnea cuando esta está reblandecida y deformada por
diferentes motivos (Wollensak et al., 2003). Esta técnica hace que las fibras
de colágeno corneal se entrelacen, formando una trama más tupida y
aumentando la resistencia corneal por un factor de tres. Se consigue así, en

INTRODUCCIÓN
51
la mayor parte de los casos, detener la progresión de enfermedades como el
queratocono, la degeneración pelúcida marginal de la córnea y las ectasias
iatrogénicas que a veces se producen tras las operaciones de cirugía refractiva
con láser de excímero (Raiskup et al., 2013).
El crosslinking representa un enfoque terapéutico novedoso de las patologías
ectásicas corneales. Lejos de afanarse en apuntalar un tejido alterado, su
acción se dirige al origen del problema; la falta de rigidez de la córnea a nivel
estructural. El empleo de esta técnica es cada vez más frecuente a nivel
mundial. El interés que despierta en la comunidad científica es creciente,
como se desprende de una simple consulta en Pubmed, donde se observa el
aumento exponencial de los artículos publicados sobre este tema en los
últimos años. Sólo en Europa hay ya más de 300 centros que practican esta
modalidad de tratamiento.
0.2.1 Mecanismo de acción: efecto cross-linking
El estroma corneal debe combinar la rigidez necesaria para formar la cubierta
anterior del ojo, con la transparencia imprescindible para permitir el paso de
la luz. El elemento fundamental que confiere a la córnea estas características,
es el colágeno. Este, lejos de ser una única proteína, es más bien un grupo de
moléculas estrechamente relacionadas, que difieren en distintos aspectos. El
colágeno tipo I es el constituyente principal del estroma, aunque también
están presentes los tipos III, V, VI y XX. Es sintetizado en los ribosomas y el
retículo endoplásmico de los queratocitos donde series de aminoácidos se
ensamblan formando cadenas α muy ricas en lisina y en glicina. Estas cadenas
α se ensamblan de tres en tres para formar una molécula de procolágeno que
será posteriormente secretada al espacio extracelular. En el espacio
extracelular, en un proceso llamado fibrogénesis, se produce la maduración y

INTRODUCCIÓN
52
alineación de las fibras. Se forma así el colágeno ya maduro o tropocolágeno,
que adquiere la forma de triple hélice y cuyas fibras se mantienen unidas por
medio de puentes de hidrógeno. Además, los tropocolágenos se unen entre
sí por medio de enlaces entre algunos aminoácidos como la lisina llamados
crosslinks que favorecen su consolidación (Oxlund et al., 1985).
Cross-Linking enzimático
El entrelazamiento de las fibras de colágeno, se produce de modo natural
mediante una enzima llamada lisil-oxidasa, que crea enlaces covalentes entre
las moléculas de colágeno a medida que se van formando. Esto proporciona
a la córnea sus características específicas de firmeza, estabilidad y elasticidad.
A este fenómeno, totalmente fisiológico, se le conoce como cross-linking
enzimático (Dudakova et al., 2012).
En el síndrome de Ehlers-Danlos, en la osteogénesis imperfecta y en el
escorbuto, hay falta de lisil-oxidasa lo que conlleva una formación inadecuada
del colágeno (Dudakova et al., 2013).
Métodos no enzimáticos
El efecto cross-linking puede producirse además por agentes químicos como
el glutaraldehido, formaldehído y nitroalcoholes, que se utilizan sobre todo
en ingeniería de tejidos.
Los productos avanzados de la glicación (glucoaldehidos), son muy
abundantes en la diabetes mellitus y dan lugar a un aumento de las uniones
entre las fibras de colágeno, lo que explica que el queratocono no progrese
en los diabéticos (Sady et al., 1995).

INTRODUCCIÓN
53
Procesos foto-oxidativos: Reacción fotodinámica
La reacción físico-química que está en la base del efecto cross-linking
empleado en oftalmología, es la reacción fotodinamica. Se basa en la acción
de la luz ultravioleta de 365 nanómetros (nm) que incide sobre un
fotosensitivizador en este caso la riboflavina (vitamina B2). Esta molécula al
ser excitada por la luz se desestabiliza y libera energía provocando cambios
en su entorno (Wollensak et al., 2003; Raiskup et al., 2013) (Fig. 0.18 y 0.19).
Se forman singletes de oxígeno (1
O2), que interaccionan con las moléculas
circundantes (sobre todo colágeno tipo I) e inducen la formación de enlaces
covalentes a nivel intra e interfibrilar. A este proceso se le llama
fotopolimerización. Se refuerza de este modo la trama que ya de por sí
forman las fibras de colágeno (Mc Quaid et al., 2013).
Figura 0.18. Efecto cross-linking: potencia el entrecruzamiento de
las fibras de colágeno corneal.
(Tomada Keratomania.com).

INTRODUCCIÓN
54
Hay dos posibles vías para la reacción fotodinámica (Fig. 0.20) en función de
la disponibilidad de oxígeno.
a) La reacción tipo 1, que se produce en ausencia de oxígeno y es una
vía lenta.
b) La reacción tipo 2, más rápida, requiere la presencia de oxígeno.
En el cross-linking con UVA/riboflavina coexisten ambas vías, y en función de
la concentración de oxígeno, se potencia una u otra (Mc Call 2010).
Con objeto de maximizar la utilización de la vía rápida, que es más efectiva se
han desarrollado sistemas de irradiación UVA con luz pulsada. Estos al irradiar
intermitentemente, permiten que el aporte de oxigeno no sea agotado por la
radiación UVA y se potencie la vía rápida. Un ejemplo de este procedimiento
Figura 0.19. La incidencia de la luz UVA sobre la riboflavina
desencadena la formación de especies reactivas de oxígeno que
inducen la formación de enlaces covalentes. Estos atraen y unen
entre sí a las fibras de colágeno, reforzando la trama del colágeno
corneal y potenciando la rigidez corneal por un factor de tres.
(Tomada de www.klinikum uni-heidelberg.de)

INTRODUCCIÓN
55
acelerado con luz pulsada, que ha sido utilizado por nosotros en este estudio,
es el KXL System, (Avedro, Waltham, EEUU).
Figura 0.20. Vías rápida y lenta de la reacción fotodinámica o fotopolimerización.
(Imagen propia)
Riboflavina
Los radicales de oxígenolibres inducen
la formación de enlaces covalentes
Reacciona con
el colágeno
Reacción Tipo II
Reacciona con
el oxígeno
Reacción Tipo I
UVA
Superóxido O2-
Singlete 1O2
VÍA RÁPIDA
AEROBIA
VÍA LENTA
ANAEROBIA
TRIPLETE
(Riboflavina activada)
Superóxido O2-

INTRODUCCIÓN
56
0.2.2 Indicaciones.
El queratocono y la degeneración pelúcida marginal de la córnea son las
principales indicaciones de CXL. En el caso del queratocono, los estadios 3 y 4
de la clasificación de 2014 de Rabinowitz (Tabla 1), proporcionan los mejores
resultados con esta técnica. El estadio 4 a veces requiere implantación
adicional de anillos corneales, y el estadio 5 suele ser por lo general indicación
de queratoplastia en cualquiera de sus formas. La edad de los pacientes es un
importante dato, ya que la evolución natural del queratocono es muy rápida
en los jóvenes. Hay que tratarlos sin demora, sobre todo si se trata de un
cuadro evolutivo.
La ectasia iatrogénica post-Lasik es otra indicación clara de cross-linking
corneal con radiación UVA y riboflavina.
En queratitis infecciosas bacterianas y fúngicas, se han producido efectos
positivos tras el CXL. Se cree que se debe a un doble mecanismo; por una
parte el endurecimiento corneal dificulta la digestión enzimatica del estroma
por los agentes patógenos, y por otra, existe una acción directa de la radiación
UVA-riboflavina que actúa sobre el ADN de los gérmenes y los destruye. Este
efecto antimicrobiano se conoce como fotoquimioterapia y es un efecto
colateral del cross-linking independiente de la fotopolimerizacion.
Finalmente, el edema corneal que se produce en la queratopatia bullosa y en
la distrofia endotelial de Fuchs, puede mejorar con cross-linking, pues el
afianzamiento del retículo de colageno dificultaría la acumulación de fluido y
mejoraría la transparencia corneal.

INTRODUCCIÓN
57
0.2.3 Técnica quirúrgica
0.2.3.1 El Protocolo de Dresde
El Protocolo de Dresde, en cuya Universidad se hizo el trabajo pionero de
investigación, es la técnica quirúrgica clásica de referencia, pues está
ampliamente documentada en cuanto a resultados y complicaciones a medio-
largo plazo (Wollensak et al., 2003; Raiskup et al., 2013). Consiste en
desepitelizar la córnea y aplicar una solución de Riboflavina al 0,1% cada 5
minutos durante media hora. Se comprueba la presencia de Riboflavina en
cámara anterior por biomicroscopia (se observa una ligera turbidez
amarillenta en el humor acuoso con luz ultravioleta). A continuación se irradia
la córnea con luz UVA de 360 nm durante 30 minutos, 6 aplicaciones de 5
minutos cada una). Durante este tiempo se sigue instilando la solución de
Riboflavina cada 5 minutos. Se termina la intervención colocando una lente
de contacto (efecto vendaje), en tanto no se produzca la reepitelizacion
corneal que suele demorarse alrededor de 4 o 5 días. En el postoperatorio se
emplea cobertura antibiótica y corticoidea tópica en pauta descendente
durante un mes.
0.2.3.2 Otras técnicas quirúrgicas
La intervención en su forma original, se prolonga más de una hora, por lo que
los intentos de reducir el tiempo quirúrgico están al orden del día.
Por otro lado existen cuestiones relacionadas con el grosor corneal, pues se
requieren unos mínimos para que la intervención se realice con garantías de
seguridad. Esto ha provocado una comprensible inquietud y se han planteado
múltiples alternativas quirúrgicas al protocolo original de Dresde. Todas ellas
pretenden mejorar algún aspecto de la cirugía y sin duda suponen un gran
impulso para esta técnica que cuenta cada día con más aceptación; pero hay

INTRODUCCIÓN
58
que recalcar que, a día de hoy, no tenemos constancia de su inocuidad,
eficacia ni estabilidad, por lo que deben ser aplicadas con precaución (Kling
et al., 2017).
1. Cross-Linking transepitelial (Técnica Epi-on).
Se puede realizar el tratamiento sin necesidad de desepitelizar la córnea
(técnica Epi-on) aplicando los mismos parámetros de fluencia de radiación
UVA, tiempo de exposición etc. Sólo variaría la formulación de la riboflavina.
Los principales inconvenientes del protocolo quirúrgico convencional, que
incluye la desepitelizacion de la córnea y la aplicación de una lente de
contacto terapéutica tras la cirugía, son las molestias que experimenta el
paciente durante los primeros días y la eventualidad, remota pero siempre
real, de que una córnea desprovista de epitelio sufra una infección
potencialmente devastadora en el postoperatorio precoz.
Esto hace que el concepto de realizar el tratamiento sin recurrir a la
desepitelización resulte sugestivo y, en este sentido, se han realizado diversos
esfuerzos en los últimos tiempos, tratando de desarrollar protocolos
quirúrgicos igualmente eficaces aunque menos invasivos.
Ya se ha comentado que para que se produzca la reacción fotodinámica que
está en la base del efecto cross-linking, se necesita un fotosensibilizador
(riboflavina), radiación UVA, y oxígeno. Pues bien, el epitelio corneal
representa una barrera que se opone eficazmente al paso de estos tres
elementos al interior del tejido corneal (Mastropasqua et al., 2015).
La riboflavina es una molécula hidrófila, mientras que el epitelio corneal es
hidrófobo, lo que dificulta extraordinariamente el paso de esta sustancia.
Se sabe que los anclajes de las células del epitelio corneal se relajan en
presencia de ciertas sustancias químicas. Se han empleado varios elementos

INTRODUCCIÓN
59
para inducir esta laxitud epitelial. El más conocido es el cloruro de
benzalconio que forma parte del excipiente de numerosos fármacos. También
se han empleado agentes quelantes como el ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA) y la oxibuprocaína en diversas formulaciones. La unión íntercelular se
haría más laxa lo que permitiría a la riboflavina y al oxígeno acceder al
estroma corneal con más facilidad.
Como inconveniente principal de la técnica Epi-on, cabría señalar la menor
impregnación corneal con la riboflavina, a pesar de las medidas correctoras
anteriormente señaladas, pues el epitelio no permite el paso de esta
sustancia con facilidad. El resultado es que el efecto cross-linking así obtenido
equivale a un 20% del que se conseguiría con la modalidad original o técnica
Epi- off (Koppen et al., 2012).
Esta diferencia se ha podido comprobar mediante microscopía confocal. Se
ha constatado que la línea de demarcación que refleja los cambios
estructurales desencadenados por el cross-linking transepitelial, alcanza las
100 mµ de profundidad. En el protocolo quirúrgico original (técnica Epi-off)
se alcanzan 340 mµ lo que convierte a este último en un procedimiento
claramente más efectivo (Wollensak et al., 2003).
Los que preconizan esta nueva forma de tratamiento aseguran que el efecto
conseguido es suficiente para contener la evolución de la ectasia corneal.
Aunque de momento no existen datos concluyentes, a medio y largo plazo,
es más que probable que esta modalidad de tratamiento tenga sus
indicaciones en aquellos casos en los que la consecución de un aumento
importante de la rigidez, no sea una prioridad. Se podría decir que el
procedimiento Epi-on es el futuro, pero este futuro no ha llegado aún.
2. Iontoforesis

INTRODUCCIÓN
60
La iontoforesis es una forma de transporte activo que se basa en el uso de la
corriente galvánica para incrementar la penetración de una sustancia
ionizable a través de un tejido o membrana. La riboflavina es una sustancia
adecuada para realizar esta técnica, debido a que tiene un bajo peso
molecular, presenta polaridad eléctrica negativa con pH fisiológico y es
altamente soluble en agua.
Se coloca un polo eléctrico en la frente del paciente y el opuesto se sitúa en
un dispositivo que contiene la riboflavina, y que se aplica sobre la córnea.
Aplicando una carga de 1.0 mA/cm2
, se acelera el paso de la riboflavina a
través del epitelio corneal, de tal forma que la impregnación del estroma se
produce en solo 5 minutos en vez de los 30 habituales. Al no ser necesario
retirar el epitelio sería un complemento valioso para la técnica Epi-on.
Estudios preliminares realizados con irradiación de 10 mW/cm2 durante 9
minutos, muestran que se produce el efecto cross-linking. De hecho se han
objetivado por microscopía confocal, cambios en el estroma hasta una
profundidad de 200 µm (frente a 350 µm con la epi-off). Se podría realizar el
tratamiento completo en un tiempo de unos 15 minutos (Vinciguerra et al.,
2014).
Estos nuevos protocolos carecen de momento del respaldo de una
concienzuda investigación y seguimiento, que si tienen los protocolos
originales (Kling et al., 2017).
3. Cross-Linking acelerado.
Con el objeto de reducir el tiempo quirúrgico, se han planteado
modificaciones de la intensidad y duración de la radiación UVA. El objetivo
sería llegar a un tiempo total de tratamiento en torno a 20 minutos. El
protocolo original establece como norma una irradiación de 3mW/cm2

INTRODUCCIÓN
61
durante 30 minutos (Wollensak et al., 2003). Si sumamos el tiempo necesario
para impregnar la córnea de riboflavina, la cirugía dura más de una hora.
La tendencia actual es acelerar el proceso y para ello se están empleando
irradiaciones con intensidades crecientes y tiempos de exposición
menguantes; por ejemplo 9 mW/cm2 durante 10 minutos en el sistema VEGA
(BON Optik Vertriebsgesellschaft.mbH, Lübeck, Alemania).
En la investigación básica original realizada en Dresde, se había determinado
que una irradiación UVA de 5,4 J/cm2 en total era inocua para el endotelio y
el resto de estructuras oculares. Según la ley de reciprocidad de Bunsen-
Roscoe, se pueden variar los tiempos de irradiación y la fluencia de la luz UVA,
ajustándolos de manera que la energía total administrada sea la misma (5,4
J/cm2), sin que la seguridad del tratamiento se resienta; eso, si, siempre
Fig 0.21: Cross-Linking acelerado con luz pulsada.
(Imagen propia)

INTRODUCCIÓN
62
dentro de ciertos límites (Raiskup et al., 2013). Existen aparatos comerciales
que irradian a 18 mW/cm2 administrando la dosis total de irradiación en 5
minutos, e incluso se llegan a postular 30 mW durante 3 minutos.
El sistema KXL empleado por nosotros en este estudio, es una modalidad de
CXL acelerado. Se basa en un aumento de la intensidad de la irradiación UVA
(pasa de 3 a 30 mw) y una reducción simultánea del tiempo de exposición
(baja de 30 minutos a 4). La energía total administrada es de 7,2 julios/cm2
,
algo mayor que en el sistema standard o protocolo de Dresde es en el que se
libera una energía de sólo 5,4 julios/cm2
.
Dentro del CXL acelerado hay una modalidad en la que la irradiación se
administra en forma de luz pulsada (1 sg on / 1 sg off) (Fig. 0.21).
El sistema KXL acelerado con luz pulsada permite que el oxígeno atmosférico
no sea totalmente eliminado por la radiación UVA y con ello se potencia la
reacción fotodinámica tipo II que es más efectiva para formar los enlaces
covalentes entre las fibras de colágeno que están en la base del efecto CXL.
Esta circunstancia hace que el tratamiento con luz pulsada sea más efectivo
que si empleásemos una irradiación con luz continua.
4. CXL en córneas muy adelgazadas.
Se considera que 400 micras es el grosor corneal mínimo que permite realizar
el tratamiento de cross-linking sin dañar el endotelio y otras estructuras
intraoculares como el cristalino y la mácula. Cuando la córnea es demasiado
delgada, se incrementa la paquimetría corneal impregnándola en una
solución hipotónica de riboflavina. Se provoca así un aumento del grosor de
más de 100 micras lo que usualmente permite proceder al tratamiento sin
problemas (Krueger et al., 2007).

INTRODUCCIÓN
63
En algunos casos de ectasias con corneas extremadamente finas, hemos
aplicado sobre la córnea desepitelizada una lente de contacto hidrófila, lo que
nos proporciona de inmediato una paquimetría extra de 120 micras (Fig. 0.22).
A continuación hemos realizado el protocolo quirúrgico usual. Los resultados
obtenidos en 5 casos muestran ausencia de complicaciones junto a una
razonable estabilidad (comunicación personal, ESCRS Milan, 2012).
Figura 0.22. Incremento de la paquimetría corneal con
lente hidrófila impregnada de riboflavina.
(Imagen propia)

INTRODUCCIÓN
64
0.2.4 Complicaciones
El CXL es por lo general una intervención segura y mínimamente invasiva
(Spoerl et al., 2006; Koller et al., 2009; Koppen et al., 2009), aunque están
descritas complicaciones como el haze corneal, que es una opacificación
difusa subepitelial de la córnea. Puede ser de aparición precoz o tardía y
responde bien a los corticoides tópicos.
La infección es sin duda la complicación más temible. Se han descrito
infecciones postoperatorias causadas por bacterias, virus y hongos, incluso
un caso de queratitis por Acanthamoeba con perforación corneal (Rama et al.,
2009).
0.3 Biomarcadores
Según el diccionario de la Real Academia de la Lengua un marcador biológico
es toda sustancia detectable con cierta facilidad, que permite identificar
procesos físicos, químicos o biológicos. En biomedicina nos referimos a ellos
como las moléculas que podemos determinar en los tejidos y fluidos
corporales mediante técnicas de laboratorio y que, según sus características,
función y disponibilidad, nos facilitan el diagnóstico y el pronóstico de los
procesos nosológicos.
Los marcadores biológicos son especialmente importantes en cancerología
(marcadores tumorales), pero se emplean habitualmente como índices de
salud y asesoramiento fisiológico. Permiten evaluar el riesgo de enfermedad,
exposición ambiental, abuso de sustancias, embarazo, procesos metabólicos
y diagnóstico de enfermedades en general. Los nuevos descubrimientos en
genómica y proteómica permiten augurar avances significativos en este
campo.

INTRODUCCIÓN
65
Aunque marcadores como la glucemia en diabéticos o la creatinina sérica en
alteraciones de la función renal se utilizan corrientemente, los intentos de
emplear nuevos marcadores en la práctica clínica habitual no son
suficientemente satisfacorios. No hay una correspondencia entre el esfuerzo
dedicado al descubrimiento de nuevos biomarcadores y el número de los que
son utilizados habitualmente en la práctica (Diamandis et al., 2014).
Idealmente, un biomarcador debe predecir correctamente los resultados
clínicos, es decir, debería proporcionar una medida directa de lo que el
paciente experimenta, o del funcionamiento de un órgano o sistema.
En la clasificación sugerida por la FDA, los biomarcadores se dividen en varias
categorías: de exploración, de demostración, de caracterización y de
sustitución. Sólo biomarcadores completamente caracterizados que han
predicho repetidamente resultados relevantes a través de una variedad de
tratamientos y poblaciones se consideran de punto final o sustitutivos
(Strimbu et al., 2010). Como ejemplos de criterios de valoración sustitutivos
pueden incluirse nivel de colesterol, carga de VIH y presión arterial (Firestein
et al., 2006).
Recientes desarrollos en proteómica y espectrometría de masas han tenido
un impacto marcado en la comprensión actual de las vías metabólicas,
actividades, estructuras, proteínas e interacciones (Cravatt et al., 2007). Se
han utilizado enfoques proteómicos para un extenso catálogo de proteínas,
sentando las bases para el análisis exhaustivo del proteoma humano en la
lágrima (Aass et al., 2015; Zhou et al., 2012). El uso de la película lagrimal para
el descubrimiento de biomarcadores utilizando enfoques proteómicos ha
sido cubierto en algunas revisiones recientes que reflejan el alcance de los
esfuerzos de investigación en este campo (von Thun und Hohenstein-Blaul et

INTRODUCCIÓN
66
al., 2013; Pieragostino et al., 2015). Sin embargo, a pesar del potencial del
líquido lagrimal como fuente de muestras no invasivas, su contenido de
proteínas y péptidos no es completamente conocido.
0.3.1 Biomarcadores en el queratocono
En el queratocono se han postulado diferentes biomarcadores de la
enfermedad.
0.3.1.1 Biomarcadores en córnea
En córnea los estudios se han enfocado principalmente en marcadores
relacionados con la síntesis y degradación del colágeno, como la
desregulación de lisil oxidasa (LOX), colágeno I alfa 1 (COLIA1) y colágeno IV
alfa 1 (COLIVA1). También en la elevada expresión de MMP-9 (Shetty et al.,
2015). Se observó una relación entre la expresión de colágeno y la severidad
clínica del queratocono, indicando su implicación en la deformidad
estructural de la córnea queratocónica. Estos marcadores también se
asociaron con elevación de la citoquina inflamatoria IL-6 en el epitelio corneal
y en las lágrimas de los pacientes con queratocono (Tabla 0.2).
Además cultivos celulares de queratocitos humanos estimulados con factor
transformante de crecimiento ß (TGF ß I-III) mostraron desregulación de
SMAD6 y SMAD7, indicando alteración del TGF ß en la progresión del
queratocono (Priyadarsini et al., 2015).
Asimismo, una reducción significativa de alcohol deshidrogenasa clase 1 beta
(ADH1B) en fibroblastos corneales queratocónicos cultivados sugirió su
posible papel en el queratocono (Mootha et al., 2009).
En el queratocono el epitelio corneal sobreexpresa la gelsolina (GSN), alfa
enolasa (ENOA), S100A4 y citoqueratina-3 (KRT3), lo que sugiere un papel

INTRODUCCIÓN
67
plausible de estas proteínas en la patogénesis del queratocono (Nielsen et al.,
2006).
Todas estas moléculas pueden actuar como biomarcadores pronósticos o
diagnósticos y podrían ayudar en el tratamiento de la enfermedad
0.3.1.2 Biomarcadores en lágrima
Las lágrimas son una mezcla biológica compleja que contiene electrolitos,
metabolitos, lípidos, mucinas, moléculas y proteínas. La película lagrimal
tiene varios papeles en la lubricación, la protección contra el ambiente
Tabla 0.2: Biomarcadores en córnea.
Biomarcador Expresión
Lisiloxidasa (LOX) ↓
Colágeno I α 1 (COLIA 1) ↓
Colágeno IV α 1 (COLIVA 1) ↓
MMP-9 ↑
TNF-α ↑
IL-6 ↑
SMAD-6 ↓
SMAD-7
Alcohol dehidrogenasa (ADH 1B)
Gelsolina (GSN)
Alfa enolasa (ENOA)
S100A4
Citoqueratina 3 (KRT-3)
↓
↓
↑
↑
↑
↑
↑ = sobreexpresada
↓ = desregulada

INTRODUCCIÓN
68
externo y la nutrición de la córnea. También participa en la modulación de las
propiedades ópticas del ojo.
Ante la agresión de agentes externos como la luz ultravioleta, polución,
bacterias, alérgenos y agentes químicos, la repuesta de la superficie ocular
consiste, entre otros mecanismos, en la síntesis e inhibición por el epitelio y
células inflamatorias de la superficie ocular de citoquinas, mediadores
lipídicos y MMPs.
La regulación de estos procesos requiere de una producción y un
aclaramiento lagrimal adecuados para diluir la concentración de estos
efectores y mantenerlos en niveles compatibles con la homeostasis corneal.
El uso de lágrimas como una fuente para el descubrimiento de biomarcadores
es un enfoque de una importancia fundamental. La facilidad de la recolección
no invasiva de muestras en el líquido lagrimal (con tiras de Schirmer o la
captación capilar con microtubos de vidrio) lo hacen adecuado con fines
diagnósticos y de pronóstico (Posa et al., 2013).
La composición lagrimal refleja la condición fisiológica de los tejidos
subyacentes. Por lo tanto, el fluido lagrimal es útil en la evaluación de los
estados de salud y enfermedad y es una valiosa fuente de biomarcadores para
el análisis objetivo de enfermedades sistémicas.
El contenido de las lágrimas puede reflejar los estados alterados, no sólo en
trastornos oculares específicos, tales como ojo seco, queratocono, blefaritis
o intolerancia a las lentes de contacto (Acera et al., 2011), sino también en
enfermedades no oftalmológicas, como el cáncer o la esclerosis múltiple
(Bhom et al., 2012; Salvisberg et al., 2014). Lema y Duran (2005) encontraron
que en las lágrimas de los pacientes con queratocono, citoquinas
proinflamatorias tales como IL-6 y TNF-α y la MMP-9 están sobreexpresadas.

INTRODUCCIÓN
69
Además esta sobreexpresión guarda relación con el grado de progresión del
queratocono.
La composición proteica de las lágrimas está alterada en el queratocono
(Tabla 0.3), bien por niveles aumentados de proteasas en las lágrimas, ya que
hay una disminución en la concentración total de proteínas en la lágrima, o
por una disminución en las proteínas con propiedades antiinflamatorias
(Acera et al., 2011).
Tabla 0.3: Biomarcadores en lágrima.
Biomarcador Expresión
TNF-α ↑
MMP-9 ↑
MMPs 1, 3, 7, 13 ↑
IL- 4, 5, 6, 8 ↑
TNF- α, ß ↑
Secreted frizzled-related protein 1 (SFRP 1) ↓
Cistatina S ↓
Lipocalina (LCN) ↑
Prolactin-induced protein (PIP) ↑
Zinc-alpha-2-glicoproteina 1 (AZGP 1) ↓
Lactotransferrin (LTF) ↓
Fosfolipasa A2 ↓
Lipofilina ↓
Lipocalina 1
Mamaglobina B (SCGB2A1)
↑
↑
↑ = sobreexpresada
↓ = Subregulada

INTRODUCCIÓN
70
0.3.2 Biomarcadores analizados en esta tesis.
Hemos analizado en la lágrima de los pacientes incluidos en nuestro estudio
tres biomarcadores implicados en procesos como apoptosis, protección
antimicrobiana o inflamación: metaloproteinasa de matriz 9, calciclina y
cistatina S. Estos biomarcadores están relacionados con la patología de ojo
seco y su evolución post CXL nos permite conocer con mayor profundidad las
posibles variaciones postoperatorias de la superficie ocular en estos
pacientes (Soria et al., 2013).
Hemos elegido estos biomarcadores y no otros, debido a la disponibilidad
técnica que nos ofrece Bioftalmik SL. Esta empresa ha desarrolado una
plataforma de cuantificación basada en la tecnología de microarrays y
dispone de los anticuerpos específicos para los biomarcadores que hemos
estudiado.
0.3.2.1 Metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9).
Las MMP son una familia de endopeptidasas que se caracterizan por tener un
átomo de zinc en su núcleo activo. Incluyen gelatinasas (MMP-2 y 9)
colagenasas (MMP-1, 8 y 13), estromalisinas (MMP-3 y 10) y matrilisinas
(MMP-7 y 26). Han sido descritas más de 20 MMP humanas. Son sintetizadas
por las células del epitelio y estroma corneal (Fini et al 1998). Se secretan
como proenzimas o zimógenos inactivos de 92-kDa y requieren de la inclusión
de un propéptido para su activación.
Estructura
La estructura de las MMP consta de varios dominios. Un péptido señal N-
terminal dirige la secreción de las pro-MMP. Estos proenzimas contienen un
péptido en el que la cisteína forma una unión covalente con el ion zinc, que
se encarga de mantener la pro MMP en su estado latente.

INTRODUCCIÓN
71
Funciones
Las MMP están involucradas en numerosos procesos, tanto fisiológicos:
cicatrización, angiogénesis, ovulación, crecimiento embrionario, como
patológicos: metástasis tumorales, artritis reumatoide, ateroesclerosis o
enfisema pulmonar (Collier et al., 1998) (Tabla 0.4).
Regulación
La regulación de este enzima, depende de distintos mecanismos
favorecedores o inhibidores de su actividad. Así, mientras sus inhibidores
(TIMP), se unen al proenzima y lo inactivan, la MMP-3 convierte al proenzima
en MMP-9 activa mediante la escisión proteolítica del propéptido (Fini et al.,
1990).
En el queratocono, el adelgazamiento y ectasia de la córnea, sugieren una
degradación de la matriz extracelular (ECM). Se ha comunicado (Seppala et
al., 2006) que la córnea de pacientes con queratocono presenta niveles
elevados de proteasas.
La MMP-9 está sobre expresada en la lágrima de los pacientes con
queratocono (Lema y Duran 2005, Lema et al., 2009). La sobre expresión en
lágrima de esta proteína se ha validado también en otras enfermedades
incluyendo queratoconjuntivitis, diabetes mellitus y conjunctivochalasis
(Acera et al., 2008; Lema y Duran 2005; Lema et al., 2009; Leonardi et al.,
2003; Symeonidis et al., 2013).
Por otro lado MMP-9 es un marcador inespecífico de inflamación que ha sido
consistentemente validado en varios estudios (Sobrin et al., 2000; Li et al.,
2001; Ollivier et al., 2007; Chotikavanich et al., 2009; Fan et al., 2012).

INTRODUCCIÓN
72
Todos estos estudios demuestran la falta de especificidad de la MMP-9 para
el diagnóstico de una enfermedad concreta de la superficie ocular, pero
corroboran la eficacia de la proteína en la predicción de alteraciones
inflamatorias.
0.3.2.2 Calciclina (S100A6)
Es una proteína codificada por el gen S100A6, miembro de la familia S100
calcium-binding. Se localiza en citoplasma y el núcleo de gran número de
células. Los genes S100 incluyen al menos 13 miembros localizados en el
cromosoma 1q21.
Tabla 0.4: Metaloproteinasa de matriz. (
Pertenece a la familia de las metaloproteinasas de matriz
Producida por el epitelio corneal.
Es inhibida por la macroglobulina α2 y los inhibidores tisulares
de MMP (TIMP).
MMP-3 se encargaría de la transformación de pro-MMP inactiva
a MMP-9 activa
Juega un papel central en la inflamación, proliferación y
diferenciación celular, apoptisis y angiogénesis.
Presenta actividad colagenasa. Involucrada en la degradación de
la matriz extracelular
Transforma al precursor de la IL-1B en su forma activa.

INTRODUCCIÓN
73
La familia de proteinas S100 consiste en 24 miembros que se distribuyen en
tres grandes grupos: aquellos que ejercen funciones regulatorias a nivel
intracelular, los que tienen efectos de regulación extracelular y finamente los
que tienen ambas funciones (Tabla 0.5).
Intracelularmente, las proteinas S100 regulan la proliferación y diferenciación
celular, apoptosis, metabolismo del calcio, metabolismo energético,
migración e inflamación. Esto lo realizan mediante interacciones con
proteínas y enzimas que regulan las funciones celulares de manera autocrina
y paracrina activando los receptores de superficie.
A nivel extracelular las proteínas S100 ejercen actividades regulatorias sobre
los monocitos, macrófagos, neutrófilos y linfocitos, participando en la
respuesta inmune esencial y adquirida, migración celular y quimiotaxis,
desarrollo y reparación tisular.
Tabla 0.5: Calciclina (S 100A6)
Descripción y funciones
Miembro de la familia S 100 (calcium-binding). Son pequeñas
proteínas acidófilas (10-12 kDa)
Producidas por macrófagos y neutrófilos.
Localizadas en el citoplasma y núcleo de numerosas células
Implicadas en la regulación de la diferenciación celular
Uniformemente expresada en células de la superficie ocular, en
condiciones normales.

INTRODUCCIÓN
74
0.3.2.3 Cistatina S (CST4)
La cistatina S (CST4) es una proteína perteneciente a la familia de las cistatinas.
Comprende gran número de proteínas que contienen el dominio cistatina. En
los humanos se expresa en saliva, lágrima, orina y líquido seminal.
Las cistatinas son inhibidores de las proteasas con dominio cisteína, que son
enzimas que degradan proteínas (Tabla 0.6). Su función es protectora pues
presenta acción antibacteriana y antivírica. La actividad inhibitoria de la
cistatina S es fundamental para la correcta regulación de muchos procesos
fisiológicos, pues limita la acción destructora de proteasas. De hecho la
alteración en los mecanismos biológicos que controlan la actividad de las
proteasas, puede provocar osteoporosis, artritis, cáncer y enfermedades
neurodegenerativas o cardiovasculares.
La concentración en lágrima de CST4 está disminuida en el queratocono. Esto
podría estar relacionado con un aumento de la degradación de las proteínas
Tabla 0.6: Cistatina S (CST4)
Descripción y funciones
Proteina de 14 kDa, perteneciente a la familia de las cistatinas
Muy expresada en saliva, orina y lágrima.
No está directamente relacionada con la inflamación.
Actividad antibacteriana y antiviral.
Actúa como inhibidor de proteasas.

INTRODUCCIÓN
75
de la lágrima y la disminución de la concentración de proteínas en el
queratocono (Acera et al., 2011, Balasubramanian et al., 2013).

JUSTIFICACIÓN
79
1. JUSTIFICACIÓN
La reciente aprobación de CXL por la FDA supone la homologación definitiva
de la técnica CXL para el tratamiento del queratocono. El interés que
despierta este procedimiento en los últimos años es creciente. Para
comprobarlo basta hacer una búsqueda en Pubmed para constatar el
aumento exponencial de los artículos publicados sobre este tema.
Con la realización de esta Tesis Doctoral nos planteamos valorar la eficacia y
seguridad de la modalidad técnica de CXL que empleamos habitualmente en
nuestra práctica clínica: el CXL acelerado con luz pulsada.
Para ello hemos evaluado la evolución topográfica y funcional de los
pacientes incluidos en el estudio a fin de comprobar si el cross-linking es capaz
de detener la progresión del queratocono sin provocar iatrogenia. Además, la
alterada expresión de marcadores en lágrima característica del queratocono
podría modificarse tras el CXL. Por este motivo hemos estudiado la
concentración de tres biomarcadores relacionados con la alteración de la
superficie ocular (MMP-9, S100A6 y CST4) en la lágrima de los pacientes con
queratocono incluidos en el estudio, para determinar si se modifica tras el
tratamiento con CXL.
La posible regularización tras el CXL de alguno de estos tres marcadores
tendría un efecto aún por determinar en la estabilización corneal a medio y
largo plazo. En este supuesto la estabilización no dependería exclusivamente,
como se supone en la actualidad, del incremento de la rigidez corneal por
reticulación de las fibras de colágeno, fenómeno conocido como “efecto
cross-linking”.

JUSTIFICACIÓN
80
Si se demuestra que la regularización de biomarcadores lagrimales influye en
la estabilización del queratocono, podría abrirse una nueva perspectiva en el
manejo de esta enfermedad, quizás con fármacos antiinflamatorios.
Por otra parte en el tratamiento con CXL manipulamos la superficie ocular. Al
desepitelizar la córnea, destruimos el plexo nervioso subepitelial. Además,
durante la cirugía se producen alteraciones del estroma anterior con
destrucción de queratocitos que no se regeneran hasta transcurridos 6 meses
de la intervención. Todo esto podría tener efectos negativos en la función
lagrimal que a su vez se reflejasen en los parámetros que habitualmente se
utilizan para valorar el estado de la superficie ocular. Por ello hemos
estudiado la función lagrimal de los pacientes con queratocono y los posibles
cambios a corto plazo y a los 12 meses inducidos por el CXL.
Por todo lo expuesto anteriormente, se justifica la realización de esta Tesis
Doctoral

HIPÓTESIS
83
2. HIPÓTESIS
2.1 Hipótesis generalHipótesis generalHipótesis generalHipótesis general
El CXL acelerado con luz pulsada es capaz de detener la progresión del
queratocono.
Hipótesis nula (H1-0):
No hay variación significativa de K máxima.
Hipótesis alternativa (H1-1):
Hay variación significativa (incremento) de K máxima.
2.2 Hipótesis secundariaHipótesis secundariaHipótesis secundariaHipótesis secundaria primeraprimeraprimeraprimera
El CXL acelerado con luz pulsada altera la expresión de biomarcadores en la
lágrima de los pacientes con queratocono a 12 meses.
Hipótesis nula (H2-0)
No hay variación significativa.
Hipótesis alternativa (H2-1)
Hay variación significativa en la expresión de uno o varios
biomarcadores tras la cirugía.
2.3 HHHHipótesis secundariaipótesis secundariaipótesis secundariaipótesis secundaria segundasegundasegundasegunda
El CXL acelerado con luz pulsada produce modificación de la función lagrimal
a 12 meses.
Hipótesis nula (H3-0):
No hay variación significativa.
Hipótesis alternativa (H3-1):
Hay variación significativa de algún parámetro utilizado para evaluar
la superficie ocular.

OBJETIVOS
87
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Conocer las posibles modificaciones funcionales. clínicas y bioquímicas tras
CXL acelerado con luz pulsada en un lapso temporal de 12 meses.
3.2 Objetivos específicos
1. Determinar si el CXL acelerado con luz pulsada detiene la progresión del
queratocono.
2. Determinar la presencia y niveles de concentración de tres
biomarcadores (MMP-9, S100A6 y CST4) relacionados con la patología de
la superficie ocular en la lágrima de los pacientes con queratocono
incluidos en el estudio.
3. Determinar si el CXL acelerado con luz pulsada influye sobre la expresión
de estos biomarcadores a medio y largo plazo.
4. Determinar posibles alteraciones de la función lagrimal tras CXL
acelerado con luz pulsada.

MATERIAL Y MÉTODOS
91
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1 Diseño del estudio.
Se ha realizado seguimiento de la evolución postoperatoria del queratocono
mediante control topográfico y funcional con el fin de constatar la seguridad
y efectividad del tratamiento de cross-linking.
Se han analizado diferentes parámetros clínicos de inflamación de la
superficie ocular para determinar si se produce alteración de la función
lagrimal debido al tratamiento con CXL.
Posteriormente se ha realizado un estudio bioquímico de la lágrima
cuantificando la concentración de 3 biomarcadores, para valorar una posible
variación en la expresión de los mismos tras la intervención quirúrgica.
Finalmente se ha realizado estudio descriptivo y estadístico de los resultados,
buscando algún tipo de correlación entre los datos obtenidos.
4.2 Demografía.
4.2.1 Pacientes.
En el estudio se incluyeron pacientes con queratocono, con indicación
quirúrgica para tratamiento con CXL, debido a evidencia de progresión por
aumento de K max en 1 dioptría durante el último año. También se incluyeron
pacientes con alto riesgo de progresión en casos de queratocono de reciente
aparición en sujetos jóvenes.
4.2.2 Diagnóstico del queratocono
El diagnóstico de queratocono se realizó mediante evaluación topográfica. Se
utilizó Pentacam HR (Oculus Optikgeräte GmbH, Wetzlar, Alemania) (Fig. 4.1).

MATERIAL Y MÉTODOS
92
De acuerdo con los criterios clásicos establecidos por Rabinowitz y McDonnell
(1989), toda córnea con un índice I/S superior a 1,5; queratometría máxima
en el ápex corneal (K max) mayor de 47 D; o una diferencia de más de 1 D
entre el K central de ambos ojos se consideró patológica. Actualmente no
existe consenso sobre cuál pudiera ser la clasificación más adecuada de los
distintos grados de progresión del queratocono (Gomes at al., 2015).
Nosotros optamos por modificar ligeramente la clasificación propuesta en
2013 por Rabinowitz (Hafezi y Randleman, 2013) (Tabla 4.2), según la cual, los
grados 1 y 2 no serían susceptibles de tratamiento con CXL, que se reservaría
para los grados 3, 4 y 5. En nuestro caso, la separación entre los grados
moderado y avanzado, se produjo con una k máxima de 55 D y no de 57 D
como sugiere Rabinowitz.
Figura 4.1: Topógrafo Pentacam HR.

MATERIAL Y MÉTODOS
93
Según el grado evolutivo del queratocono, los pacientes se incluyeron en uno
de tres subgrupos, de acuerdo con los valores queratométricos en el ápex
corneal (K max); leve (< 50 D), moderado (50 a 55 D), y severo (> 55 D). Esta
separación en grupos en función de lo avanzado del proceso, nos permitirá
posteriormente estudiar posibles diferencias en la respuesta al tratamiento.
El criterio básico para determinar la severidad del queratocono y la evolución
post CXL en sentido positivo o negativo fue la queratometría máxima en el
ápex corneal (Kmax). Se valoraron también complementariamente la
queratometría media (Sim K) y paquimetría corneal mínima (PAQ).
4.2.3 Criterios de inclusión / exclusión.
Criterios de inclusión
- Queratocono clínicamente evidente.
- Edad elegible para el estudio: mayor de 18 años.
- Género elegible para el estudio: ambos sexos.
- Consentimiento informado firmado.
Tabla 4.2: Clasificación del queratocono Rabinowitz (2013)
1. SOSPECHA SÓLO ABOMBAMIENTO INFERIOR
2. FRUSTRE NO CUMPLE LOS CRITERIOS DE
RABINOWITZ
3. LEVE K MÁXIMA < 50 DIOPTRÍAS
4. MODERADO K MÁXIMA < 57 DIOPTRÍAS
5. AVANZADO K MÁXIMA > 57 DIOPTRIAS

MATERIAL Y MÉTODOS
94
Criterios de exclusión
- Cirugía ocular (en los últimos 3 meses).
- Medicación sistémica con corticoides o antidepresivos.
- Medicación tópica salvo lágrimas artificiales.
- Cualquier enfermedad sistémica que afecte a la superficie ocular o
cualquier condición o medicación que esté tomando y pueda
interferir en la interpretación de los resultados.
4.3 Intervención quirúrgica
La técnica quirúrgica que hemos empleado para el tratamiento de CXL es la
modalidad con previa desepitelización corneal (Técnica Epi-Off). Tras
desepitelizar la córnea central utilizando un cepillo de Amoils (Amoils
epithelial scrubber, Innovative Excimer Solutions Inc, Toronto, Canada), se
instiló una solución isoosmótica de riboflavina (Vibex Rapid, Avedro Inc,
Waltham, EEUU) cada 2 minutos durante 10 minutos.
Para la emisión de radiación UVA se utilizó el sistema KXL (Avedro Inc,
Waltham, EEUU). El modo de irradiación empleado fue de luz intermitente (1
segundo on / un segundo off de exposición UVA) a 30 mW/cm2 durante 8
minutos, lo que corresponde a una fluencia de 7,2 J/cm2 de energía total
administrada (Fig. 4.2). Finalmente, se colocó una lente de contacto hidrófila
sobre la córnea a modo de vendaje, que fue retirada a los 5–7 días una vez se
hubo completado la reepitelización total de la córnea. Un colirio de
antibiótico y esteroide (TobraDex®, Alcon-Cusi, El Masnou, España) fue
instilado en pauta descendente durante un mes. Durante este período, el ojo
fue humedecido con lágrimas artificiales a demanda.

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