Este documento describe un procedimiento de microbiología de alimentos para aislar e identificar bacterias en una muestra de salchicha. Se realizaron diluciones seriadas de la muestra y recuentos de unidades formadoras de colonias en placas de Petri. También se llevaron a cabo pruebas como el número más probable y técnicas de confirmación para identificar la presencia de coliformes totales y E. coli. Los resultados indicaron la presencia de E. coli en la muestra de salchicha estudiada, aunque en baja concentración

1. MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
MATERIALES:
9 tuboscon caldoverde brillante
Aguapeptonada90 ml
2 tuboscon agua peptonada8 ml
pipetasesteriles
Cajasde Petri
Mortero
Agar plate cound
Muestra de alimento(embutido)
Fotostomadaspor: Ordierez J,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18 de mayodel
2018.
PROCEDIMIENTO
En este caso se trabajo conuna muestrasolida(salchicha),realizandoenprincipiosudebido
pesaje(1gr),

2. Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18 de mayo
del 2018.
La muestratuvoque sermaseradapara su posteriordilución
Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18 de mayodel
2018.
1- Técnicade dilución:
- Se realizaron3 dilucionesenaguapeptonadaesterilparalamuestrasolida,usando
pipetasesterilese independientesparacada dilución:
o Dilución10: se depositoenunErlenmeyercon90 ml de agua peptonada,1gr/ml
de la muestrahomogenizándola.

3. Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18
de mayo del 2018.
o Dilución100: se deposito1ml de lamuestraen 10 enun tubode ensayotapa
rosca con agua peptonadaesteril (cadatubocon9 ml de agua peptonada),
homogenizando
.
Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18
de mayo del 2018.
o Dilución1000: se deposito1ml de la muestra100 en untubo de ensayotapa
rosca con agua peptonadaesteril (cadatubocon9 ml de agua peptonada),
homogenizando.

4. Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18
de mayo del 2018.
2- Técnicade recuentode ufc(unidadesformadorasde coloniasparamesofilos):
Métodode vertidoosiembraporprofundidad.
- Este métodose montopor duplicadoparacada unade lasdiluciones,tomando2cajas de
Petri esterilespordiluciónymarcándolascomocaja A y B de cada dilución.
Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18 de mayo
del 2018.
- Se homogeneizocadadiluciónpreparadaanteriormente.
- Se deposito1 ml (conpipetaesteril independiente pordilución) de lamuestra,enlacaja
de Petri correspondiente.

5. Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18 de mayo
del 2018.
- Se tomó un Erlenmeyerconagar Plate Countlistoparaservir,se atemperoyagregoa cada
caja de Petri.
Fotostomadaspor: OrdierezJ,Montanchez C,GuerreroC, Getial K,Rosales A. 18 de mayo
del 2018.
- Se realizaron homogeneizacionesconmovimientoscircularesoen8.
- Se dejósolidificar.
- La incubaciónse diopor24 – 48 horas a 37°C y se realizólalecturae interpretación,
descartando 5 de las6 cajas de Petri al serincontablesoporno estardentrodel rango
permitido, asípuesenlacaja restante se contabilizaron131 colonias.

6. 3- Técnicanmp (numeromasprobable) paracoliformestotales:
- En este métodose montoportriplicadoparacada dilución,tomando3tuboscon caldo
verde brilaestériles pordiluciónyse marcaroncomo tubo 1, 2 y 3 para cada dilución.
- Se procedió a homogeneizarcadadilución.
- Se depositó 1 ml (conpipetaestéril independiente pordilución),de lamuestra,enlos
tuboscon caldoverde brillacorrespondientes,homogenizando.
Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18 de mayo
del 2018.
- Se incuboenbaño maría a 37 °C por 24 – 48 horas,y se realizólalecturae interpretación,
encontrando todoslostuboscomopositivos,yaque entodosse encontróturbidez,
aunque si ausenciade gas,ya que la campana del tubono ascendió.
4- Técnicade confirmaciónde coliformesfecales:
- Se realizóel montaje paratodoslostuboscon caldo verde brilaque dieronreacción
positivaenel NMP.
- Esto se confirmó mediante 3pruebas,de lasiguiente manera:
o Se realizólasiembraconasa bacteriológicaredondade labacteriadiluida,enun
tubode ensayo estéril concaldoverde brila. Todaslostubosteníanturbidezyla
campana presentógasenella.

7. Dilución: 10 100 1000
Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18
de mayo del 2018.
o Se realizólasiembraconasa bacteriológicaredondade labacteriadiluida,enun
tuboestéril conagua triptona,(pararealizarpruebade indol). Todoslostubos
presentaronturbidez,aloscualesse lesagregóuna gota de reactivode Covack,
resultandonegativas todaslasdiluciones.
Dilución: 10 100 1000

8. Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18
de mayo del 2018.
o Se realizósiembraenagarMacconkey (coloniascremosas,rosadasyredondas) y
EMB (coloniasverde metálicas), paraenterobacterias,porestríasencilla.
Agar Mackonkey Agar EMB

9. Fotostomadaspor: OrdierezJ,MontanchezC,GuerreroC, Getial K,RosalesA. 18
de mayo del 2018.
o Las muestrasse incubaronpor 34 -48 horas a 37 °C, sembrandotodoslostubos
ya que cada uno de ellosresultopositivo, porque entodosse observó turbidez.
RESULTADOS:
- Tanto cajas Petri comotubosde ensayo, se marcaron, incubaronyconservaron
adecuadamente,paraaposteriori obtenerunresultadopositivode ellos.
- UFC (unidadesformadorasde colonias):
DILUCION CAJAS PETRI CONTEO (COLONIAS)
10−1 A Incontables
B 131
10−2 A incontable
B 6
10−3 A INCONTABLE
B 1
Teniendoencuentael rangoenque se puede tomarcomo positivounconteode colonias
(30 – 300), el conteose hizoúnicamente teniendoencuentalacajaB de ladisolución
10−1 .

10. - NMP( NUMERO MAS PROBABLE):
DILUCION TUBOS RESULTADO
10−1 1 1 1 3
10−2 1 1 1 3
10−3 1 1 1 3
Teniendo encuenta3-3-3> 1100 , el índice del NMP con 95% de limite de confianzapara
lascombinacionesde resultadospositivoscuandose usanlos6 tubosanteriores.
Al obtenerresultadospositivosenlatotalidadde lostubosse puede aegurarlapresencia
de coliformes, esperandolaconfirmaciónde E.coli,porparte del restode pruebas.

11. DISCUSION:
Todoslos tubosincubadosarrojaronresultadospositivosal igual que laprueba anteriorpor
turbidezypor producciónde gas ya que lacampana se elevoentodoslostubos.En agua
peptonadase presentoturbidezesdecirpresenciade bacterias,peroal agregarreactivode
covacks el resultadofue negativo,nose presentoel anillorojizocaracterísticoenlasuperficie.
En agar mkconkeyse presentocrecimientode coloniasrosadasyenagarEMB crecimientomuy
leve de coloniascolorverde metalico.
Con estosresultadospodemos deducirque labacteriaque proliferoenlasiembrade estapractica,
fue E.coli , ya que la únicarespuestanegativafue larealizadaconel reactivode covacks,estopudo
deberse aque la concentraciónde estabacteria comose pudoobservarenel crecimientodadoen
agar EMB, fue muybaja.
CONCLUSIONES:
- Se confirmaroncoliformes,yaque laspruebasencaldoverde brilafueronpositivosen
todaslas pruebasrealizadas.
- La bacteriaconla que se trabajoenesta practicafue E.coli.
- Al encontrarcrecimientonosoloenagar EMB, se puede afirmarque nose teniatan solo
un tipode bacteriaenla muestrausada enla practica.
- La pruebade reactivode covacksarrojo resultadosnegativosgraciasala baja
concentraciónde E.coli.
- El alimentousadoparaestapractica SI esapto para su consumo,yaque no se encontróla
suficienteconcentracionde coliformesque puedanafectarala saluddel consumidor.
CUESTIONARIO:
1- La técnicapara ladetecciónde Salmonellaenalimentos, consistede 5 pasosbásicos:
a. Preenriquecimiento,esel pasoendonde lamuestraesenriquecidaenunmedio
nutritivonoselectivo,que permite restaurarlascélulasde Salmonelladañadas,
lograndode estamanerauna condiciónfisiológicaestable.
b. Enriquecimiento selectivo,se lograapartir de un mediode cultivoque conjunte
dos condiciones,porunladodebe incrementarlaspoblacionesde Salmonellay
por otro inhibirotrosmicroorganismospresentesenlamuestra.
c. Selecciónenmediossólidos,estepuntose derivadirectamentedel anterioryse
utilizanmediosselectivos,que restringenel crecimientode otrosgéneros
diferentesaSalmonellayque permitanel reconocimientovisual característicode
coloniassospechosas.
d. Identificaciónbioquímica,este pasopermite laidentificacióngenéricade los
cultivosde Salmonellaylaeliminaciónde cultivossospechososfalsos.
e. Serotipificación,esunatécnicainmunológica(antígeno-anticuerpo) que permitela
identificaciónespecíficade unmicroorganismo.
i. Pesar25 g de muestraencondicionesde asepsia
ii. Homogeneizarcon225 mL de solucióndiluyente segúnel tipode muestra
(Incubar18- 24 h a 37°C)
iii. Siembraconasa bacteriológicaencaldotetrationatooVassiliadisyCaldo
Selenitocistina(Incubar18- 24 h a 37°C)
iv. Aislamientoenmediosselectivosydiferenciales(XLD,SS.Hecktoen,VB,
Sulfitobismuto)
v. (Incubar18- 24 h a 37°C), Búsquedade coloniastípicas.

12. vi. RealizarbioquímicaspresuntivasKligleryLIA (Incubar18- 24 h a 37°C)
vii. Resultadoscaracterísticos: Siembrade bioquímicascomplementarias:
malonatocitrato,RM -VP,urea,SIM,manitol.( Incubar18 - 24 h a 37°C)
viii. ResultadospositivosparaSalmonella.
ix. Confirmaciónserológica
2- La técnicade aislamientode Listeriaspp,consisteen:
a. Movilidad:se utilizaagarGI, incubandoa 25°C, durante siete díasy haciendo
lecturasdiariasdel crecimientoensombrilla,típicasde lamayoríade lasespecies
de Listeria.
b. Fermentaciónde carbohidratos:se empleansolucionesde D-manitol,ramnosa,y
xilosa,esterilizadasporfiltraciónyañadidas,hastaunaconcentracióndel 1,0%,al
caldopúrpura.Tras la inoculaciónde lascepase incubacióna37°C, se hizola
lecturaa las 24 y a las 48 h. Las cepascapaces de producirácidoa partirdel
carbohidratorespectivoviraranel colordel indicadorhaciaamarillo.
c. Producciónde b-hemólisis:se estudialaactividadb-hemolíticaenplacasde Agar
Base Columbia,suplementadoconsangre humana,al 5% no tratada, incubandoa
37°C, por 24-48 h. Se consideranpositivasaquellascepasque presentenunhalo
de aclaramientoalrededorde lazona de siembra,comoresultadode lalisistotal
de loseritrocitos,presentesenel medio.
d. Pruebadel CAMP:para esta prueba,se utilizancultivosde 24 h,a 37°C de S.
aureus y Rhodococcusequi,empleandocomo mediode cultivoAgarBase
Columbiaal 5%,de glóbulosrojoshumanos.Encadaplaca de medio,se siembran
lascepas anterioresde formavertical,consuficienteseparaciónentreellaspara,
posteriormente sembrarlascepasa ensayarde forma horizontal,nopermitiendo
que se toquenunascon otras. Se incubana 37°C, durante 24-48 h. Para la lectura
de la prueba,se examinanlashemólisisenlazonade influenciade lasiembra
vertical.
3- El protocoloque se utilizaparaaislarEstafilococosaureus:
a. Aislamientoselectivo,se utilizaunmedioselectivosólido,el cual inhibeel
desarrollode génerosdiferentesal Staphylococcus,peroademáspermite
reconocerel desarrollocaracterísticodel microorganismobuscado.
b. Recuperaciónde lacepa,este pasopermite restaurarlascélulasdañadasde
Staphylococcusaureus.
c. Identificaciónbioquímica,eneste puntose identificael géneroyespecie de
Staphylococcusaureusenterotoxigénico.

13. 4- El métodode aislamientode hongosylevaduras:
Se basa en inocularunacantidadconocidade muestra,enun mediode cultivoselectivo
específico,aprovechandolacapacidadde este grupomicrobianode utilizarcomo
nutrientesalospolisacáridosque contieneel medio.Lahidrólisisde estoscompuestosse
efectúaporenzimasque poseenestosmicroorganismos.Lasobrevivenciade loshongosy
levadurasapH ácidos se pone de manifiestoal inocularlosenel mediode cultivo
acidificadoaun pH de 3.5. Así mismo,laacidificaciónpermitelaeliminaciónde la mayoría
de las bacterias.Finalmente,lascondicionesde aerobiosisylaincubaciónauna
temperaturade 25 ± 1 ºC da como resultadoel crecimientode coloniascaracterísticas
para este tipode microorganismos.

14. a. Pesar10 g de muestraencondicionesde asepsia
b. Homogenizarcon90 .0 mL de solución
c. Realizardilucionesdecimalesempleandotuboscon9.0 ml de solucióndiluyente
d. Depositarporduplicado1.0 mL de cada diluciónencajasde Petri
e. Adicionarde 15 a 20 mL de agar papa dextrosay/óagar extractode malta
acidificadoscon0.3 mL ácido tartárico10 % enfriadoa 45°C encada placa
f. Homogeneizarlamuestraconel agar mediante movimientosrotatorios
g. Incubarlas cajas enposicióninvertida(3,4ó 5 días)
h. Contar aquellasplacasque tenganentre 10a 150 coloniasde hongosy/o
levadurasyreportarpor separadocomo UFC/go mL de muestra,indicando
tiempode incubación

15. Bobliografia:
- http://www.webs.ulpgc.es/hbg/PRACTICAS/PROBLEMAS/CALCULOS-UFC.pdf
- http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Pagogenosnorm.Salmonella_17364.pdf
- http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Analisis_Agua_NMP_22309.pdf
- http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-42262012000200002
- http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/patogNOMStaphylococcusaureus_17365.pdf
- http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-mohos-
levaduras_6530.pdf
- http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8765
- https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-
microbiologia/indice/identificacion-bacteriana/produccion-de-indol