Métodos de Conteo Viral Cualitativo

1. Métodos de Conteo Viral Cualitativo
HEMAGLUTINACIÓN Descubierta en 1941 por Hirst, Mc Clelland y Harc Virus
de la Influenza.
Unión de hemaglutininas virales a receptores
mucoproteicos presentes en los eritrocitos
Se observa como una turbidez distribuida homogéneamente
por el pocillo, si no hay Hemaglutinación aparece un botón
rojo en el fondo.
Los receptores pueden ser bloqueados por la
neuraminidasa, fenómeno llamado elusión (37°c)

2. • Si se hace reaccionar un
virus con capacidad de
hemaglutinación con su
anticuerpo específico, éste
anulará su capacidad de
hemaglutinación por
bloqueo de las
hemaglutininas presentes
en la envoltura del virión.
INHIBICIÓN DE LA
HEMAGLUTINACIÓN (IHA)

3. MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA: TITULACIÓN
Determinación cuantitativa de la
infectividad de una preparación viral.
Número de unidades infecciosas presentes
en el inóculo por unidad de volumen.
Según el tipo de respuesta, los
procedimientos para cuantificar un
virus se clasifican en 3 grupos:
• Titulación de punto final
• Enumerativos
• De gradación
Mínima cantidad de material que es
necesario inocular a un hospedador para
obtener una respuesta determinada

4. Método de Recuento de Placas Bajo Agarosa
• Cuantifica cantidad de
viriones en un inoculo.
• Se basa en el recuento
de lesiones
localizadas.
• La infectividad se
puede expresar en
(UFP)
El título se calcula directamente a partir de la
dilución de la muestra (d), el número de placas
contado (n) y el volumen de inóculo (y).
Título (UFP/ ml )=n/vxd

5. CUANTIFICACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA DE PUNTO FINAL
Se realizan 10 diluciones, y se inoculan en
números iguales de unidades de pruebas
Se require emplear los datos obtenidos en las
distintas diluciones para poder calcular la dilución
límite en que el 50% de las unidades de prueba
están infectadas.
Existen diversas fórmulas, siendo la
más utilizada la de Reed y Mitench
(1938)
La dilución que infecta el 50% de las unidades de
prueba se denomina Dosis infectante de cultivos.
(DICT50 si se trata de cultivos, o bien;
Dosis Letal 50 (DL50) si se trata de animales
Se infectaron tubos conteniendo monocapas
de células en cultivo con 0.1 ml de cada
dilución decimal de virus

6. La distancia relativa del logaritmo de la
dilución al 50%
En consecuencia, una suspensión
viral diluida contenida en 0,1 ml
(volumen del inóculo), representa 1
DICT50.
Esto significa que en esa dilución la
mitad de los cultivos se infectaron
con él.
En este método el título corresponde
al número de DICT, en el volumen del
inóculo

7. Ciclos de Replicación Viral
Ciclo lítico
• Ocurre cuando el virus LISA o
DESTRUYE la célula
hospedadora.
Ciclo lisogénico
• Ocurre cuando el material
genético viral se integra al de la
célula hospedadora.
• Cada vez que se reproduce la
célula hospedadora lleva el virus
en su propio material genético,
de generación en generación.
• No implica la lisis de la célula
hospedadora.

8. CICLO LÍTICO
• Involucra las siguientes 5 fases o etapas:
1. Fase de fijación o absorción
2. Fase de penetración o de infección
3. Fase de multiplicación o replicación
4. Fase de ensamblaje
5. Fase de lisis o liberación

9. 1. Fase de fijación o absorción
• Cuando las proteínas de la cápside o la envoltura viral se adhiere a un
receptor específico de membrana presente en la célula hospedadora.
• Algunos virus no requieren receptores específicos para fijarse en la
célula hospedadora.
• En Bacteriófagos: Éste se une a los receptores que hay en la
superficie de la pared bacteriana, por medio de sus fibras caudales y
su placa basal.

10. 1. Fijación o absorción

11. 2. Fase de
penetració
n o
infección
• Ocurre cuando el virus inyecta en el interior
de la célula hospedadora su material
genético.
• Dependiendo del tipo de virus, existen
diferentes formas de penetración:
• Los virus desnudos introducen toda la
nucleocápside en la célula (por perforación de la
membrana con enzimas hidrolíticas o por
endocitosis).
• Los virus envueltos unen su membrana con la de
la célula hospedadora y luego el ácido nucleico se
libera rompiendo la cápside.
• En Bacteriófagos: Estos se contraen y perforan la
pared celular con una enzima (lisozima fágica) que
está en la placa basal, e inyectan el ADN en el
citoplasma de la célula hospedadora. La cápside
queda por fuera de la célula.

12. 2. Fase de penetración o infección

13. 3. Fase de multiplicación o
replicación
• En esta fase el genoma viral controla el metabolismo de la célula
hospedadora obligándola a sintetizar todos sus componentes.
• En ella ocurren dos fenómenos de interés:
• Se sintetizan las proteínas del virus. Ocurre en el citoplasma de la célula
hospedadora.
• Se replica el ácido nucleico viral, ocurre en el citoplasma o en el núcleo de la
célula hospedadora.

14. • En un Bacteriófago: El ADN del fago se
apodera de la maquinaria metabólica
de la bacteria y comienza su
multiplicación.
La bacteria produce nuevas moléculas
del ADN viral, proteínas víricas par
formar la cápside y proteínas
enzimáticas para el ensamblaje de las
piezas del virus.

15. 3. Fase de multiplicación o replicación

16. 4. Fase de ensamblaje
• Las proteínas y el ácido nucleico recién sintetizado se ensamblan para
formar nuevos virus.
• Los capsómeros se reúnen para formar la cápside.
• El ácido nucleico se pliega en el interior de la cápside junto con
enzimas que puede llevar el virus.

17. 4. Fase de ensamblaje

18. 5. Fase de lisis o liberación
• Es la etapa en la que los virus salen de la
célula. Esta liberación se puede dar por 2
mecanismos:
• Por gemación: El virus induce a la membrana de
la célula hospedadora a formar pequeñas
vesículas en las que se introducen y que luego se
separan de ella. (Común en virus envueltos).
• Por exocitosis: El virus provoca agujeros en la
membrana por medio de enzimas líticas. Causa la
muerte de la célula hospedadora.

19. • En un bacteriófago: Los nuevos fagos salen al exterior
debido a la acción de la enzima endolisina que
produce la lisis de la bacteria.
Los nuevos fagos pueden infectar a otras células y el
proceso volverá a empezar.

20. 5. Fase de lisis o liberación

21. CICLO
LISOGÉNI
CO
• Involucra las fases 1 y 2 del ciclo lítico, además,
incluye una 3 etapa denominada Integración, en la
que el DNA vírico se integra al DNA de la célula
hospedadora.
• En un Bacteriófago: La bacteria continúa sus
funciones vitales y al duplicarse su DNA también lo
hace el DNA del virus, llamado PROFAGO o virus
atenuado.
El genoma del virus pasa a las bacterias hijas. Por
cuestiones ambientales, este virus atenuado puede
activarse y entrar en un ciclo lítico.

22. Ciclo lisogénico

23. En
resumen…el
ciclo lítico
incluye

24. Y el ciclo
lisogénico…

25. Ciclo de replicación
1. Unión del virus a los linfocitos T (las proteínas gp 120 del virus se
unen a receptores de membrana CD4 de del linfocito) y estimulan
la endocitosis.
2. Transcripción inversa: La cápside viral ingresa a la célula, libera el
genoma y las enzimas. La transcriptasa inversa, crea copias de ADN
a partir de ARN viral.
3. Integración: El ADN viral se integra al ADN de la célula gracias a la
acción de la enzima integrasa.

26. 4. Transcripción: A partir del ADN viral se produce
ARNmensajero que sale del núcleo de la célula
hospedadora.
5. Traducción: El ARNm se traduce en proteínas.
6. Ensamblaje: Las proteínas del virus son cortadas por
la enzima proteasa, para prepararlas para ensamblar
el virus. Cada parte producida (cápside, ácido
nucleico, envoltura, etc.) se ensamblan y forman
nuevos virus.
7. Gemación: Los nuevos virus salen por gemación de
la célula hospedadora.

28. En síntesis
Característica VIH HERPES VIRUS
Tipo de ácido nucleico ARN dos cadenas ADN 2 cadenas
Célula hospedadora que parasita Leucocitos (linfocitos T) Células de la piel
Forma de ingresar a la célula
hospedadora
El virus se une a los receptores de membrana CD4
de los linfocitos T estimulando la endocitosis.
Por endocitosis. No
requiere receptor de
membrana.
Participación de enzimas durante la
replicación
Transcriptasa inversa (convierte la cadena del ARN
vírico en cadena ADN doble)
Integrasa (oculta el ADN vírico dentro del ADN de la
célula hospedadora)
Polimerasa del ARN, permite crear copias del
material genómico del VIH y ARNm para formar
largas proteínas del VIH.
Proteasa, divide las cadenas largas de proteínas en
pequeñas proteínas.
----
Forma en la que salen los virus de la
célula.
Por gemación. Salen del núcleo por
gemación y de la célula
por exocitosis

29. Virus del
Herpes

30. ¿Cómo ingresa
un virus a una
célula?
Los virus se reproducen dentro de las células vivas del huésped y usan la
maquinaria celular para sintetizar su propio genoma y demás componentes. Para
lograr entrar a las células, han desarrollado una variedad de mecanismos para
introducir sus genes y proteínas a las células del huésped
Las partículas virales deben transferir su genoma y proteínas accesorias
de una célula huésped infectada a otra célula no infectada. Esta tarea
involucra el empaquetamiento del genoma viral y las proteínas accesorias,
la liberación del paquete de la célula infectada, la protección de los
componentes esenciales durante la transmisión fuera de la célula y la
entrega de dicho paquete a una nueva célula

31. Para iniciar la replicación en una célula huésped, la mayoría de
los virus deben adherirse a la membrana plasmática, una
interacción mediada por la unión específica a un receptor, que
es una molécula, generalmente una proteína, que se encuentra
en la superficie de la membrana
Para algunos virus, el receptor es la única molécula requerida
para entrar a las células; para otros, la unión a un receptor no
es suficiente para infectar al huésped por lo que otra molécula
de membrana, un correceptor, es requerido para su entrada

33. En virus envueltos, las glicoproteínas puntiagudas son las que
se unen a los receptores. Generalmente son proteínas
multifuncionales que adicionalmente sirven como factores de
fusión de membranas y/o enzimas destructoras de receptores.
Los receptores de la célula son moléculas que se encuentran en
la superficie de la membrana que proveen funciones esenciales
en el proceso de infección. En situaciones simples, los
receptores pueden elegir como blanco a virus para realizar
endocitosis
El receptor celular puede determinar el rango de potenciales
hospederos de un virus, así como su habilidad para infectar un
animal o un tipo de célula en particular.

34. Muchos virus de animales se aprovechan de la maquinaria endocítica de la
célula para entrar y producir infección. Una de las ventajas de la entrada
endocítica es que los virus tienen una entrada fácil al citoplasma; esto es
debido a que las vesículas endocíticas están diseñadas para atravesar las
barreras del citoesqueleto y el citoplasma. Esta vía de entrada también tiene la
ventaja de no dejar glicoproteínas virales en la membrana celular, por lo que el
sistema inmune no será capaz de detectarlo

35. La secuencia de eventos para la mantención de un virus
determinado en la naturaleza comprende la liberación
viral de la célula, la salida del hospedero, el transporte a
través del medio ambiente en una forma viable, y la
apropiada entrada en un nuevo hospedero susceptible
Algunos virus son liberados de las células al final del
ciclo replicativo, otros no completan este ciclo, y un
tercer grupo no egresan eficientemente.
La transmisión a un nuevo hospedero es dependiente a
varios factores: 1) cantidad de virus diseminado o
vehiculizado; 2)estabilidad viral en el medio ambiente;
3)presencia de vectores transmisores; 4) disponibilidad
de hospedederos suceptibles 5)constitución genética del
virus y del hospedero.
La probabilidades de transmisión son mayores si el
numero de viriones es elevado.
195 a 200

36. Diferentes virus poseen distinta susceptibilidad al medio externo: temperatura, desecacion, Ph,
ETC.
Los virus pueden transmitirse a otro hospedero a partir de las siguientes fuentes: secreciones
respiratorias, saliva, heces, orina, secreciones genitales, leche, sangre o piel.