Bioquímica de Harper.

1. PROTEÍNAS: DETERMINACIÓN
DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA.

2. Proteínas
Macromoléculas complejas desde los punto de vista
físico y funcional.
Funciones.
 Estructural
 Contráctil
 De defensa
 De transporte
 Enzimática
 Receptora.

3. Ciclo de vida de una proteína hipotética.
División
proteólica
Enlaces
disulfuro
defector
ubiquitina

4. Las proteínas y los polipéptidos se deben
purificar antes de analizarlos.
 Las células contienen miles de proteínas distintas,
cada una en cantidades variables. El aislamiento de
una proteína especifica, para su análisis, puede
requerir la aplicación sucesiva de múltiples técnicas
de purificación

5. La cromatografía separa una proteína de la otra con
base en:
 Diferencia de tamaño
 Carga
 Hidrofobicidad
 Capacidad para unirse a un ligando especifico.

6.  Cromatografía
de columna
 Cromatografía líquida
de alta presión (HPLC)
Puede separar derivados de las
cuentas de fase estacionaria para
cubrir su superficie con los grupos
ácido, básico, hidrofóbico o tipo
ligando requeridos para
cromatografía de intercambio
iónico, de interacción hidrofóbica, o
de afinidad.
La reducción del tamaño de las
partículas ofrecio el potencial de
aumentar mucho la resolución .
Sin embargo, la resistencia
creada por la matriz requirió el
uso de presiones muy altas .

7.  Cromatografía de
exclusión de tamaño.
 Cromatografía de
intercambio iónico.
Filtracion de gel.
Separa las proteínas con
base en su radio Stokes
(funcion de la masa y la
forma moleculares)
Emplean cuentas
porosas.
Con una carga positiva se adhieren
estrechamente a cuentas con
grupos funcionales que tienen
carga negativa (carboxilatos o
sulfatos). Con una carga negativa
se adhieren a cuentas que tienen
grupos funcionales positivos ,
mientras las proteínas no
adherentes fluyen a través de la
matriz

8.  Cromatografía de
interacción hidrofóbica.
 Cromatografía
de afinidad.
Separa proteínas con base a
su tendencia a asociarse con
una matriz de fase
estacionaria cubierta con
grupos hidrofóbicos
Usando sustratos, productos,
coenzimas o inhibidores ,
inmovilizados; solo las proteínas que
interactúan con el ligando
inmovilizado se adhieren.

9. E L M É T O D O M A S U S A D O E S L A S D S - P A G E (
E L E C T R O F O R E S I S E N G E L D E
P O L I A C R I L A M I D A )
• L A A C R I L A M I D A S E P O L I M E R I Z A Y S E
E N T R E C R U Z A P A R A F O R M A R U N A
M A T R I Z P O R O S A .
• E L S D S S E U N E A P R O T E Í N A S E N
P R O P O R C I Ó N D E 1 M O L É C U L A P O R C A D A
2 E N L A C E S P E P T Í D I C O S ( S E D E S D O B L A
O D E S N A T U R A L I Z A .
• L O S P O L I P É P T I D O S S E S E P A R A N C O N
B A S E A S U P E S O M O L E C U L A R
Pureza de las proteínas

10. Enfoque isoeléctrico(IEF)
 Se usan amortiguadores iónicos (anfolitos) y un
campo electric para generar un gradiente de PH
dentro de una matriz de poliacrilamida.
 Las proteinas migran hasta la region donde el PH
coincide con su punto isoeléctrico.
 Se usa junto a SDS-PAGE para electroforesis
bidimensional:
-En base en el punto isoeléctrico.
-En base en el peso molecular.

11. Sanger determina la secuencia de un polipéptido
• Frederick Sanger dividió cada cadena de
polipéptidos usando tripsina, quimotripsina y
pepsina.
• Hizo reaccionar los péptidos con 1-fluoro-2,4-
dinitrobenceno (reactivo de Sanger).
• Logró reconstruir la secuencia completa de la
insulina.

12. Reacción de Edman
 Pehr Edman introdujo el fenilisotiocianato (reactivo
de Edman) para marcar el residuo amino terminal de
un péptido.
 Las proteinas se dividen en péptidos usando
proteasa o bromuro de cianógeno.

13. Espectrometría de masa (MS)
 La MS ha reemplazado a la técnica de
Edman para determinar secuencia de
péptidos y proteínas.
 Puede usarse para analizar metabolitos,
carbohidratos.

14. Los péptidos pueden volatilizarse
para análisis mediante ionización de
electrospray o desorción láser
asistida por matriz
En el análisis de péptidos y proteínas mediante espectrometría de masa
inicialmente estuvo obstaculizado por dificultades para volatizar moléculas
orgánicas grandes.
Las moléculas orgánicas pequeñas podían vaporizarse fácilmente; las proteínas,
oligonucleótidos, entre otros, quedaban destruidos en estas condiciones.
La dispersión hacia la fase de vapor se logra mediante ionización de
electrospray y desorción y ionización láser asistida por matriz (MALDI)

15. Un espectrómetro de
masas tándem es un
instrumento
especializado que detecta
moléculas midiendo su
peso (masa). Los
espectrómetros de masas
miden el peso
electrónicamente y
presentan los resultados
en la forma de espectro
de masas.

16. La espectrometría de
masas tándem puede
usarse para efectuar
pruebas en muestras de
sangre provenientes de
recién nacidos para
detectar la presencia y las
concentraciones de
aminoácidos, ácidos grasos
y otros metabolitos.
Las anormalidades
de las
concentraciones de
metabolitos pueden
servir como
indicadores
diagnósticos para
diversos trastornos
genéticos, como:
• Fenilcetonuria
• Encefalopatía con
acidemia
metilmalónica
• Acidemia
glutárica tipo 1

17. La proteómica se
dirige a identificar
la totalidad de
proteínas
elaboradas por
una célula en
condiciones
diversas
El proteoma es el
conjunto de todas las
proteínas expresadas
por una célula
individual en un
momento particular

18. • La electroforesis bidimensional, es una forma de
electroforesis en gel comúnmente utilizada para analizar
proteínas.
• Las micromatrices multigénicas, a veces llamadas
microchips DNA, en las cuales se detecta expresión de
los mRNA que codifican para proteínas

19. Se desconocen las funciones de una gran
proporción de las proteínas codificadas por el
genoma humano. Aún esta en sus inicios la
creación de micromatrices proteínicas para
practicar pruebas de manera directa respecto a
las funciones potenciales de proteínas a una
escala masiva.
De este modo, la información acerca de las
propiedades y la función fisiológica de una
proteína recién descubierta puede inferirse al
comparar su estructura primaria con la de
proteínas conocidas.
Bioinformática ayuda a la identificación de
funciones de las proteínas

20.  Bibliografía:
Biquímica de Harper. Edición 28. Capítulo 4.