El documento proporciona información sobre diferentes técnicas ómicas como la transcriptómica, proteómica y metabolómica. Explica que la transcriptómica implica el análisis del transcriptoma mediante técnicas como los microrrays de ADN, la proteómica implica el estudio a gran escala de proteínas utilizando métodos como electroforesis bidimensional y espectrometría de masas, y la metabolómica implica el estudio de metabolitos pequeños en una muestra utilizando espectrometría de masas o resonancia magn

1. Le damos la bienvenida a PowerPoint
5 sugerencias para trabajar de un modo más sencillo

2. BUSQUEDA DE METABOLITOS CLAVE(BIPOMARCADORES)

3. procesos posteriores,
como los ARN, las
proteínas y los
metabolitos. Los efectos
de los diferentes
elementos reguladores
son aditivos. La biología
de sistemas intenta
analizar las
interacciones entre las
diferentes entidades
moleculares para
ofrecer una visión
holística de los
procesos biológicos y
las alteraciones
patológicas que se
producen en la
enfermedad.

4. https://www.academiadefarmaciadearagon.es/doc
s/Documentos/Documento73.pdf

5. HIBRIDACION:
Consiste en analizar las miles de moléculas de
ARN de todo tipo, es decir, el transcriptoma,
mediante diferentes técnicas dentro de las cuales
la más usada es el microrray (micromatrices) de
ADN.
La idea básica de las micromatrices es construir,
sobre una membrana o lámina de vidrio, partes
de muestras que contienen fragmentos de ADN.
Por otro lado se marca el ARN o el ADN copia
(ADNc) de una población celular con
fluorescencia o radioactividad, y se usa esta
preparación para hibridar con el ADN de la
micromatriz.
Generalmente se hibrida simultáneamente la
misma micromatriz con una muestra de ARN o
ADN copia de referencia, para facilitar la
comparación.
permitiendo así el estudio de los perfiles de
expresión genética presentes en el genoma. La
transcriptómica es el paso previo a la proteómica,
la cual consiste en el estudio completo de las
proteínas expresada por el genoma

7. PROTEÓMICA
Proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas, en particular de su estructura y función. el proteoma no sólo difiere
de una célula en otra célula, sino que también cambia según las interacciones bioquímicas con el genoma y el ambiente. El
proteoma varía de un tipo de célula a otra, de un año a otro, de un momento a otro
La caracterización de la expresión de la proteína a
nivel de todo el proteoma consiste en la medición
cuantitativa de proteínas en una célula en un
determinado estado metabólico
Los métodos clásicos para separar proteínas
consisten en realizar un proceso llamado
electrofóresis bidimensional en gel seguido de un
análisis de la imagen producida por el gel.
Además de la caracterización también implica una
determinación de la composición de aminoácidos,
las huellas peptídicas de masas(peptide mass
fingerprints) y secuencias utilizando la
espectrometría de masas(mass spectrometry o MS).
Y finalmente la búsqueda dentro de la base de datos
es necesaria para la identificación de próteinas.

9. Ilustración esquemática de las estrategias utilizadas
en el análisis del proteoma .
En contraste con el enfoque "basado en gel",
el enfoque "sin gel" utiliza la separación
cromatográfica de péptidos internos derivados de
proteínas digeridas.
La cromatografía líquida de intercambio iónico (IE)
y de fase inversa (RP-HPLC) se utilizan en
enfoques bidimensionales para lograr una
separación de péptidos de alta resolución (2D-LC),
que también es una herramienta versátil y
poderosa.
Sin embargo, un enfoque proteómico "basado en
gel" es mucho más económico que uno "sin gel" si
se tiene en cuenta el costo del instrumento. A pesar
del rendimiento de la separación, el primer paso en
un enfoque de proteómica es la preparación de la
muestra, que es extremadamente crucial ya que los
resultados están profundamente influenciados por
este primer paso.

10. PREPARACION DE LA MUESTRA
La preparación de la muestra comienza con el cultivo o el lisado de células,
homogenizando tejidos u obteniendo fluidos corporales para la extracción de las
proteínas presentes.
Las proteínas extraídas son desnaturalizadas y modificadas químicamente para
solubilizarlas y preveer así la agregación y la actividad proteasa que pueda
presentar la muestra.
Las proteínas pueden ser desnaturalizadas por calor o a través de agentes químicos
como la urea o distintos detergentes.
Sin embargo, los detergentes generan un ruido de fondo que puede llegar a
enmascarar señales específicas de origen peptídico, por lo que la cantidad de
detergente presente en la muestra debe ser mantenida al mínimo o,
alternativamente, ser diluida o eliminada de la muestra antes de su digestión
enzimática y análisis por MS.
Una vez desnaturalizadas, las proteínas son además reducidas y alquiladas para
prevenir su agregación a través de la formación de enlaces o puentes disulfuro
entre los grupos tiol de dos cisteínas.
Los agentes reductores más comúnmente utilizados son el beta-mercaptoetanol, el
ditiotreitol (DTT), la tributilfosfina (TBP) y la tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP),

11. Separación de proteínas

12. 2D-Page (Electrofóresis bidimensional
en gel de poliacrilamida)
Utilizada para la separación y aislamiento de proteínas .
Introducida en 1970, es la técnica más eficaz para resolver
mezclas complejas de proteínas.
Dos tipos de electroforesis en geles de poliacrilamida:
•Monodimensional (SDS-PAGE)
•Bidimensional (2D-PAGE)
El gel de poliacrilamida es uno de los geles utilizados con más
frecuencia para realizar este tipo de técnicas ya que es
químicamente inerte, transparente y estable en un rango amplio
de pH’s, temperatura y fuerza iónica.
Las proteínas se separan de acuerdo a su masa y como las
proteínas son solubilizadas en dodecil sulfato sódico (SDS), no
suele haber problemas de solubilización
Separación de proteínas

13. Secuencia de pasos en un experimento típico de
proteómica basada en Electrofóresis
bidimensional -2DE.
Una muestra compleja de proteínas se aplica a
un gel con un gradiente de pH inmobilizado en
el que las proteínas se separan de acuerdo a sus
puntos isoeléctricos (pI).
Una vez resueltas, el gel se deposita sobre un gel
de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE)
en el que las proteínas se separan por peso
molecular (PM) en una segunda dimensión
perpendicular a la anterior.
Tras la tinción del gel, las bandas proteicas de
interés se extraen y se digieren;
los péptidos resultantes permiten identificar la
proteína correspondiente a partir de su huella
peptídica por espectrometro MALDI-TOF, MS y
subsiguiente búsqueda en bases de datos

15. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Tecnica analítica, Sirve para determinar la masa molecular de proteinas y muchos otros
compuestos, Mide la relación masa carga. Las moléculas que esten en fase gaseosa esten
cargadas o ionizadas Y producir una información.
El espectro de masa, tiene : muestra(proteínas, separación ion o frag), información
detectable y se analice los iones.

16. Secuencia de pasos seguida en un experimento
típico de LC-MS/MS.
Una mezcla compleja de proteínas se digiere
enzimáticamente hasta sus péptidos
correspondientes.
La mezcla de péptidos puede ser fraccionada
mediante cromatografía de alta resolución
(HPLC) y cada fracción puede ir siendo
inyectada directamente en un espectrómetro
de masas en tándem a medida que van
eluyendo los péptidos.
Opcionalmete, cada fracción puede ser
colectada por separado mediante un colector
de fracciones y cada una ser inyectada
manualmente en el espectrómetro de masas.
En primer lugar, se adquieren espectros de MS
desde los que ciertos péptidos son
seleccionados para ser fragmentados.
Los espectros de fragmentación resultantes (o
espectros de MS/MS) se usan para llevar a
cabo la identificación de la secuencia peptídica.
La lista de péptidos secuenciados se utiliza con
el fin de identificar, mediante su búsqueda en
bases de datos, los componentes proteicos
individuales de la muestra originalx

17. 1. Elemento de esptrometro que ioniza el material que
será ionizado que le añade lac carga a l compuetso que
será analizado, la tecncia puede ser un proceso quimico o
físico
2. Utiliza el campo eléctrico o magnético para sep
iones en función d ela relacionmasa-carga, sufrien
desviación.
3. Los iones que llegan al detector,
producen una señal , producen una
eléctrica que es procesada y envia
detector.

18. 1. La muestra debe estar en una matriz organica.
2. Como fuente de ionización emplea un laser,
produciendo rayos uv.
3. La separación d eiones se produce sgeun el tie
vuelo, 1-10.2gr
4. Detectan proteínas ribosómicas hil

19. METABOLOMICA

20. Los espectrómetros de masas actuales solamente resuelven de 4 a 5 órdenes
de magnitud. Aunque un solo péptido puede ser suficiente para identificar sin
ambigüedad una proteína, son necesarios múltiples péptidos de la misma
proteína para una cuantificación fiable en la proteómica de perdigonada. Hasta
la fecha, la mayoría de los estudios de proteómica que han analizado muestras
de plasma han fracasado en el intento de identificar nuevos biomarcadores
debido a que las proteínas poco abundantes son difíciles de detectar en
presencia de componentes muy abundantes como la albúmina. El problema del
muestreo insuficiente del proteoma plasmático se podría superar en parte con
técnicas que utilizan una depleción de las proteínas plasmáticas abundantes.
Una estrategia alternativa es el empleo de tejido enfermo, en el que hay un
enriquecimiento de biomarcadores. Puede usarse una estrategia más
específica en el plasma/suero una vez identificado el biomarcador candidato.

21. Monitorización por reacción múltipleLa monitorización por reacción múltiple en un
espectrómetro de masas de triple-cuadrupolo (QqQ-EM) se aplica a péptidos o metabolitos
identificados en los experimentos de descubrimiento14,15. Una QqQ-EM proporciona una forma
efectiva y exacta de cuantificar unas pocas moléculas diana seleccionadas, incluso en mezclas
complejas como el plasma o el suero15. Si se puede ionizar la molécula de interés mediante
ionización por electrospray, la QqQ-EM tendrá una interfase con un sistema de CL para la
separación del producto analizado, tal como se ha mencionado antes. La molécula precursora
se selecciona entonces en el primer cuadrupolo. El segundo cuadrupolo se emplea como
cámara de colisión para la fragmentación.
Los iones producidos son detectados en el tercer cuadrupolo, y su intensidad es un indicador
de la abundancia de la molécula de origen16. Dada su alta especificidad, la monitorización por
reacción múltiple se emplea para la validación de biomarcadores candidatos identificados en
los experimentos de descubrimiento17, pero se ha empleado también con éxito para confirmar
lugares específicos de fragmentación de las proteínas18. Además, la QqQ-EM es el método de
elección para los estudios de metabolómica dirigida empleando metabolitos estándares como
calibradores19.

22. METABOLÓMICA
os metabolitos son los productos finales de todos los procesos que se producen en las
células, y las cantidades de metabolitos en la enfermedad reflejan la adaptación de los
sistemas biológicos a los estados patológicos. Hoy se estima que hay más de 2.000
metabolitos diferentes que pueden ser sintetizados de forma endógena20. Además, la dieta
incorpora metabolitos exógenos, como por ejemplo las vitaminas. Otro factor contribuyente
importante para el conjunto de metabolitos del organismo es la flora intestinal. Al igual que
en el caso de la proteómica, el objetivo de la metabolómica es caracterizar el complemento
de moléculas pequeñas de una muestra determinada e interrogar a las redes metabólicas
en condiciones normales y patológicas, de manera cualitativa y cuantitativa. Las
tecnologías de metabolómica se han aplicado a diferentes áreas de investigación clínica,
entre ellas el descubrimiento de biomarcadores y fármacos21,22, la toxicología23 y la
nutrición24. Los primeros estudios de metabolómica se publicaron a comienzos de la
primera década de este siglo y se aplicaron rápidamente a la investigación cardiovascular.
Al igual que en la proteómica, la EM es el método de elección para los análisis de
metabolitos, pero también se emplea ampliamente la espectroscopia por resonancia
magnética (ERM)25.

23. Metabolómica basada en espectroscopia
por resonancia magnética
La ERM es menos sensible que la EM, pero es notablemente cuantitativa y
aporta ventajas en la cuantificación de los metabolitos en tejidos intactos y en
extractos de tejidos26. Esta técnica se basa en que ciertos núcleos con un
número de nucleones (protones o neutrones) impar poseen una propiedad
denominada espín nuclear. Las resonancias de los núcleos excitados
mediante radiofrecuencias específicas pueden medirse para producir una
señal bien definida. Los protones (1H) son con frecuencia los núcleos de
elección para el parámetro de espín, ya que son abundantes. Empleando
ácido perclórico, se puede extraer los metabolitos hidrosolubles directamente
de corazones sometidos a congelación brusca

24. La 1H-ERM proporciona una forma cuantitativa de medir los metabolitos hidrosolubles
presentes en estos extractos de metabolitos27. Se utiliza un patrón de referencia interno
para calibrar las desviaciones químicas en los espectros para las identificaciones de los
metabolitos. Es importante señalar que el área del pico que corresponde a la señal de
cada metabolito puede calcularse mediante la comparación con el patrón de referencia
interno para obtener valores cuantitativos. Pueden examinarse al mismo tiempo muchas
clases de moléculas en las muestras extraídas, sin partir de supuestos previos respecto a
los tipos de moléculas. Esto hace que la 1H-ERM sea un método excelente para abordar
los análisis no dirigidos. La 1H-ERM muestra su potencia a la sensibilidad requerida
principalmente en extractos ácidos. La sensibilidad y la resolución se reducen en los
tejidos sólidos. Se puede analizar los tejidos sólidos empleando una técnica
denominada 1H-ERM con spinning de ángulo mágico de alta resolución. El estado
energético de una célula o un tejido determinados se puede evaluar con ERM de fósforo
(31P-ERM). Esta permite la detección de metabolitos energéticos cardiacos de vida corta
como fosfocreatina y adenosintrifosfato, así como fosfato inorgánico y el pH intracelular.
La 31P-ERM también es adecuada para determinaciones in vivo e in vitro28,29.

25. Metabolómica basada en espectrometría de masasLa metabolómica basada en EM proporciona un
método muy sensible de recopilar la información de un perfil metabólico, especialmente en los líquidos
corporales30. Se han realizado análisis metabolómicos basados en el plasma después de una isquemia
miocárdica31, pruebas de esfuerzo y pacientes prediabéticos32. Los metabolitos se separan antes de la
identificación mediante espectrofotometría de masas, utilizando para ello cromatografía de gases o CL.
Al igual que en la proteómica, los avances recientes en las tecnologías de EM han transformado nuestra
capacidad de establecer un perfil de metabolitos no solo en solución, sino también directamente a partir
de cortes de tejido. Por ejemplo, Manicke et al33 aplicaron una EM con ionización por electrospray de
desorción para visualizar e identificar especies moleculares de lípidos en placas de origen humano. En
otro estudio se mostró el uso de técnicas de imagen de moléculas pequeñas mediante EM en tejido
cardiaco de ratón34. Nosotros utilizamos los avances más recientes de la EM en lipidómica de
perdigonada para comparar el contenido lipídico de lesiones de aterosclerosis humanas bien definidas.
Comparando las muestras de endarterectomía de pacientes sintomáticos y asintomáticos y áreas
estables e inestables de la misma lesión sintomática, delimitamos las firmas de lípidos características
para determinar la vulnerabilidad de la placa18.

26. BIOINFORMATICA