El documento describe métodos para el análisis de proteínas, incluyendo la cuantificación de proteínas totales a través de métodos como el de Biuret y Lowry, y técnicas de separación como la electroforesis, inmunodifusión e inmunoelectroforesis. Estas técnicas permiten determinar la concentración y fracciones de proteínas para el diagnóstico clínico.

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TEMA 3: Métodos para el análisis de proteínas
3.1. Cuantificación de proteínas totales.
3.2. Técnicas de separación de proteínas. Análisis de proteínas específicas.
INTRODUCCIÓN
A lo largo de este tema vamos a estudiar las distintas técnicas que nos
permiten analizar desde un punto de vista cuali y cuantitativo, el contenido
proteico de las muestras biológicas haciendo especial hincapié en el estudio
de las proteínas plasmáticas.
Las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos
corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), líquido
cefalorraquídeo (15-45 mg/dL).
Si nos centramos en las proteínas plasmáticas, podemos diferenciar:
• Proteínas plasma-específicas: componentes habituales del plasma.
• Proteínas no plasma-específicas: aquellas que aparecen en el plasma
por rotura de otras células.
Las proteínas plasma-específicas (albúmina + globulinas) se sintetizan
fundamentalmente en el hígado, pero también en: células plasmáticas,
ganglios linfáticos, bazo y médula ósea.
En caso de enfermedad, tanto la concentración total como la de las distintas
fracciones pueden verse alteradas. Así, la determinación de las proteínas
totales sirve para el diagnóstico de:
• Afecciones hepáticas
• Afecciones de la médula ósea
• Otras afecciones del metabolismo o nutricionales
3.1. Cuantificación de proteínas totales
Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas
totales son los siguientes:
• Método del Biuret
En solución alcalina el Cu+2
reacciona con el enlace peptídico de las
proteínas dando un color purpúreo que se cuantifica
espectrofotométricamente (540nm). Como estándar se utiliza una solución
de albúmina.
Proteína + Cu+2
Complejo Cu-Proteína (púrpura)
Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del coágulo o
el plasma de las células antes de 3h. Si el paciente está acostado durante la
extracción el resultado será menor.
• Método de Lowry
Dependen de la concentración de tirosina y triptófano de la muestra.
Consiste en dos reacciones:
1. Reacción de Biuret

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2. Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores de los
aminoácidos tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2
,
reducen el reactivo de Folin generando un color azul.
Está sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina.
• Turbidimetría
Medición de la turbidez resultante de la precipitación de proteínas
• Absorción en el ultravioleta
Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los
anillos aromáticos de triptófano y tirosina.
• Métodos de unión a colorantes
NOTA: para semicuantificar la concentración de proteínas en orina se
utilizan tiras reactivas.
3.2. Técnicas de separación y análisis de las proteínas
La proporción de las fracciones proteicas individuales cambia en el
transcurso de un gran número de enfermedades lo que conlleva que, la
cuantificación de las mismas sea de valor considerable en el diagnóstico
clínico.
Los procedimientos más utilizados actualmente en el laboratorio clínico para
el estudio de las proteínas son los siguientes:
1. Turbidimetría y nefelometría
2. Inmunodifusión
3. Electroforesis
4. Inmunoelectroforesis
5. Inmunoelectroforesis en cohete
6. Inmunofijación
7. Cromatografía
1.- TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA
Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz
se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe.
La dispersión de la luz depende de: la longitud de onda de la luz (?), del
tamaño de la partícula y del índice de refracción de la partícula en relación
con el medio que la rodea.
La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría.
En ambas técnicas, para dar como resultado una concentración de proteína
concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de
dispersión con los valores de dichos parámetros en estándares proteicos
conocidos.

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1.1. La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través
de una suspensión de partículas utilizando para ello un
espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz, se
mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que
haya una buena disminución de la luz transmitida) ej. determinación
de proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las
proteínas precipiten con TCA o ácido
sulfosalicílico).
1.2. La nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz
emitida (generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90º).
Utiliza como instrumento el nefelómetro (en el que el detector se
ubica con un ángulo que oscila entre 15 y 90º ej. a 90º). Se suele
utilizar para concentraciones más diluidas.
Aspectos prácticos:
• Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partículas que
produzcan una dispersión de luz no deseada ej. lipoproteínas,
quilomicrones También puede interferir la suciedad.
• La intensidad de la luz dispersada aumenta al disminuir la ?. Las
proteínas suelen tener un pico de absorción en el ultravioleta (? <
300nm) y los cromógenos del suero entre 400-425nm; por todo ello
se suele trabajar a ? que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm.
Muy frecuentemente, para cuantificar proteínas concretas, se utilizan
anticuerpos que reaccionan con dichas proteínas de la muestra, en este
caso se habla de inmunoturbidimetría e inmunonefelometría. Para
enteder estas técnicas necesitamos tener claro unos conceptos previos:
• Antígenos (Ag): sustancias, generalmente de gran tamaño, capaces
de estimular el sistema inmunológico de un animal y originar una
respuesta dirigida específicamente contra él.

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• Epítopo o determinante antigénico: lugar del antígeno que reconoce y
se une al anticuerpo.
• Anticuerpo (Ac): grupo de proteínas llamadas inmunoglobulinas,
producidas por linfocitos B y su progenie (células plasmáticas) que se
combinan específicamente con los antígenos.
Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac específico contra ese antígeno
ambos reaccionan y forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los complejos
se forman rápidamente pero, existe una segunda fase de crecimiento de
complejos más lenta y, es precisamente en ésta fase en la que aparece la
dispersión de la luz. Así, en la inmunoturbidimetría e inmunonefelometría se
mide la dispersión de la luz provocada por los compeljos Ag-Ac. En
ocasiones los Ac se unen a bolitas de látex para aumentar el tamaño de los
complejos (inmunoanálisis potenciados).
2.- INMUNODIFUSIÓN
La inmunodifusión se basa en la formación de bandas de precipitación Ag-Ac
en medios semisólidos (generalmente de agarosa).
La formación de inmunocomplejos se ve afectada por variables como: pH,
temperatura, fuerza iónica del medio, características propias del Ac como
afinidad y avidez y, la más importante, la concentración relativa de Ag y Ac.
La zona óptima de concentración para la formación del precipitado Ag-Ac se
llama zona de equivalencia.
La inmunodifusión puede ser simple (sólo se mueve el Ag o el Ac) o doble
(se mueven Ag y Ac).
Para visualizar el resultado de la inmunodifusión, una vez terminada la
difusión se lava el gel y se tiñe con colorantes para proteínas (ej. negro
amido o azul brillante de Coomassie).
La inmunodifusión se puede clasificar atendiendo a distintos criterios. Entre
otras modalidades podemos hablar de:
a) Inmunodifusión radial: en este caso se añade un antisuero
específico a la agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas. Se
forman pozos en el gel y se colocan en ellos estándares de
proteínas y problemas (antígenos). El antígeno difunde en el
gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. Em la
zona de equivalencia se produce un anillo de precipitación

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a) Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony: se forman
pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrón de roseta. Se
depositan antisueros específicos en los pozos centrales y los
estándares de proteínas y los problemas en los pozos
circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el
anticuerpo y el antígeno alcanzan la equivalencia, se forman
bandas de precipitados insolubles. La posición y forma de la banda
se determinan según la concentración del antígeno y del
anticuerpo, y sus tamaños. La distancia de las bandas con
respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad
de antígeno presente.
Inconvenientes de la inmunodifusión:
1. Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de
lo contrario no se alcanza la equivalencia y no se forma el
precipitado. El precipitado solo se forma en el punto de equivalencia o
cuando hay un ligero exceso de Ag.
2. Las moléculas más pequeñas migran con más rapidez que las de gran
tamaño y conforme la migración continúa el precipitado puede
redisolverse y volverse a formar de acuerdo con los cambios de
concentración de Ag o Ac en el gel.
3. Si hay grandes cantidades de Ac, el antígeno no se difunde muy lejos
antes de alcanzar la equivalencia y el anillo es más grueso o espeso.
3. ELECTROFORESIS
Una de las técnicas más sencillas para la separación (y posterior
cuantificación) de proteínas es la electroforesis (técnica en la cual una
partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un
campo eléctrico).
Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que contiene partículas
cargadas, las partículas cargadas negativamente migran hacia el ánodo o
polo positivo mientras que, las cargadas positivamente migran hacia el
electrodo negativo (cátodo).
Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de proteínas
puesto que los aminoácidos (aa) constituyentes de la proteínas, y por tanto
las proteínas, son compuestos anfóteros que se comportan como ácidos

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(ceden protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones y
quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el que estén.
NOTA: El pH al que un aa no se comporta ni como ácido ni como base se
denomina punto isoeléctrico pI (en él la estructura del aa no
posee carga neta). Los pI varían desde 3 a 10, sin que exista
un pH al que todos los aa sean neutros.
• a pH superior 2 o + unidades a pI, el aa aparece cargado
negativamente
• a pH inferior 2 o + unidades a pI el aminoácido aparece cargado
positivamente
• pH = pI los aa aparecen como iones dipolares neutros
En soluciones muy ácidas todos los aa aparecen como cationes,
mientras que en soluciones muy básicas los aa se encuentran en
forma aniónica..
Si una disolución de proteínas se somete a la acción de un campo eléctrico
la tasa de migración durante la electroforesis depende de:
• La carga neta de la molécula, su forma y tamaño
• La fuerza del campo eléctrico
• Características del soporte
La cantidad de carga neta en la molécula es variable y depende del pH del
amortiguador. Si el pH del medio es menor que el punto isoeléctrico, las
proteínas se comportan como cationes y, si el pH del medio es superior al
pI, se comportan como aniones. La carga de la proteína se hace más
negativa a medida que el pH del amortiguador se hace más básico.
A pH 8,6 (básico) todas las proteínas migran hacia el ánodo (tienen carga
global negativa). La albúmina, con pI de 4,7 tendrá una mayor carga
negativa que la gamma-globulina, que tiene un pI de 7,2. En definitiva, lo
anterior explica que la albúmina recorra una mayor distancia que la
gamma-globulina cuando se sitúen en un campo eléctrico.
Hay numerosos sistemas de electroforesis de proteínas comercialmente
disponibles. En clínica el suero es la muestra de elección. Se puede usar
plasma pero, en ese caso se observará una banda adicional de fibrinógeno.
También se puede analizar orina y líquido cefalorraquídeo si se aumenta su
contenido proteico (hasta 20-30 g/l) por ultracentrifugación, diálisis u otras
técnicas de concentración.
Los pasos a seguir en una electroforesis se pueden resumir en:

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1. Separación electroforética mediante un campo eléctrico
2. Fijación de las proteínas sobre el soporte
3. Revelado de las proteínas para identificar su presencia y separación.
Se realiza mediante colorantes ácidos, negro amido, rojo Ponceau... que
se fijan sobre las funciones básicas de las proteínas. El exceso de
colorante se arrastra con mezclas acético-agua, o metanol-acético, según
el colorante utilizado con tal de que se decolore el soporte sin elución del
colorante fijado a las proteínas.
4. Cuantificación de las fracciones electroforéticas mediante fotómetros
especiales (densitómetros) que permiten cuantificar el colorante fijado a
diferentes distancias del punto de aplicación, y con ello la representación
gráfica de la separación (proteinograma: gráfica que representa las
fracciones proteícas del suero sanguíneo).
Cuando el soporte utilizado para llevar a cabo el desarrollo electroforético es
de “acetato de celulosa” las principales fracciones proteícas son

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• La fracción de albúmina (aprox. 64.5%): la que más migra respecto
al punto de aplicación de la muestra (cátodo)
• Las globulinas que se subdividen en las siguientes fracciones: alfa 1
(a-1 globulinas, aprox. 3.6%), alfa 2 (a-2 globulinas, aprox. 6.5%),
beta (ß-globulinas, aprox. 12.6%), y gamma (? globulinas,
inmunoglobulinas o anticuerpos, aprox. 7.9%, es la banda que menos
se desplaza y en sueros no patológicos es la banda más ancha).
El fibrinógeno aparece entre las ß y ? globulinas cuando la muestra utilizada
es plasma no así en el suero (se ha consumido en la coagulación).
Cuando el soporte es gel de agarosa las ß-globulinas, se dividen en: ß-1 y
ß-2.
Es muy importante tener en cuenta que cada fracción está formada por
un conjunto de proteínas con una movilidad electroforética
semejante aunque muy distintas en cuanto a su estructura y
función. Además, excepto la albúmina, el resto de las fracciones
corresponden a grupos de proteínas, por ello, aunque el resultado de la
fracción sea normal, puede existir variación porcentual en sus componentes.
Conviene corroborar los resultados del proteinograma con ensayos
inmunológicos más específicos como la inmunodifusión radial o la
inmunoelectroforesis.
4. INMUNOELECTROFORESIS
La inmunoelectroforesis es una inmunodifusión en la que se aplica una
corriente eléctrica para separar las proteínas de la muestra.
Esta técnica se realiza en dos fases:
• Electroforesis para separar las proteínas de la muestra en función de
su carga.
• Aplicación de un antisuero, mono o poliespecífico, en un surco
paralelo a la dirección del campo eléctrico. El o los anticuerpos

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difunden durante 18-24h. Si se produce el reconocimiento Ag-Ac se
forman bandas de precipitación.
Se utiliza fundamentalmente para analizar, cualitativamente, alteraciones
de distintas proteínas, especialmente inmunoglobulinas en suero, orina o
líquido cefalorraquídeo.
5. INMUNOELECTROFORESIS EN COHETE
La inmunoelectroforesis en cohete es una técnica cuantitativa equivalente a
la inmunodifusión radial pero, a en la que la placa se expone a un campo
eléctrico.
Al igual que en la inmunodifusión radial, el antisuero (Ac) se incorpora al gel
de manera que el Ac no pueda migrar. En el gel se realizan unos pocillos
(generalmente en el cátodo) que se rellenarán con la muestra o con
diluciones patrón. Una vez depositadas éstas se activa el campo eléctrico. El
Ag se desplaza en la agarosa y precipita al encontrarse con el Ac. La
precipitación va produciéndose a medida que el Ag avanza hacia el ánodo
de manera que al ir disminuyendo la concentración de Ag los bordes
laterales se van acercando hasta unirse. Así, se produce una precipitación
triangular (en estela de cohete). La concentración de Ag de la muestra es
directamente proporcional al área y altura del triángulo. Comparando los
resultados de la muestra con los obtenidos en las diluciones patrón
obtendremos un resultado cuantitativo.

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6. INMUNOFIJACIÓN
La inmunofijación consiste en la separación electroforética de las proteínas
de una muestra seguida del contacto del gel con una tira de acetato de
celulosa impregnada con antisuero. La unión Ag-Ac da lugar a la formación
de bandas de precipitación visulalizadas tras lavar y teñir. Es una técnica
muy rápida que se utiliza especialmente en le detección de bandas
oligoclonales en líquido cefalorraquídeo.
Preguntas de revisión
1. Si pretendiera cuantificar la concentración de proteínas en una muestra de
suero ¿Qué método emplearía?
2. Describa el fundamento del método anterior
3. ¿Sabría idear un protocolo experimental para llevar a cabo dicho método?
4. ¿Sería necesario preparar algún blanco? Razone su respuesta
5. Un paciente con un mieloma:
a) ¿Tendría hiper o hipoproteinemia?
b) Si quisiera identificar la inmunoglobulina que aparece alterada ¿qué técnica
podría utilizar?
c) ¿Y si quisiera cuantificarla?
6. ¿Podría utilizar la espectrofotometría con luz U.V. para cuantificar proteínas?
Conteste razonadamente.
7. La nefelometría difiere de la turbidimetría en:
a) Mide el índice de refracción
b) Ángulo de medida de la luz dispersa
c) Tiene menor sensibilidad
d) Se pueden medir partículas de bajo peso molecular
e) La solución no necesita ser homogénea
8. La nefelometría mide:
a) La luz dispersada
b) La luz transmitida
c) La disminución de la luz transmitida
d) La disminución de la luz dispersada
e) La luz reflejada
9. La turbidimetría mide
a) La luz dispersada
b) La luz transmitida
c) La disminución de la luz transmitida
d) La disminución de la luz dispersada
e) La luz reflejada
10. Conteste razonadamente verdadero o falso a las siguientes afirmaciones de
las medidas nefelométricas
a) Su principal aplicación es en la medida de reacciones Ag-Ac
b) Trabajan con medidas en distintas zonas del espectro.
c) Se hacen en ángulos de 15 a 90º respecto a la luz incidente.

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11. La turbidimetría se puede medir:
a) En turbidímetros especiales.
b) En aparatos con un monocromador de turbidez.
c) En aparatos con un detector especial para la luz dispersa.
d) En cualquier espectrofotómetro o analizador de química clínica.
e) En aparatos con cubetas especiales
12. El ángulo de medida de la luz dispersa en turbidimetría es:
a) 0o
b) 10o
c) 15 a 90o
d) 90o
e) Cualquiera
13. El ángulo de medida de la luz dispersa en nefelometría es:
a) 0º
b) 10º
c) 15 a 90º
d) 90º
e) Cualquiera
14. La longitud de onda que se emplea en las medidas de luz dispersa:
a) Debe ser tal que no se absorba luz por los componentes del suero.
b) Debe ser lo menor posible
c) Deber ser lo mayor posible
15. La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa ¿Por qué?
16 ¿Cuál cree que es el principal inconveniente de las técnicas inmunológicas?
a) Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac se encuentren dentro de la
zona de equivalencia
b) Son técnicas poco sensibles
c) Son técnicas poco específicas
17. La inmunodifusión doble es una técnica cualitativa o semicuantitativa ¿por qué?
18. En un campo eléctrico, una molécula cargada negativamente migra hacia el:
a) Ánodo
b) Cátodo
c) Polo negativo
d) Polo positivo
e) a y d
19. ¿Qué factores afectan a la movilidad de una partícula en el seno de un campo
eléctrico)
a) pH del tampón
b) Fuerza iónica del tampón.
a) Tamaño y forma de la partícula.
b) Potencial del campo.
c) Todos
20. El punto isoeléctrico es:
a) El pH al cual una partícula no se mueve
b) El pH al cual una partícula migra al ánodo
c) El pH al que la carga neta de la partícula es cero.
d) a y c

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e) a y b
21. ¿Cuál es el medio de soporte más empleado en electroforesis?
22. ¿Cuál es el método de elección para la lectura de un espectro electroforético?
a) Nefelometría
b) Turbidimetría
c) Elusión
d) Fotodensitometría
23. Hemos sometido una muestra de suero a una separación electroforética, a pH
8,6, sobre acetato de celulosa
a) ¿Qué componentes se nos han separado en el proceso?
b) ¿A qué cambios en el proceso recurriremos según queramos cuantificar
proteínas o lipoproteínas?
24. ¿Sería conveniente llevar a cabo la electroforesis de proteínas a pH 6? ¿Por
qué?