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Universidad Anáhuac Mayab           Integrantes:
                            •Angélica Bautista
Escuela de Medicina            • Patricio Correa
Proteómica                            •José Mier
Prof. José Escobedo               •Weyller Pam
                             •Jorge Valladares
Técnica

• Consiste en la utilización de anticuerpos para
  detectar el antígeno o los antígenos específicos de
  interés.

• La especificidad de la unión antígeno-anticuerpo
  permite la detección de una única proteína dentro
  de una mezcla compleja de otras proteínas.
¿Como funciona?

• Se siguen una serie de pasos:
• A) separación de macromoléculas por geles de
  electroforesis.
• B) las macromoléculas se transfieren a otra
  matriz.(nitrocelulosa o PVDF)
• C) se bloquea la membrana para evitar la unión de Ac
  utilizados para la detección de la proteína de interés.
• D) la proteína se le une un Ac marcado con una enzima.
• E) se añade un sustrato apropiado el cual reacciona con la
  enzima y se obtiene un producto detectable. (luz)
Diferentes métodos
• Directo
• indirecto
Directo
• El anticuerpo primario marcado se une al antígeno
  de la membrana y reacciona con el sustrato
  originando una señal detectable.
Indirecto
• El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno.
  Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario
  y reacciona con el sustrato.
Ventajas del método directo


• Mucho más rápido ya que sólo se utiliza un anticuerpo.
• • Se elimina la posible reacción cruzada del anticuerpo
  secundario.
• • Se pueden detectar diferentes antígenos utilizando
  diferentes marcajes en diferentes anticuerpos
  primarios.
Desventajas método directo

• La inmunoreactividad del anticuerpo primario
 puede verse disminuida debido al marcaje.

• • El marcaje de los anticuerpos primarios es muy
 cara y difícil.

• • No hay flexibilidad en el marcaje del anticuerpo
 primario de un experimento a otro.
Ventajas método indirecto

• • Se incrementa la sensibilidad ya que cada anticuerpo primario posee
  numerosos epítopos a los que
• puede unirse en anticuerpo secundario marcado, lo que permite la
  amplificación de la señal.
• • Hay disponibles comercialmente una gran variedad de anticuerpos
  secundarios marcados.
• • No se afecta la inmunoreactividad del anticuerpo primario por el marcaje.
• • Se pueden utilizar diferentes marcadores con el mismo anticuerpo
  primario
Desventajas método indirecto

• Puede      producirse   reacción   cruzada   con   el
  anticuerpo secundario, con lo que se obtienen
  marcajes

• inespecíficos.

• • Es más lento ya que se necesita un paso extra de
  incubación.
ELISA:

Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas.
2 métodos: directo e indirecto.
• Se coloca un anticuerpo monoclonal en las paredes
  del (posito).
• Se le agrega una suspensión de sangre u otro fluido.
  Se hace para encontrar el antígeno
  complementario.
• Si se presenta el antígeno se va a pegar al
  anticuerpo que fue pegado al posito.
• Se puede ver como en la muestra del lado izquierdo
  se pego el antígeno al anticuerpo.
• Se le agrega otro anticuerpo monoclonal que va a
  tener una enzima reportera la cual va a ser la
  encargada de mostrar cierto marcaje al unirse al
  complejo antígeno- anticuerpo.
• Se le agrega primero el antígeno, estas pruebas son
  para detectar anticuerpos específicos por ejemplo:
  VIH.
• Se le inyecta la sangre al pocito que puede contener
  los anticuerpos contra el antígeno que fue agregado
  de no serlo, se eliminan en el siguiente paso.
• Del mismo modo el anticuerpo se une al antígeno
  formando un complejo, después al igual que en la
  directa se le inyecta un anticuerpo con una enzima
  reportera que cambiara el colorante de la reacción.
• Al inyectarle un nuevo anticuerpo monoclonal con
  la enzima reportera cambia de color la muestra y se
  detecta.
Técnica de separación
molecular dependiente
 de la distribución de
 cargas moleculares.

     Puede ser:
  • Unidimensional
   • Bidimensional
UNIDIMENSIONAL                BIDIMENSIONAL
• 1 plano de separación       • Usado en el fingerprinting y
• Utilizado en separaciones     si es bien aplicado puede
  rutinarias de proteínas y     detectar todas las proteínas
  ácidos nucleicos.             de una célula.
• Su tipo de soporte es en    • Se usan hojas por mayor
  tubos                         superficie.
• SISTEMA CATIONICO VS ANIONICO
  – Catiónico
     • Si los cationes +++ van hacia el cátodo
  – Aniónico
     • Si se acomodan los aniones --- y van hacia el ánodo.

     • Dependientes del acomodo de los electrodos:
     • CÁTODO – UPPER BATH
     • ÁNODO – LOWER BATH
– Las proteínas pueden tener
  carga + ó -, pero son
  dependientes del pH del
  búfer.
– Gel:
   • 3 secciones:
     Running, Stacking, Sample
– La muestra debe ser
  introducida por un medio no
  convectivo (sucrosa)
– Los electrodos se conectan a
  los extremos de la columna y
  la electricidad pasa por los
  geles.
• TIPOS DE GELES
  – Continuos (menos utilizados)
  – Discontinuos: son múltiples porque
    manejan concentraciones en un mismo
    medio, nos permiten medir ag.
    diferentes.
• GELES DE AGAROSA
  – Son más adecuados para separar ácidos
    nucleicos de alto peso molecular (200
    mil D).
  – Menos acrilamida
  – La agarosa es un polisacárido que
    disminuye la concentración de
    acrilamida
  – Utilizados para elaborar mapas
    genéticos
• Técnica de la biología molecular usada para separar
  las proteínas por peso molecular. Puede separar
  DNA Y RNA al igual.



• Técnica de gran alcance para conocer y resolver
  mezclas proteicas.
SDS PAGE
• El dodecyl sulfato de sodio.- Es un detergente a
  aniónico que desnaturaliza las proteínas, lo que las
  disocia en subunidades.


• Esto hace que en el momento de la electroforesis
  las subunidades puedan ordenarse por
  tamaño, peso, plegamiento, etc.
1. Solución proteica se mezcla con SDS.

2. EL SDS liga los residuos de aminoácidos con pesos
   moleculares similares y les otorga una carga negativa
   uniforme, lo que lineariza las moléculas por tamaño.

3. Se pone en el gel, en los respectivos pocitos, y se
   agrega un tinte para que sigua el movimiento.
   (Electroforesis)
SDS PAGE
• Gel empilador.- Gel de poliacrilamida de poros
  grandes (4%). Almacenador. PH 6.8, este gel se
  hecha sobre el gel de resolución.

• Gel de resolucion.- Gel de poliacrilamida de poros
  restrictivos, pequeños. PH de 8.8, aquí las
  moléculas se separan según su talla.

• Ambos usan como buffer el Tris.
• El gel de poliacrilamida.- Separa moléculas de
  proteínas según talla y carga.
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Elisa pasos, elaborado por josé mier

  • 1. Universidad Anáhuac Mayab Integrantes: •Angélica Bautista Escuela de Medicina • Patricio Correa Proteómica •José Mier Prof. José Escobedo •Weyller Pam •Jorge Valladares
  • 2.
  • 3. Técnica • Consiste en la utilización de anticuerpos para detectar el antígeno o los antígenos específicos de interés. • La especificidad de la unión antígeno-anticuerpo permite la detección de una única proteína dentro de una mezcla compleja de otras proteínas.
  • 4. ¿Como funciona? • Se siguen una serie de pasos: • A) separación de macromoléculas por geles de electroforesis. • B) las macromoléculas se transfieren a otra matriz.(nitrocelulosa o PVDF) • C) se bloquea la membrana para evitar la unión de Ac utilizados para la detección de la proteína de interés.
  • 5. • D) la proteína se le une un Ac marcado con una enzima. • E) se añade un sustrato apropiado el cual reacciona con la enzima y se obtiene un producto detectable. (luz)
  • 6.
  • 7.
  • 9. Directo • El anticuerpo primario marcado se une al antígeno de la membrana y reacciona con el sustrato originando una señal detectable.
  • 10. Indirecto • El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato.
  • 11. Ventajas del método directo • Mucho más rápido ya que sólo se utiliza un anticuerpo. • • Se elimina la posible reacción cruzada del anticuerpo secundario. • • Se pueden detectar diferentes antígenos utilizando diferentes marcajes en diferentes anticuerpos primarios.
  • 12. Desventajas método directo • La inmunoreactividad del anticuerpo primario puede verse disminuida debido al marcaje. • • El marcaje de los anticuerpos primarios es muy cara y difícil. • • No hay flexibilidad en el marcaje del anticuerpo primario de un experimento a otro.
  • 13. Ventajas método indirecto • • Se incrementa la sensibilidad ya que cada anticuerpo primario posee numerosos epítopos a los que • puede unirse en anticuerpo secundario marcado, lo que permite la amplificación de la señal. • • Hay disponibles comercialmente una gran variedad de anticuerpos secundarios marcados. • • No se afecta la inmunoreactividad del anticuerpo primario por el marcaje. • • Se pueden utilizar diferentes marcadores con el mismo anticuerpo primario
  • 14. Desventajas método indirecto • Puede producirse reacción cruzada con el anticuerpo secundario, con lo que se obtienen marcajes • inespecíficos. • • Es más lento ya que se necesita un paso extra de incubación.
  • 15. ELISA: Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. 2 métodos: directo e indirecto.
  • 16.
  • 17. • Se coloca un anticuerpo monoclonal en las paredes del (posito).
  • 18. • Se le agrega una suspensión de sangre u otro fluido. Se hace para encontrar el antígeno complementario.
  • 19. • Si se presenta el antígeno se va a pegar al anticuerpo que fue pegado al posito.
  • 20. • Se puede ver como en la muestra del lado izquierdo se pego el antígeno al anticuerpo.
  • 21. • Se le agrega otro anticuerpo monoclonal que va a tener una enzima reportera la cual va a ser la encargada de mostrar cierto marcaje al unirse al complejo antígeno- anticuerpo.
  • 22. • Se le agrega primero el antígeno, estas pruebas son para detectar anticuerpos específicos por ejemplo: VIH.
  • 23. • Se le inyecta la sangre al pocito que puede contener los anticuerpos contra el antígeno que fue agregado de no serlo, se eliminan en el siguiente paso.
  • 24. • Del mismo modo el anticuerpo se une al antígeno formando un complejo, después al igual que en la directa se le inyecta un anticuerpo con una enzima reportera que cambiara el colorante de la reacción.
  • 25. • Al inyectarle un nuevo anticuerpo monoclonal con la enzima reportera cambia de color la muestra y se detecta.
  • 26. Técnica de separación molecular dependiente de la distribución de cargas moleculares. Puede ser: • Unidimensional • Bidimensional
  • 27. UNIDIMENSIONAL BIDIMENSIONAL • 1 plano de separación • Usado en el fingerprinting y • Utilizado en separaciones si es bien aplicado puede rutinarias de proteínas y detectar todas las proteínas ácidos nucleicos. de una célula. • Su tipo de soporte es en • Se usan hojas por mayor tubos superficie.
  • 28. • SISTEMA CATIONICO VS ANIONICO – Catiónico • Si los cationes +++ van hacia el cátodo – Aniónico • Si se acomodan los aniones --- y van hacia el ánodo. • Dependientes del acomodo de los electrodos: • CÁTODO – UPPER BATH • ÁNODO – LOWER BATH
  • 29. – Las proteínas pueden tener carga + ó -, pero son dependientes del pH del búfer. – Gel: • 3 secciones: Running, Stacking, Sample – La muestra debe ser introducida por un medio no convectivo (sucrosa) – Los electrodos se conectan a los extremos de la columna y la electricidad pasa por los geles.
  • 30.
  • 31. • TIPOS DE GELES – Continuos (menos utilizados) – Discontinuos: son múltiples porque manejan concentraciones en un mismo medio, nos permiten medir ag. diferentes. • GELES DE AGAROSA – Son más adecuados para separar ácidos nucleicos de alto peso molecular (200 mil D). – Menos acrilamida – La agarosa es un polisacárido que disminuye la concentración de acrilamida – Utilizados para elaborar mapas genéticos
  • 32.
  • 33. • Técnica de la biología molecular usada para separar las proteínas por peso molecular. Puede separar DNA Y RNA al igual. • Técnica de gran alcance para conocer y resolver mezclas proteicas.
  • 34. SDS PAGE • El dodecyl sulfato de sodio.- Es un detergente a aniónico que desnaturaliza las proteínas, lo que las disocia en subunidades. • Esto hace que en el momento de la electroforesis las subunidades puedan ordenarse por tamaño, peso, plegamiento, etc.
  • 35. 1. Solución proteica se mezcla con SDS. 2. EL SDS liga los residuos de aminoácidos con pesos moleculares similares y les otorga una carga negativa uniforme, lo que lineariza las moléculas por tamaño. 3. Se pone en el gel, en los respectivos pocitos, y se agrega un tinte para que sigua el movimiento. (Electroforesis)
  • 36.
  • 37.
  • 38. SDS PAGE • Gel empilador.- Gel de poliacrilamida de poros grandes (4%). Almacenador. PH 6.8, este gel se hecha sobre el gel de resolución. • Gel de resolucion.- Gel de poliacrilamida de poros restrictivos, pequeños. PH de 8.8, aquí las moléculas se separan según su talla. • Ambos usan como buffer el Tris.
  • 39. • El gel de poliacrilamida.- Separa moléculas de proteínas según talla y carga. • SDS • Electrodos http://www.youtube.com/watch?v=IWZN_G_pC8U