1. Universidad Nacional Autónoma de México
Centro de Ciencias Genómicas
Programa de Genómica Evolutiva
Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas
“Efecto de la composición lipídica en la
localización de la maquinaria encargada de la
replicación del ADN, la división celular y la
síntesis de pared celular en Sinorhizobium meliloti
1021”
Comité tutoral: Anteproyecto que presenta:
Dr. Miguel Ángel Cevallos
Francisco Pedraza
Dr. Otto Geiger
López
Dr. José Luis Puente

2. Lemon and Grossman 2000
Localización
del
replisoma
E. coli
Localización
del divisoma
Localización de Margolin, William, 2000
la maquinaria de
síntesis de
parded GFP-PbpH
. Scheffers and Pinho 2005

3. Matsumoto, Kouji et al., 2006
Fluorescencia
específica para
PE
Ro- biotinilado
(Cinnamicina) Fluorescencia
E. coli Barak, Imrich et al., 2008
específica para
lípidos aniónicos
(PG y CL)
FM4-64
B.
subtillis
E. coli
B. subtillis
Fluorescencia
específica para
CL Mileykovskaya and Dowhan, 2005

4. Objetivo General
• Sopesar el efecto que tiene la composición
lipídica de la membrana en la determinación
de la morfología celular y su estrecha
relación con la localización de las
maquinarias encargadas de la replicación, la
división celular y la síntesis de pared
celular, así como la consecuencia que tiene
este efecto sobre el ciclo celular de la
bacteria.
• Para ello usaremos una serie de mutantes
que sabemos tienen una composición
lipídica diferente y una morfología anómala y
determinaremos la posición de estas

5. Sinorhizobium meliloti 1021
Cromosoma
3.65 Mb
pSymb
1.68 Mb
pSymA
1.35 Mb
http://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime.cgi

6. Sinorhizobium meliloti 1021 como
modelo
• Organismo que se puede manipular
genéticamente.
• Se conoce la secuencia de su
genoma.
• Presenta diferencias importantes con
los modelos mejor estudiados
• Diferente composición lipídica
• Ausencia de MreB.
• Localización de los origenes de replicación cercanos
a los polos.
• Presencia de una segunda proteína FtsZ

7. Sinorhizobium meliloti 1021 como
modelo
• Se conocen bien las vías de síntesis de
lípidos de membrana, incluyendo vías
alternas para los principales fosfolípidos
presentes en la membrana.
• Se cuentan con mutantes en estas vías
(cambian proporciones y composiciones
de lípidos)

8. S. meliloti 1021
CDP- diacilglicerol
Fosfatidil serina sintasa
Fosfatidil-serina
Fosfatidil serina decarboxilasa
Fosfatidil Etanol-amina
Fosfatidil
colina sintasa
Fosdatiidil metilo transferasa
Mono-metil- PE
Di-metil-PE
Fosfatidil Colina

9. Cepa Mutación Característica. Composición de lípidos (%)
Membrana silvestre.
1021 Ninguna Componente
mayoritario PE
∆pss. Primer
enzima de vía de Comopenente principal
CS111 síntes de PC, de membrana PG.
por medio de Ausencia de PS y PE
PE.
∆psd. Segunda
Comopenente principal
enzima de la vía
de membrana PC.
MAV01 de síntesis de Ausencia de PE y
PC por medio de
presencia al ta de PS
PE.
∆pmtA;∆pcs
Tercer enzima
de la vía de Componente pricipal de
OG10017 síntesis de PC, membrana. Ausencia
por medio de PE de PC
y única enzima
de la vía directa.

10. Vías de síntesis de
CDP- diacilglicerol
Cardiolipina
Fosfatidil glicerol-fosfato sintasa
Smc02134
Fosfatidilglicerol-Fosfato
¿¿¿???
Fosfatidil glicerol-fosfato Fosfatasa
Fosfatidil Glicerol
Cardiolipina
Cardiolipina
Cardiolipina sintasa
Cardiolipina

11. Cepa Mutación Características. Composición de lípidos (%)
Membrana silvestre.
1021 Ninguna Componente
mayoritario PE
∆cls
Enzima Componente
QN8 encargada de la mayoritario PE. CL se
síntesis de CL en reduce en un 50%
la vía conservada.
∆Smc02134
Componente
Gen involucrado
MAV03 mayoritario PE. CL se
en la vía de
reduce en un 50%
síntesis de CL
∆cls; ∆Smc02134
Mutante en dos
Componente
de las tres vías de
MAV04 síntesis de CL mayoritario PC. CL se
reduce en un 25%
descritas en S.
meliloti 1021

12. Objetivos particulares
• Construir una serie de fusiones traduccionales e
inducibles con la proteína GFP y proteínas pertenecientes
al: I) dividosoma (proteínas FtsZ1 y FtsZ2); II) al replisoma
(subunidades α y τ de la PolIII), y III) la maquinaria
encargada de la síntesis de la síntesis de pared celular (la
proteína FtsI).
• Generar mutaciones sobre los genes de FtsZ1, FtsZ2, α y τ
, dentro de la cepa silvestre y complementarlas con las
fusiones previamente realizadas para determinar que las
fusiones con GFP son funcionales.

13. Objetivos particulares
• Determinar la posición que guardan las proteínas de
fusión dentro de la célula en los 7 fondos genéticos.
• Determinar la presencia y la posición de los dominios
lipídicos enriquecidos en algunos fosfolípidos con
colorantes específicos, NAO para la cardiolipina, Ro
09-0198 (Cinnamycina) para la fosfatidiletanolamina, y
FM4-64 para los fosfolípidos aniónicos, en cada uno
en los 7 diferentes fondos genéticos.
• Determinar si existe una correlación entre la
presencia de los dominios enriquecidos de
fosfolípidos y la posición de las proteínas de fusión
antes listadas, en los 7diferentes fondos genéticos.

14. Estrategia metodológica

15. Fusiones traduccionales
EGFP
Características
FtsZ1 EGFP del plásmido:
FtsZ2 EGFP De bajo número
de copias
Promotor
α EGFP
constituvo o
inducible
τ EGFP
Marcador de
selección
FtsI EGFP

16. Análisis de las
construcciones
• Determinar que las fusiones se
expresen
• Verificar que las fusiones puedan
ser detectadas por medio de
microscopía de fluorescencia.
• Comprobar que el ciclo celular no se
afecte
• Verificar que la morfología de las
diferentes cepas de bacterias no se
afecte.

17. Complemento de las
construcciones KmR

18. Localización de las proteínas de
fusión Kahng and Shapiro et al., 2003
Orígenes de replicación
del cromosoma
A
B
T
Localización relativa de las
Longitud de la
célula en µm.
proteínas
A B
T T

19. Tinción específica para
fosfolípidos
10- NAO
FM4-64
Ro 09-0198
(Cinnamycina)

20. Evidencia previa.

21. Localización de la subunidad
alfa en la cepa silvestre 1021
α- GFP
GFP

22. Localización de la subunidad
alfa en la cepa mutante CS111
GFP α-GFP

23. Localización de la subunidad
alfa en la cepa mutante MAV01
α-GFP
GFP

24. Localización de la subunidad
alfa en la cepa mutante OG10017
α- GFP
GFP