Las enzimas de restricción cortan el ADN en secuencias específicas. La PCR permite amplificar fragmentos de ADN mediante la repetición cíclica de la desnaturalización del ADN, la hibridación de cebadores y la extensión de las cadenas por la ADN polimerasa. Las ligasas unen los extremos de ADN cortados por enzimas de restricción mediante la formación de enlaces fosfodiéster.

1. Cuestionario genética 1era unidad
1 Que aplicaciones tiene la DNasa?
R=En ingeniería genética estas enzimas son usadas para cortar residuos en los
extremos de las moléculas de ADN (exo-desoxirribonucleasa, un tipo de
exonucleasa.otras cortan en cualquier punto de la cadena (endo-desoxiribonucleasas,
un subconjunto de endonucleasas, En medicina se usas
para el tratamiento de los pacientes con fibrosis quística,
2 Cómo funciona la transcriptasa reversa?
La transcriptasa inversa es una enzima multifuncional que sintetiza una
molécula de ADN a partir de ARN.
En primer lugar sintetiza una cadena de ADN a partir del ARN que le sirve de
patrón. A continuación destruye la cadena original de ARN y por último construye
una segunda cadena de ADN complementaria de la primera. De esta forma se
obtiene una doble cadena de ADN que puede ser integrada en un Cromosoma. en
los retrovirus les permite transformar su ARN en el ADN, con el objeto de integrar
su material hereditario al de la célula, para lograr de esta manera que cuando ésta
se replique, el producto sea nuevos virus, llamados en su etapa temprana
"viriones". La transcriptasa inversa es una de las cuatro enzimas contenidas en el
interior del VIH que participan en la invasión y replicación, las otras tres son la
ribonucleasa H, la integrasa y la proteasa.
3 Que es la actividad estrellas?
Es la actividad que presentan algunas enzimas de tipo II en condiciones no
óptimas (pH, fuerza iónica, presencia de contaminantes), caracterizada por un
descenso en la especificad del sitio de reconocimiento.
4 Cual es el mecanismo de acción de las enzimas de restricción?
Un enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) posee un mecanismo
que puede reconocer una secuencia concreta de nucleótidos en una molécula de
ADN y cortarla en ese punto preciso, llamado sitio o diana de restricción. En
ocasiones, el enzima reconoce una secuencia concreta, pero no corta en ese sitio,
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2. Cuestionario genética 1era unidad
sino en otro más alejado. Las secuencias de restricción restringen, por tanto, la
actividad del enzima a esas secuencias, que no corta en otras. Los sitios de
restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, cuya secuencia es
reconocida por el enzima. Otros enzimas son capaces de ligar moléculas de ADN
cortadas por los enzimas de restricción. Son las llamadas Ligasas.
5 Que consideraciones debes tomar en cuenta en una reacción de
restricción?
Las enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de
ADN. Lo hacen en forma específica por lo que se debe tener en cuenta que
cuando cortan lo hacen de la siguiente forma.
Enzimas que generan “extremos romos” (parejos)
Enzimas que generan “extremos cohesivos” (desparejos). Estos extremos
“colgantes” de simple cadena pueden pegarse con otros extremos de cadena
simple que tengan la secuencia complementaria. Las enzimas encargadas de
unir los extremos de ambas cadenas se denominan ligasas.
También debe condirarse Pureza del DNA pues la reacción de enzimas es muy
dependiente de la pureza, contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo,
etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.
2. Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en
lo que respecta a su estabilidad y actividad.
3. DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ .
4. Contaminantes con carga (-).
5. DNA contaminado con otro DNA.
6. Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.
7. Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es
reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej.
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3. Cuestionario genética 1era unidad
si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para
la enzima).
8. Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para
trabajar en condiciones óptimas.
6 Como funciona la ADN polimerasa?
La ADN polimerasa es la principal enzima de la replicación. Funciona de la forma
siguiente; Partiendo de una cadena inicial la ADN polimerasa añade nucleótidos
complementarios a la cadena molde extendiendo la nueva cadena de ADN en
dirección 5’- 3’. La ADN polimerasa también se encarga de la reparación del ADN
asociada a la replicación.Hay 5 ADN polimerasas diferentes bien caracterizadas,
diferenciándose en su localización, actividad y sensibilidad a los inhibidores: alfa,
beta, gamma, delta y épsilon. Las ADN polimerasas delta y epsilon dirigen la
replicación de la cadena conductora o “leading strand” que es la cadena que crece
de 5' a 3' en mismo sentido que crece la nueva copia de ADN. La ADN polimerasa
epsilon parece que también está involucrada en un tipo de reparación del ADN.
Además, las ADN polimerasas gamma, delta y epsilon tienen actividad
exonucleasa 3'-5' y, por tanto, son capaces de eliminar los nucleótidos del extremo
3' que han sido incorporados incorrectamente en un proceso conocido como
corrección de pruebas. La ADN polimerasa alfa participa en el proceso de
replicación del ADN dirigiendo la replicación de la cadena retardada o “lagging
strand” que es la cadena que crece de 3' a 5' que es el sentido contrario al del
crecimiento global de la nueva copia de ADN. La ADN polimerasa beta se encarga
de los procesos de reparación del ADN. La ADN polimerasa gamma realiza la
replicación del ADN mitocondrial.
7 Cual es el fundamento de la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica usada para
amplificar el ADN, permite replicar entre cientos de miles y millones de veces en el
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4. Cuestionario genética 1era unidad
transcurrir de pocas horas en in vitro pequeñas cantidades de ADN a través del
termociclado, usando cambios de temperatura a intervalos de tiempo fijos. la PCR
puede crear numerosas copias de ADN a partir de bloques de construcción de
ADN llamados trifosfatos dinucleoside o dNTPs. La PCR está basada en tres
paso: desnaturalización, hibridación y elongación. La desnaturalización es el
primer paso en el ciclo y hace que el ADN para fundir mediante la interrupción de
los enlaces de hidrógeno entre las bases resultantes en ADN de una sola hebra.
El recocido reduce la temperatura suficiente para permitir la unión de cebadores
de oligonucleótido a la plantilla de ADN. Durante el alargamiento paso ADN
polimerasa sintetizar nuevo ADN de doble hebra. Estas reacciones se repiten
cíclicamente entre veinte y cuarenta. La muestra se calienta, en el primer paso,
hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que
se conoce como "desnaturalización". En el segundo paso, la temperatura se
reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de
nucleótidos (oligonucleóridos) con cada una de las hebras separadas del ADN
molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el
laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de
ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el
apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se denomina
"iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que
unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar, una enzima
ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos,
sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para
ello, la ADN polimerasa usa desoxidonucleósidos trifosfato (dNTPs) agregados a
la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está
condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del
primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el
tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se
encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El
resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la
amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers.El
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5. Cuestionario genética 1era unidad
producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento
génico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores
empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los
genes.
8 Cual es el mecanismo de acción de las ligasas?
Las ligasas son enzima que realizan la unión entre dos moléculas de gran
tamaño, dando lugar a un nuevo enlace químico; generalmente, sucede junto con
la hidrólisis de un compuesto de alta energía, como el ATP,o NAD desdoblándose
en fragmentos que se liberan de forma sucesiva y utilizando su energía de enlace
para que dicha reacción tenga lugar, utilizando únicamente .su energía de enlace
para realizar la soldadura de la hebra. Realizan enlaces C-C, C-S, C-O y C-N.
También catalizan la formación del enlace covalente fosfodiéster entre el grupo 3’
–OH de un extremo y el grupo fosfato 5’ del otro.
9 Que consideraciones debemos tomar en cuenta en una reacción en cadena
de la polimerasa?
Lo que debemos tomar en cuenta para una reacción en cadena de la polimerasa
son los siguientes puntos:
Sección de las concentraciones óptimas de reactivos, parámetros del protocolo y
equipamiento.
El segmento de ADN, (ADN molde).
Selección y concentración de la enzima.
Diseño y concentración de los cebadores.
Composición del buffer de reacción y aditivos.
Parámetros del programa de amplificación.
Especificidad y sensibilidad analíticas.
10 Describe el mecanismo de acción de 2 enzimas modificadores externos?
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6. Cuestionario genética 1era unidad
1.Fosfatasa Alkalina (AP): Remueve el grupo fosfato presente en el extremo 5 de
la molécula de DNA.
.2. Kinasa Polinucleotídica: Agrega grupos Fosfatos en el extremo 5, transfiere -
PO4 desde ATP a 5-OH de ss o ds DNA o RNA
3. DNA Metilasa (dam & dcm) : Transfieren grupos metil en residuos internos de
A o C en secuencias específicas para producir DNA duplex metilado.
4. Transferasa Terminal deoxinucleotídica: Agrega 1 o más deoxinucleotidos
sobre el extremo 3 de una molécula DNA.
5. DNA Metilasa: Transfiere grupos metil en residuos internos de A o C en
secuencias específicas para producir DNA duplex metilado.
Referencias
Rodriguez, R. S., Sosa, H., Selman, M., Nieto, G. G., Martinez, H., Fernández
Masó, J. R., ... & Musacchio Lasa, A. (1997). European Patent No. EP 0474313.
Munich, Germany: European Patent Office.
Izquierdo Rojo, M. (1999). Ingeniería genética y transferencia génica. Madrid:
Pirámide, 335.
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