Biología del desarrollo embrionaria en extremidades de pollo

1. Expression of Laminin genes during the development of the
apical ectodermal ridge (AER) in the chick embryo.
J.C Garrigues and L.Statuto. Departamento de biologia animal. Lisboa, Portugal.
Abstract
La expresión de Fgf8 actúa como señal inductora de las extremidades durante el desarrollo
embrionario, y puede mantener la proliferación de las células mesenquimales del brote. Este
factor paracrino tiene un patrón de expresión que durante determinados estadios del
desarrollo del embrión se restringen a la cresta ectodérmica apical (AER), por lo que permite
ser utilizado como modelo de control para la expresión de otros factores. La Laminina α5, es
una glicoproteína heterotrímerica cuya expresión durante el desarrollo embrionario se da en
distintas partes del embrión. Por este motivo, el objetivo de este estudio fue, a partir de
embriones de pollo, y basándonos en el modelo de expresión del Fgf8 detectado por
hibridación in situ, intentar verificar si la expresión de la Laminina α5 sigue un patrón similar
a éste, o por el contrario, se expresa en otras zonas además del AER. Lo que pudimos
observar fue que la expresión de la Laminina α5, a diferencia del de Fgf8, tiene lugar en más
zonas del ectodermo del embrión, y no se restringe únicamente al del AER.

2. Desarrollo de las extremidades y AER
El inicio del desarrollo de las extremidades en embriones de gallina comienza a ser evidente
hacia las 51-56 hs de incubación (1). Las extremidades serán originadas gracias a la
contribución de dos estructuras embrionarias, el plato lateral del mesodermo y los somitas,
que derivan del mesodermo paraxial. El primero será el encargado de dar lugar a todas las
estructuras de los miembros, con excepción de la musculatura, que será originada por la
migración de las células precursoras miogénicas desde los somitas hacia los brotes de los
miembros.
El desarrollo de las extremidades está bajo el control, principalmente, de una estructura que
se encuentra justamente envolviendo a éstos brotes, denominada AER (apical ectoderm
ridge). Esta estructura está formada por un epitelio columnar pseudoestratificado, que está
bajo la constante presencia de distintos morfogenes que lo mantendrán en un estado
dinámico (1). Se podría decir que el AER maduro se diferencia por presentar una banda
compacta de epitelio pseudoestratificado recorriendo la zona más distal del brote. Esta
estructura ya madura del AER sólo será visible transcurridas aproximadamente 24hs tras el
inicio de la formación del brote del miembro (1).
El AER, entre otras cosas, se encarga de mantener una población de células en estado
indiferenciado y en constante proliferación en la zona más distal del miembro, denominada
PZ (“progress zone”). La PZ es una capa de células mesodérmicas que está bajo la influencia
del AER.
Las células mesodérmicas de esta zona que se diferencian en primer lugar darán lugar a los
elementos proximales de los miembros, mientras que las células que permanecen un mayor
período en el PZ, bajo la influencia del AER, darán lugar a los elementos distales de los
miembros. Por lo que se podría concluir que el AER, dado que mantiene el estado
proliferativo del PZ, es necesario para el crecimiento y el patronamiento del axis próximo-
distal del miembro. Se cree que el tiempo que pasen las células mesodérmicas bajo la
influencia del AER será relevante en su futura identidad próximo-distal ( P/D), siendo estas
células distales quienes dependerán durante un período mayor de tiempo del AER (3). De
hecho, distintos análisis moleculares demuestran que la adquisición de la identidad P/D,
dependerá del tiempo en que estás células indiferenciadas en estado proliferativo presentes
en la zona distal del PZ, permanezcan bajo la influencia del AER (3).

3. Estudios iniciales, llevados acabo en los años 50 por Saunders, como la extracción del AER a
embriones durante el desarrollo de los miembros mostró qué tan importante era esta
estructura para que este proceso fuese llevado a cabo, ya que en aquellos embriones en que
el AER era extirpado no se formaba aquella extremidad.
Interesantemente, existía un correlación entre la fase del desarrollo en que el AER era
extirpado, mostrando que cuánto más tarde fuese llevado a cabo este procedimiento, más
estructuras de la zona proximal de los miembros llegaban a formarse. Estos estudios por
tanto apoyaban la teoría de que los elementos esqueléticos de los miembros se formaban
siguiendo un secuencia próximo-distal, siendo las estructuras más proximales las primeras en
formarse (1).
Morfogenes y AER
Un morfogen es una molécula que gracias a la creación de un gradiente es capaz de
determinar el destino de un determinado grupo celular. El desarrollo de las extremidades en
los vertebrados es producto de un bucle de realimentación en el que intervienen distintos
morfogenes tales como Wnt, Sonic Hedgehog (Shh), Gremlin y FGFs (1).
En la segunda mitad del siglo XX fueron realizados numerosos experimentos con el objetivo
de comprender la funcionalidad de éstas moléculas en el desarrollo embrionario, sobretodo
en el modelo aviar. Se sabe que la inducción de la AER está dirigida por interacciones
complejas entre las vías de sañalización de FGFs, Wnt, β- catenina y las BMP (Bone
morphogenetic proteína), que operan en el ectodermo y mesodermo.
Los experimentos clásicos de Harrison:
Uno de estos experimentos fue bloquear con barreras impermeables la comunicación entre
el mesodermo intermedio y la placa lateral del mesodermo en embriones de pollo en los
estadios 13 y 15 de desarrollo. El resultado fue la inhibición del desarrollo de la extremidad,
sugiriendo así que debería existir alguna señal proveniente del mesodermo intermedio que
actuase sobre el mesodermo de la placa lateral induciendo la formación de la extremidad.

4. Aunque estos experimentos permitieron la identificación de las áreas del embrión en donde
se formaban las extremidades y la capacidad inductiva del mesodermo intermedio, no fueron
capaces de demostrar cuál era la naturaleza molecular del inductor o inductores.
Por un lado, se podrían destacar aquellos factores pertenecientes a la familia del factor de
crecimiento de fibroblastos (FGF) y otros a la familia Wingless (Wnt), que se expresan en el
mesodermo intermedio y actúan como inductores endógenos de la extremidad. La expresión
de Fgfs actúa de forma sinérgica con la de Wnt, siendo suficiente como para inducir el
desarrollo del miembro (2).
Los FGFs (Fibroblast growth factor) son factores paracrinos que activan diversas vías de
transducción necesarias en diversos procesos del desarrollo. Se ha visto que algunos
miembros de los FGFs juegan un papel vital en el mantenimiento del AER y en la formación
de las extremidades.
Uno de los morfogenes que se ha visto más involucrado en el desarrollo de las extremidades
es el Fgf8. Este factor es expresado tanto a nivel del mesodermo intermedio como en el
ectodermo de los brotes de las extremidades durante el inicio de su desarrollo, y su expresión
parece marcar a los precursores del AER. Gracias a la implantación de perlas de heparina de
100-150 µm que liberaban FGF-8 se demostró que estas moléculas eran capaces de inducir la
formación de extremidades ectópicas en el flanco del embrión. Lo mismo ocurre con la
aplicación de los FGF-1, FGF-2 y FGF-4, sin embargo estas moléculas no se expresan en el
mesodermo intermedio, tal como Fgf8, por lo que fueron descartados como los inductores
endógenos de la formación de las extremidades. Su expresión es detectada en la superficie
del ectodermo antes y durante las primeras fases de la extrusión del miembro. Esto lleva a
pensar que la principal función de Fgf8, en esta zona, es de estimulación del crecimiento de
las extremidades (2,11).
Otro morfogen involucrado en la inducción de las extremidades es Wnt2b que al igual que
FGF-8 se expresa en el mesodermo intermedio y en la placa lateral del mesodermo de la
extremidad anterior en el embrión de pollo. Estas moléculas son capaces de inducir la
formación de extremidades ectópicas al igual que Fgf-8 y están a su vez implicadas en la
inducción del gen FGF10 en la placa lateral del mesodermo.

5. La inhibición de la señalización de Wnt, a su vez bloquea la expresión de Fgf10,
observándose que no hay formación de las extremidades (Imagen 1). Esto demuestra que
Fgf10 pertenece a la cascada molecular de inducción de la formación de las extremidades
(9,11). Estos datos señalan que existen distintas moléculas de la familia Wnt que se expresan
diferencialmente en los campos embrionarios de las extremidades y que están involucradas
en la formación de éstas, por ejemplo al inducir la expresión del gen Fgf10. Sin embargo, se
ha determinado que sólo aquéllos morfogenes pertenecientes a la familia de los FGFs son
capaces de rescatar el crecimiento de la extremidad cuando el AER es eliminado (10).
La eliminación del gen Fgf4, que se expresa en la región posterior de la AER, afecta la
expresión la Shh en la ZPA, principal responsable en dirigir la formación del eje antero-
posterior. Wnt7a se ha visto involucrado en la inducción de la expresión de Shh en la ZPA, y
Shh a su vez induce la expresión de Fgf4 a través de la inducción de Gremlin, antagonista de
BMP, permitiendo la expresión de Fgf4. Por lo tanto, al eliminar la expresión de Wnt7a, no
hay expresión de Shh ni de Fgf4, viéndose afectada la formación de las extremidades (Imagen
1) (3,10).
Gracias a todo esto, este factor es utilizado como marcador de la presencia de las células del
AER, ya que durante todo el proceso de formación y actividad del AER el Fgf8 lo acompaña
tanto temporal como espacialmente (1). Por este motivo, en este trabajo se utilizó como
marcador de la formación de AER al morfogen Fgf8 debido a su expresión tan específica a lo
largo de toda ésta zona.
Actividad de Gremlin en la actividad del AER
Gremlin es una proteína extracelular que actúa como antagonista de las BMPs. Durante el
desarrollo de las extremidades, la vía de señalización de las BMPs debe de ser controlada con
tal de mantener el bucle de señalización entre la ZPA y el AER. Como ya mencionamos
anteriormente para que se produzca un correcto desarrollo de las extremidades, existe un
bucle de retroalimentación positiva, que requiere tanto de la vía de señalización de FGFs, de
Shh y de las BMPs. La función de los Fgfs en el AER es la de controlar el crecimiento de las
extremidades y el mantenimiento de la expresión de Shh a nivel del ZPA.

6. La expresión de los genes que codifican para estos Fgfs es inhibida por las BMPs, quienes a su
vez son inhibidas por Gremlin. La expresión de Gremlin se restringe a la zona distal del
mesénquima del brote del miembro, y parece ser que su expresión tiene un importante papel
en el mantenimiento del AER y de este bucle de retroalimentación del Fgf-Shh (9,10).
Experimentos llevados a cabo en ratones mutantes de Gremlin, muestran que la principal
consecuencia del la pérdida de su expresión en las extremidades afecta a la expresión de Shh,
y por tanto a este bucle de retroalimentación del Fgf-Shh, resultando en un desarrollo
anormal en las estructuras de los miembros (10).
Imagen 1. Interacciones entre los principales factores paracrinos
durante la formación de la extremidad.El Fgf8 a nivel del AER
induce la proliferación de las células del mesénquima en la Zona
de Progreso (PZ). Shh induce a Gremlin, quien bloquea la acción
de BMP, permitiendo la expresión de Fgf4, que es inducido por
Fgf8. Wnt7a, que se expresa en el ectodermo dorsal, también
mantiene la expresión de Shh y de Fgf8.
Lámina basal
La interacción entre células es fundamental para que se puedan llevar a cabo distintos
procesos durante el desarrollo embrionario. Desde el inicio de éste proceso las células
establecen interacciones con su medio extracelular (“extracelular matrix”) y estas
interacciones entre la ECM y otras células será fundamental para que se den distintos
procesos como la proliferación y/o diferenciación celular (7).

7. Las lamininas son glicoproteínas con estructura heterotrimérica, constituidas por tres cadenas
diferentes una α, otra β y otra γ, y gracias a su capacidad de autoensamblaje son capaces de
dar lugar a la lámina basal (BL), quien permitirá la separación del epitelio de las extremidades
de los compartimentos mesenquimales (5). Su principal función es a nivel estructural y de
señalización. Son de gran importancia en determinadas actividades fisiológicas, y su correcta
expresión será fundamental durante la embriogénesis.
Además de las diversas funciones que éstas tienen tras el nacimiento, se ha visto que la BL
tendrá funciones críticas durante el desarrollo embrionario, viéndose involucradas en la
señalización de la proliferación, la migración y diferenciación celular, además de jugar un
papel importante en la adhesión celular (5).
Existen diversos tipos de cadenas de lamininas, siendo sólo algunas de ellas quienes serán de
mayor relevancia durante la embriogénesis y de cuya expresión dependerán para el correcto
desarrollo embrionario (5). Su expresión tiene una distribución específica según el tipo de
tejido, y estará principalmente determinada por la variación en la expresión de las cadenas α
(6). Uno de estos tipos de cadenas de lamininas que parece estar más involucrado en el
proceso del desarrollo, es la Laminina α5. El gen que codifica para esta cadena es expresado
en diversos tejidos, tanto en adultos como durante la embriogénesis, y su producto, la
proteína Lam α5 está presente en la BL dentro de estos tejidos en cuestión (5).
Se ha visto que la Laminina α5 forma parte de la mayoría de BL embrionarias, pero durante el
desarrollo su expresión se irá restringiendo a un determinado conjunto de BL (5). Estudios
sobre su expresión señalan que durante las primeras fases del desarrollo la Laminina α5 se
encuentra en diferentes tejidos, incluyendo la superficie del ectodermo. Hacia estados más
tardíos, pese a ir disminuyendo su expresión en determinadas zonas, en el ectodermo esta
continuará siendo abundante en toda la BL, y permanecerá así durante todas las fases de la
embriogénesis (5).
Los principales receptores de las lamininas son las integrinas, y su correcta expresión
determinará la señalización de las lamininas a nivel intracelular. Las integrinas son unos de los
principales receptores de membrana, y su función es la de permitir la comunicación entre el
medio inter y extracelular (7).

8. Estas proteínas transmembrana poseen una estructura heterodimérica compuesta por dos
cadenas, una α y otra β. Ya han sido identificados más de 20 tipos diferentes de integrinas
que reconocen diferentes ligandos de la ECM, incluyendo entre ellos a diferentes isoformas
de la lamininas (7).
Se ha visto que las integrinas de cadena α3 y α6 son expresadas a nivel del AER, y parecen ser
importantes para la correcta migración y compactación de las células epiteliales que lo
originarán (7). Estudios llevados a cabo por técnicas de inmunohistoquímica mostraban que
durante las primeras fases del desarrollo del brote del miembro se podía detectar, a lo largo
de toda la superficie del ectodermo, la presencia de la integrina de cadena α 3. La diferencia
entre la expresión de las cadenas α 3 y la α 6 era que la primera era detectada tanto a nivel
de la membrana basolateral del AER, como en las células epiteliales que no formaban parte
de éste. Mientras que la integrina de cadena α 6 se expresaba en mayor grado en las células
columnares del AER (8).
La distribución de ambas integrinas de cadenas α 3 y α 6 sugiere, por tanto, que ambas
juegan un papel fundamental en la formación y en el mantenimiento del AER, y cuya
ausencia puede dar lugar a alteraciones de sus propiedades (6). Otros estudios han
demostrado que los dobles mutantes para las cadenas de integrinas α3 y α6 presentaban mal
formaciones a nivel de las extremidades (fusión de los dígitos), lo que se podría relacionar con
defectos en la morfogénesis del AER. Es decir, la inexpresión de este tipo de integrinas
repercute directamente en la formación, y por ende en la actividad del AER (7).
Las integrinas de cadena α6, asociadas con la subunidad β1 o la β4 parecen reconocer
diversas isoformas de lamininas. Aunque también se ha visto que la integrina de cadena
α3β1 está presente a nivel epitelial, y también puede unirse a diferentes cadenas de
lamininas gracias a otros ligandos (6). Y estas, al igual que las integrinas α6 actúan como un
prominente receptor de la Lam α5, la isoforma mayoritaria en la BL. Por lo que la correcta
expresión de las integrinas α6 β1, α6 β4 y α3β1 determinará la unión de su ligando, la
laminina, y por tanto también influirá en la correcta formación y posterior actividad del AER
(7).

9. Nuestro objetivo en este trabajo fue el de observar si la Laminina α 5 tiene el mismo patrón
de expresión que el factor Fgf8 o bien, si durante las diferentes etapas de la embriogénesis se
expresa en otras partes del embrión, y no sólo en el AER.
RESULTADOS:
El estudio del desarrollo de las extremidades en embriones de aves puede ser seguido
gracias a un análisis gradual de los diferentes estadios del desarrollo, hasta su formación
completa. Los embriones fueron clasificados según el método de Hamburguer-Hamilton, que
además del tamaño, también los clasifica según el número de somitas ya formados, por el
tamaño craneal, por la pigmentación de los ojos, por la curvatura del eje corporal, y algo
fundamental para nuestro estudio, que es según el de nivel de desarrollo de las extremidades.
Expresión de Fgf8
Tras las primeras 50-53 hs de incubación, estadio HH14, ya se puede observar la formación de
22 somitas. A partir de esta fase del desarrollo, la dispersión del mesodermo aumenta y se
hará más complicada la determinación de las somitas en estadios posteriores de desarrollo.
En este estadio comienza a verse la zona emergente que dará lugar a las extremidades del
futuro individuo (13). La marcación con el anticuerpo anti-Fgf8 en el AER ya es apreciable,
pese a que aún su expresión es mínima (Figura 1Ay 1B). Durante el estadio HH16,
correspondiente a unas 51-56hs, se puede observar un incremento de entre 4 y 6 somitas. El
embrión presenta ya una leve curvatura entre la zona anterior y la zona posterior del cuerpo,
también el tamaño encefálico es visiblemente mayor al del estadio anterior (13). Durante este
período ya comienza la extrusión del brote de la extremidad. La expresión de Fgf8 durante
esta fase es notablemente superior, y su marcación es observable únicamente a nivel de AER
(Figura 1C y 1D). Durante el estadio HH19, se alcanza el número de 37-40 de somitas. Se
aprecia un notable incremento de tamaño tanto a nivel corporal como a nivel encefálico, pese
a que los ojos aún continúan sin estar pigmentados (13). Los miembros ya son perfectamente
visibles, y la marcación del Fgf8 es aún más intensa. (Figura 1E y 1F).

10. Durante el estadio HH24 las extremidades ya comienzan a sufrir el proceso de elongación.
Continúa sin poder observarse el desarrollo de la parte digital, tanto en la zona anterior como
posterior. Ya se observa la formación de los 43 somitas, y la curvatura del cuerpo del embrión
cada vez es más acentuada. Durante esta fase ya se puede apreciar la pigmentación de los
ojos (13). La expresión de Fgf8 no muestra cambios significativos a nivel de su marcación
(Figura 1G y 1H).
Se podría decir que a partir del estadio HH16-17, el número de células expresando Fgf8
incrementa sustancialmente, y los dominios de expresión se han extendido de forma tal que
cubren toda, o prácticamente toda la zona de las futuras extremidades. En todos los
embriones examinados, la expresión de Fgf8 fue detectada exclusivamente a nivel del
ectodermo, en la zona de formación de las extremidades. No fue detectada su expresión en
otras regiones. Por lo tanto, existe una gran correlación entre los dominios de expresión del
Fgf8 y las regiones donde se da la extrusión del miembro. Por lo que se podría decir que
durante el desarrollo normal de las extremidades, la expresión de Fgf8 está restringida al AER
(Figura 1).

11. 1
1.1Extremidad anterior
(HH 14) (HH16) (HH 19) (HH24)
Extremidad posterior
(HH14) (HH16) (HH19) (HH24)
Figura 1. Desarrollo de las extremidades en embriones de pollo marcados contre Fgf8.
Representación del desarrollo embrionario de los embriones de pollo Gallus Gallus Domesticus
mediante la marcación de la expresión del gen fgf8 en los diferentes estadios HH14, HH16, HH19,
HH24.
Expresión de Laminina α5
La expresión de la Laminina α5 a nivel del AER no es tan marcada como en el caso del Fgf8.
También podemos observar que durante los primeros estadios estudiados (HH16 y HH17) la
expresión de esta proteína en la zona de extrusión del brote está muy poco marcada (Figura
2; 1D y 2I).

12. En fases más avanzadas del desarrollo se puede ver que la expresión de la Lam α5 es un poco
más intensa en la zona del AER, pese a que la marcación en otras zonas del ectodermo
demuestra que su expresión no se restringe únicamente al AER, sino que durante los
diferentes estadios del desarrollo su expresión también será visible en otras zonas del
ectodermo, tal y como se explico anteriormente (Figura 3Dy 4I). Estas imágenes nos permiten
ver como el patrón de expresión de la Laminina α5 difiere respecto al del Fgf8. Mientras que
en la figura 1 únicamente observamos el marcaje del Fgf8 a nivel de la cresta apical
ectodérmica, en la figura 2 podemos ver que la Laminina α5 se expresa de una forma más
global en todo el ectodermo, y la marcación a nivel del AER no es tan marcada como en el
caso del Fgf8.
Figura 2. Desarrollo de las extremidades en embriones de pollo marcados contra Laminina α5.
Embriones con marcación para la expresión del gen de laminina α 5 en distintas fases de desarrollo
embrionario de Gallus Gallus Domesticus (mediante el modelo de determinación de estadios
embrionarios de Hamilton-Hamburguer). (1D:HH14; 2I:HH16; 3D:HH19; 4I:HH24)

13. En cuanto a los resultados obtenidos a partir de la inhibición de Wnt, tanto para la expresión
del la Laminina α5 como para la de Fgf8, estos no fueron los esperados. Tal y como
explicamos anteriormente, Wnt está implicado en la inducción de la expresión de Shh en la
ZPA, quien a su vez interviene en la expresión de Fgf4. Por tanto, la inhibición de Wnt
impedirá la expresión tanto de Shh como de Fgf4, viéndose afectada la correcta formación de
las extremidades. En nuestro caso, los embriones obtenidos que se encontraban en el estadio
HH20 + 20hs fueron completamente normales, sin observarse ningún defecto en el desarrollo
de estos embriones (Figura 3). La marcación de la Laminina α5 no mostraba ninguna variación
con respecto a los embriones de la misma fase sin inhibidor de Wnt (Fig 4; 4.1). Su expresión,
por lo tanto, no se vio afectada en ningún momento, y el desarrollo de las extremidades
resultó normal. Como podemos observar, la expresión de Fgf8 tampoco se vio afectada,
siendo únicamente marcado a nivel del AER de las extremidades (Fig 4;4).
De estos resultados podemos extraer dos hipótesis que permitan explicar el motivo del fallo
del experimento. Lo más probable es que a la hora de colocar las perlas con el inhibidor de
Wnt se haya producido un error y estás no se hayan colocado correctamente donde era
debido. O bien, también cabe la hipótesis de que la concentración del inhibidor no era lo
suficientemente alta para generar el efecto esperado.

14. 4
4.1
Figura 4. Inhibición de Wnt en embriones marcados contra Lamina α5 y contra Fgf8. Representación
del embrión (Joaquin Rodriguez-León) HH20 con inhibición de wnt durante el desarrollo del
crecimiento de las extremidades, presenta marcación en la zona de expresión del gen fgf8.Las 2
imágenes contiguas ,se trata de la ampliación de la extremidad anterior y posterior donde se aprecia
mejor la zona de expresividad del gen fgf8 en la AER. 4.1Embrión de pollo (Joaquin Rodriguez-León)
HH20 con inhibición de wnt y con presencia de marcación por el gen expresado laminina en visión
dorso-ventral.
Por último, resultados similares fueron obtenidos tras colocar el inhibidor de Gremlin en
embriones en estadio HH20+ 20 hs. En este caso, sólo fue posible llevar el estudio en un
embrión marcado contra Fgf8. Gremlin actúa como antagonista de las BMP, y su expresión
tiene un papel fundamental en el mantenimiento del AER y del bucle de retroalimentación del
Fgf-Shh. Por lo tanto, el resultado de su inhibición sería el desarrollo anormal de las
extremidades de los embriones. En nuestro caso, los resultados obtenidos tampoco fueron los
esperados, ya que no pudimos observar ninguna anomalía a nivel del desarrollo de las
extremidades, tal y como debería haber ocurrido (Figura 4).

15. Figura 4. Inhibición de Gremlin en embriones marcados contra Fgf8. Embrión de pollo (Joaquín
Rodriguez-León HH20) con inhibición de Gremlin y marcación del gen expresado fgf8,junto a esta
imagen, una ampliación de las extremidades anterior y posterior.
MATERIALES Y MÉTODOS:
2.1 Aplicabilidad del Modelo aviar a nuestro estudio.
El objetivo de nuestro trabajo era el estudio del desarrollo de las extremidades en embriones
de pollo. Dentro de los modelos de estudios existentes, fue escogido el modelo aviar frente al
modelo de ratón por diversas causas. En primer lugar el modelo aviar es más fácil de utilizar
en la medida en que podemos extraer los embriones sin necesidad de hacerlo directamente
del interior del útero materno, siendo por tanto un método mucho menos invasivo. Por otro
lado la estructura del huevo permite realizar microcirugía en el embrión y posteriormente
seguir con el cultivo normal, cosa que con el modelo del ratón no se podría llevar a cabo.
Otra de las ventajas que tiene este modelo es a nivel molecular, ya que se ha demostrado que
el FGF-10 está involucrado en la formación de las extremidades. Este factor es capaz de
inducirlas de manera ectópica en el embrión de pollo, mientras que el ratón, careciente de
este gen, es incapaz de formarlas.

16. 2.3 Modelo de Hamilton-Hamburguer
El modelo de Hamilton-Hambuerguer es una tabla donde se nos presenta la relación entre el
tiempo de incubación de los huevos y el nivel del desarrollo que presentan los embriones.
Principalmente hay dos factores que influyen en el desarrollo durante la incubación de los
huevos, la temperatura y la humedad. Pero también se ha de tener en cuenta, que habrá
otros factores que influirán en el desarrollo, como factores genéticos, la alimentación de los
reproductores, su estado sanitario etc.
2.4 Proceso de señalización en el desarrollo de las extremidades.
El método utilizado para la marcación del desarrollo de las extremidades de los embriones de
pollo será la hibridación in situ. Esta técnica nos permitirá demostrar los diferentes
mecanismos moleculares que se llevan a cabo durante los diferentes estadios embrionarios.
La hibridación in situ es procedimiento histopatológico basado en la utilización de un
anticuerpo específico, previamente marcado mediante un enlace químico con un enzima
capaz de transformar un substrato en visible, sin afectar a la capacidad del anticuerpo para
formar un complejo con el antígeno aplicado a una muestra de tejido orgánico,
correctamente fijada. Esta técnica es muy útil para la identificación y/o localización de
muestras tisulares o citológicas. En nuestro caso se adicionó el anticuerpo anti-DIG, que es un
esteroide que posee una alta inmunogenicidad, y es un óptimo marcador para las
hibridaciones in situ.
2.5 Embriones de pollo modificados (Joaquin Rodriguez-León HH20)
En este caso, para la preparación de los embriones (I-Wnt y Gremlin) son usadas las mismas
técnicas de extracción quirúrgica que las utilizadas para el resto del trabajo. En este caso
antes de los procesos de preparación y fijación de la muestra, se procederá a la manipulación
de las extremidades de estos embriones mediante la aplicación de perlas de intercambio
iónico con presencia de inhibidor de Wnt e inhibidor de Gremlin.

17. Estas perlas fueron implantadas junto con una esfera de heparina-acrílica y se colocaron en la
extremidad del mesénquima mediante una aguja de tungsteno. Una vez realizado el injerto
en las extremidades de los embriones fueron puestos en período de incubación, y
basándonos en el modelo de “Hamilton-Hamburguer” fueron extraídos definitivamente para
su posterior estudio (12).
CONCLUSIÓN
En nuestro trabajo hemos estudiado algunos de los mecanismos que están íntimamente
involucrados en la formación de las extremidades en embriones de pollo.
En primer lugar, pretendíamos observar si la Laminina α 5 tenía el mismo patrón de expresión
que el factor Fgf8, o bien, si durante las diferentes etapas de la embriogénesis se expresa en
otros partes del embrión, y no sólo en el AER. Los resultados obtenidos en primer lugar
corroboran la idea que previamente se tenía sobre la expresión del Fgf8, siendo el AER su
único lugar de expresión. A su vez, también verificamos que la Laminina α5, quien tiene un
papel fundamental en el desarrollo de las extremidades, no sólo se expresa a nivel de AER tal
y como lo hace el Fgf8, sino que también se puede observar de forma gradual durante los
diferentes estadios a nivel de todo el ectodermo.
En la segunda parte de nuestro estudio, se pretendió observar los efectos que tenían la
inhibición de los factores Wnt y Gremlin en el desarrollo de las extremidades.
La inhibición de Wnt bloquea la expresión de Fgf10, provocando anomalías en el desarrollo de
las extremidades. Nuestros resultados no fueron los esperados ya que obtuvimos en ambos
casos embriones con todas sus extremidades bien desarrolladas. Y además, todos mostraban
una expresión de Laminina α5 y de Fgf8 consistente y propia al desarrollo normal de un
embrión Gallus Gallus Domesticus.
Por último, tal y como sabemos Gremlin juega un papel fundamental en la inducción de la
expresión de Fgf4 y de Wnt, por lo que su inhibición afecta de manera directa al
mantenimiento y posterior desarrollo de las extremidades. Nuevamente los resultados no
fueron los esperados, ya que en lugar de obtener embriones sin extremidades, o con
extremidades anómalas, obtuvimos embriones con un desarrollo normal y con marcaje de
Fgf8 adecuado para su estadio.

18. En estos tres últimos caso podemos relacionar estos fallos en el proceso de inhibición, o bien
a un a un error durante la colocación de las perlas con su respectivo inhibidor o a una baja
concentración del inhibidor, incapaz de producir el efecto esperado.
Bibliografía
1- Fernandez-Teran M, Ros M. (2008). The Apical Ectodermal Ridge:morphological aspects
and signaling pathways. Int.J. Dev.Biol. 52: 857-871.
2- Cohn M, Izpisúa-Belmonte JC, Abud H, Heath J, Tickle C.(1996). Roles for FGF8 in the
Induction, Initiation and Maintenance of Chick Limb Development. Cell 84:127-136.
3-Bénazet JD, Zeller R. (2009). Vertebrate Limb Development: Moving from Classical
Morphogen Gradients to an Integrated 4-Dimensional Patterning System. ColdSpring
Harbor Perspect Biol 1:a001339.
4- Johnson RL and Tabin† CJ.(1997) Molecular Models for Vertebrate Limb Development.
Cell 90: 979-990.
5- Miner JH, Cunningham J , Sanes JR. (1998).Roles for Laminin in Embryogenesis:
Exencephaly, Syndactyly, and Placentopathy in Mice Lacking the Laminina5 Chain.
Cell 6:1713-1723.
6- Durbeej M. (2009) Laminins. Cell Tissue Res 339:259-268.
7- De Arcangelis A, Georges-Labouesse E.(2000). Integrin and ECM functions: roles in
vertebrate development. Trends Genet 16(9):389-95.
8. De Arcangelis A, Mark M, Kreidberg J, Sorokin L, Georges-Labousse E. (1999). Synergistic
activities of a3 and a6 integrins are required during apical ectodermal ridge formation and
organogenesis in the mouse. Development 126:3957-3968.

19. 9- Merino R, Rodriguez-Leon J, Macias D, Gañan Y, Economides A, et al. (1999). The BMP
antagonist Gremlin regulates outgrowth, chondrogenesis and programmed cell death in the
developing limb. Development 126: 5515-5522.
10- Khokha M, Hsu D, Brunet LJ, Dionne M, Harland RM. (2003). Gremlin is the BMP
antagonist required for maintenance of Shh and Fgf signals during limb patterning.Nature
Genetics 34:303 – 307.
11-Abarca-Buis RF, Garciadiego-Cázares D, Chimal-Monroy J.(2006).Mecanismos
Moleculares Que Controlan El Desarrollo De La Extremidad De Los Vertebrados. Tip Revista
Especializada en Ciencias Químico-Biológicas 9:78-89.
12- Rodriguez-leon J, Tavares A T, Ipsúa-Belmonte JC. (2001). Developmental expression of
chick Twist and it’s regulation during limb patterning. Int. J. Dev. Biol. 45: 000-000.
13- Sanes JR. On the Republication of the Hamburger-Hamilton Stages Series. (1992).
Developmental Dynamics 195:229-230.